Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Published: December 12, 2014 doi: 10.3791/52100
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1INSERM, U968, 2Sorbonne Universités, UPMC Paris 06, UMR_S 968, Institut de la Vision, 3CNRS, UMR_7210, 4Department of Biological Sciences, Center for Cancer, Genetic Diseases and Gene Regulation, Fordham University

Abstract

تحليل واحدة من الوظائف الحيوية للشبكية العين الظهارية الصباغ (RPE) خلايا، والبلعمة من قضى شظايا البعيدة هرمة مبصرة شرائح الخارجية (POS) لا يمكن أن يؤديها في المختبر. مبصرة شرائح الخارجي مع أكوام من أقراص غشائي تحتوي على ماكينات phototransduction تتجدد باستمرار في شبكية العين. يتم استبعاد POS أمضى يوميا من قبل خلايا RPE. القوارض، الخنازير / البقري والخلايا RPE الإنسان تعترف POS من مختلف الأنواع بطريقة مماثلة. لتسهيل أداء سلسلة كبيرة من التجارب مع تقلب قليلا، ومخزون كبير من نقاط البيع يمكن عزلها عن عيون الخنزير وتخزينها المجمدة في مأخوذة. هذا البروتوكول يستفيد من خاصية photopigments يتم عرضها على اللون البرتقالي عندما أبقى في الظلام. تحت ضوء أحمر خافت، يتم جمع الشبكية في منطقة عازلة من eyecups افتتح في قطع نصفين. والمتجانس تعليق خلية شبكية العين وتصفيتها وتحميلها على التدرج السكروز المستمر. بعد CENtrifugation، POS تقع في نطاق منفصلة في الجزء العلوي من التدرج الذي يحتوي على لون برتقالي مميز. ثم يتم جمع نقاط البيع، نسج، معلق بالتتابع في مخازن غسل، وعدها aliquoted. POS التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحوصات البلعمة وتحليل تفعيل البروتين، وتوطين أو التفاعل في أوقات مختلفة بعد التحدي POS. بدلا من ذلك، POS يمكن المسمى مع fluorophores، والبريد. ز.، FITC، قبل aliquoting لالكمي مضان لاحق من POS ملزمة أو الغمر. وتشمل التطبيقات الممكنة الأخرى استخدام تعديل POS أو POS التحدي جنبا إلى جنب مع ظروف الإجهاد لدراسة تأثير الإجهاد التأكسدي أو الشيخوخة على خلايا RPE.

Introduction

في شبكية العين، يتم تشغيل الرؤية من خلال المماكبة من الجزيئات حساس يسمى opsins، قبل أن يتم تحويلها إلى إشارة التي يمكن أن تنتقل بين الخلايا العصبية تصل إلى المناطق البصرية في المخ. هي جزء لا يتجزأ هذه الجزيئات في أكوام من الأقراص غشائي تشبه الفطائر التي تشكل أجزاء الجزء الخارجي من خلايا مستقبلة للضوء (PRS). التعرض للالتعرض المستمر للضوء وبالتالي مستويات كبيرة من الإجهاد التأكسدي، المستفيدين الرئيسيين تجديد مستمر فئتها الخارجية للحد من الضرر التأكسدي المحتملين. مبصرة شرائح الخارجي هي على اتصال وثيق مع زغيبات قمية من شبكية العين الصباغ الظهارية (RPE) الخلايا المجاورة. تشكل الخلايا RPE الجزء الخارجي من الجدار الدم في شبكية العين وتضمن العديد من المهام التي تعتبر حاسمة بالنسبة لصحة خلايا مستقبلة للضوء وظيفة 1، مثل التبريد أشعة الضوء عبر أصباغ الميلانين، وإعادة المماكبة للphotoreactive الشبكية المكون أوبسين، وتوفير المواد الغذائية وزrowth العوامل، والمشاركة في التخلص PR الأيض.

وبالإضافة إلى ذلك، والقضاء على الخلايا RPE قضى POS وإعادة تدوير مكوناتها، وهو الاحتلال اليومي الذي ينظمه إيقاع الساعة البيولوجية في شبكية العين الثدييات 2،3. تخليص سقيفة POS ضروري جدا من أجل البقاء PR. عندما يتم إلغاؤها تماما، POS الحطام تتراكم وتتحول المستفيدين الرئيسيين مما تسبب السريع فقدان الرؤية 4،5. في حالة فقدان الملف الشخصى الإيقاعي ويحل محله النشاط المستمر، والعيوب العلاقات العامة وRPE تتراكم مع تقدم العمر 6. ولذلك، فمن المهم جدا أن تميز التنظيم الجزيئي للRPE البلعمة في المختبر من أجل فهم الظواهر مرتبطة الخلل فيها. ومن المثير للاهتمام، والآلات الجزيئية في الخلايا RPE هي مشابهة جدا لتلك المستخدمة من قبل الضامة لمسح الخلايا أفكارك وكلاهما يعتمد على الاعتراف فسفاتيديل تعرض على الحطام أكلة 7-9. لا يزال، والخلايا RPE والضامة تنظم درجة الحموضةagocytosis بشكل مختلف، كما الضامة يختار القضاء الفوري على الخلايا أفكارك في وقت اللقاء في حين أن الخلايا RPE تبتلع بشكل متوازن POS مرة واحدة فقط في اليوم على الرغم من الاتصال بهم الدائم مع شرائح الخارجي. وهذا يشير إلى آليات التنظيم المحددة التي لا تزال غير مفهومة تماما.

وقد تم تحديد العديد من الجزيئات المتورطين في الآلات RPE أكلة أو التحقق من صحتها وذلك بفضل استخدام POS معزولة وثقافة الخلية المقايسات البلعمة. مستقبلات alphavbeta5 إنتغرين تقع في RPE سطح الخلية القمية، وذلك بالتنسيق مع يجند لها مبدعين-E8، يربط خصيصا لPOS 10-12، والتي يتم المنضوية عبر MerTK التيروزين كيناز مستقبلات 13-15. وقد تبين أن زبال مستقبلات CD36 للمشاركة في تناول POS والتأثير سرعته 16،17، ويمكن أن تكون بمثابة جهاز استشعار من الدهون الفوسفاتية أكسدة على السطح POS 18. تدخيل يحتاج تجنيد F-أكتين الهيكل الخلوي الحمارالبروتينات ociated مثل annexin 2 19، الميوسين II 20 وميوسين السابع-أ 21،22. وتستخدم POS الأصلي أو تتأكسد في المختبر أيضا لفهم الظواهر شيخوخة الخلايا RPE في الجسم الحي مرتبطة تراكم سيئة هضمها POS أكسدة 23-28. وقد بدأ جيل من الخلايا RPE المستمدة من الخلايا الجذعية تطبيق جديد لPOS معزولة التي تستخدم لإثبات ظائف الخلايا قبل أن تنقل إلى الحيوانات أو المرضى 29،30،27.

وصف لأول مرة من قبل Molday وزملاؤه في عام 1987 31، وبروتوكول لعزل POS البقري يجمع خطوة تنبيذ فائق من الخليط الشبكية على التدرجات السكروز مستمرة مع ملاحظة ظهور اللون البرتقالي المميز للصباغ متبدل بالضوء في الشبكية غير مقصور (تحمل 11- الشبكية CIS). في السنوات ال 10 الماضية، وذلك بسبب الاحتياطات المتخذة من أجل تقليل خطر مرض جنون البقر، أصبح استخدام عيون الخنزير increasiأبرز ngly. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية الحصول على كميات كبيرة من POS من الخنازير أو عيون البقر التي يمكن aliquoted وتخزينها لفترات طويلة من الزمن. هذا يلغي الحاجة إلى إعداد POS من أعين القوارض، الأمر الذي يتطلب استخدام عدد كبير من الحيوانات في إعداد POS وفحص 32،33،21،22. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إعطاء تفاصيل عن وضع العلامات POS قبل التخزين باستخدام جزيئات الفلورسنت، لتحديد وتصور POS بطريقة مبسطة وقابلة للمقارنة لبعض التطبيقات مقارنة مع وضع العلامات POS بعد الفحص البلعمة 32،10. لذلك، هذه مخزونات كبيرة تسمح للاستنساخ وسهولة الاستخدام في العديد من أنواع مختلفة من التجارب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذه التجربة العزلة POS وقتا طويلا وتتطلب قد تصل إلى 12 ساعة لإكمال إذا وصفت POS قبل التخزين. وقد تم تكييف البروتوكول من ورقة نشرتها RS Molday وزملاؤه في عام 1987 31 و تعديلها من قبل SC Finnemann وزملاؤه في عام 1997 10.

وقد تم التعامل مع الحيوانات وفقا للجمعية للبحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. تم استعراض البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات داروين تشارلز من جامعة بيير وماري كوري-باريس 06 واللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة فوردهام.

1. عامة تعيين لأعلى

  1. الحصول على 80 خنزير أو بقرة عيون جديدة طازجة بمجرد بعد الذبح ممكن والاحتفاظ بها مبردة في الظلام. تقديم الإرشادات لمقدم وبالتالي فإن الشركة تشرع بنفس الطريقة. تم تحسين هذا البروتوكول لمدة 80 العينين. إلىالمضي قدما في المزيد من عيون والحصول على أسهم أكبر (على سبيل المثال، من 160 العينين)، مضاعفة كميات حل وأداء 2 جولات من تنبيذ فائق. عينات تجمع في وقت لاحق في خطوة جمع (راجع الخطوة 2.2.2).
  2. إعداد على مقاعد البدلاء المصباح safelight الأحمر، ومنصات ماصة، وتقضي (الجدول المواد). إعداد أطباق 15 سم وأكياس واقية لجمع النفايات (أجزاء العين غير المستخدمة، زجاجي ...). ارتداء ضيقة labcoat، والقفازات، حماة كم ونظارات واقية.
  3. الاحتياطات:
    1. قبل البرد جميع الحلول ثم الاحتفاظ بها البرد خلال كل الخطوات. إبقاء العينين والتدرجات المبردة على الجليد قدر الإمكان.
    2. إبقاء العينين والأنسجة المشتقة في الظلام قدر الإمكان حتى الخطوة جمع بعد تنبيذ فائق لتجنب photobleaching من الأصباغ البصرية وفقدان اللون البرتقالي الوردي من النموذج النشط من photopigments.

2. تطبيقات بروتوكول

  1. إعداد الحلول والتدرجات:
    1. الأسهم التورين ذوبان الجليد تماما يستخدم حمام الماء 37 درجة مئوية.
    2. إعداد جميع الحلول من الحلول الأسهم (الجدول 1، الحلول المالية) وتخلط جيدا السكروز مع المكونات الأخرى باستخدام محرك مغناطيسي لكل حل.
      1. إعداد 15 مل من محلول تجانس لتركيز النهائي من 20٪ سكروز، تريس 20 ملم pH7.2 خلات، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي الجلوكوز و 5 ملي التورين.
      2. تحضير محلول السكروز 25٪ إلى تركيز النهائي من 25٪ سكروز (باستخدام الأسهم السكروز 70٪)، و 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2، 10 ملي الجلوكوز و 5 ملي التورين.
      3. تحضير محلول السكروز 60٪ إلى تركيز النهائي من 60٪ سكروز (باستخدام مسحوق السكروز)، تريس 20 ملم pH7.2 خلات، الجلوكوز 10 ملم و 5 ملي التورين.
      4. إعداد الحل غسل 1 إلى تركيز النهائي من 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2 و 5 ملي التورين.
      5. إعداد الحل غسل 2إلى تركيز النهائي من 10٪ سكروز، 20 ملي خلات تريس درجة الحموضة 7.2 و 5 ملي التورين.
      6. إعداد الحل غسل 3 إلى تركيز النهائي من 10٪ سكروز، 20 ملي فوسفات الصوديوم الهيدروجيني 7.2 و 5 ملي التورين.
    3. ثابت صانع التدرج على محرك مغناطيسي وإدراج شريط ضجة في الغرفة الأقرب للخروج حيث سيتم إدراج حل 60٪. استخدام قطع P200 طرف الماصة وضعها في الخروج من الأنابيب لتحقيق سرعة الصب المناسبة.
    4. يلقي التدرجات الخطية بدقة عن طريق تمييع واثارة الحل السكروز 60٪ مع 25٪ في واحد باستخدام 12 مل من كل حل (أي مجموع 6 أنابيب لل80 العينين) في أنابيب نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. تحريك تمييع تدريجيا 60٪ محلول السكروز بشكل جيد. ثابت سرعة تدفق التدرج، وسكب الحل بسلاسة وليس بسرعة كبيرة.
      ملاحظة: من أجل الحصول على المستمر، الانحدار الخطي، والحفاظ على افتتاح طرف الماصة الحق على السطح من الحل لالتشكل التدرج بأكملهن.
    5. السماح للالتدرجات الجلوس على الجليد لمدة حوالي 1 ساعة لتحقيق الاستقرار. إبقاء التدرجات المبردة حتى تحميلها. لا يهز أنابيب لمنع الفوضى من التدرج.
  2. جمع الأنسجة:
    1. جمع الأنسجة تحت ضوء أحمر خافت. تأخذ العين في يد واحدة وكزة الجبهة مع حافة شفرة حلاقة في حين الضغط على العين بعيدا (لتجنب الرش، الشكل 1). استخدام شفرة حلاقة لخفض مقلة العين الأمامية إلى 2 نصفين (القرنية بالإضافة إلى 5 مم على الأقل في الصلبة). إزالة العدسة والوجه فنجان العين الداخل الى الخارج بحيث يمكن عقد على مدى غيض من إصبع واحد وبالتالي تعريض شبكية العين.
    2. باستخدام شفرة حلاقة في زاوية، وكشط بلطف شبكية العين، فصل بسهولة وتظهر على شكل طبقة وردي، قبالة سطح بساط وقطع على رأس العصب البصري (الشكل 1). جمع كل شبكية العين في 2 × 50 مل أنابيب تحتوي كل منها على 15 مل من محلول التجانس على الجليد.
    3. وطي الشبكيةgenization:
      1. يهز تعليق بقوة باليد لمدة 2 دقيقة من أجل تعطيل طبقات مختلفة من الخلايا، وكسر POS قبالة بقية الخلية PR، جزء POS والتجانس تعليق شبكية العين.
      2. مرشح 3X من خلال طبقة مزدوجة من الشاش النظيف لإزالة شظايا الأنسجة الكبيرة وجمع من خلال تدفق في نظيفة 50 مل أنابيب (الشكل 1). تعليق الشبكية يجري سميكة جدا، لتعظيم العائد، اضغط بلطف على شاش للافراج عن الأنسجة مجزأة المتبقية بعد كل الترشيح.
  3. مبصرة الخارجي جزء جزء (POS) العزلة:
    1. وضع بلطف شبكية العين الإعدادية الخام، حوالي 6-7 مل لكل أنبوب، أكثر من 6 × 30 مل أنابيب نابذة فائقة السرعة تحتوي كل منها على 24 مل من الطازجة المبردة المستمر 25 - 60٪ السكروز التدرج (الشكل 1). موازنة أنابيب معارضة بما يتناسب مع الدوار لاستخدامها. نابذة فائقة السرعة في 106،000 x ج لمدة 50 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة أكثر من حل فوق الفرقة البرتقالي الوردي في الثلث العلوي من التدرج بواسطة الشفط (الشكل 2A). جمع الفرقة البرتقالي الوردي مع قطع P1000 طرف في كوب. تجاهل الباقي بعد تحييد استخدام التبييض (النفايات البيولوجية).
    2. تمييع مع ~ 4-5 كميات من الجليد الباردة غسل 1 الحل. فصل في العديد من 30 مل أنابيب حسب الحاجة. الطرد المركزي في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية طاف.
    3. الكريات resuspend في 10 مل غسل 2 حل وتدور في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة على النحو المفصل أعلاه. الكريات resuspend في 15 مل غسل 3 وتدور مرة أخرى في 3،000 x ج لمدة 10 دقيقة. الجمع بين الايقاف من عدة الكريات للحد من عدد من الأنابيب اللازمة قبل الطرد المركزي في غسل 2 و 3 اغسل الحلول.
  4. POS aliquoting دون وضع العلامات:
    1. في resuspend POS في 10-20 مل DMEM. Predilute 10 ميكرولتر في 490 DMEM ميكرولتر (01:50) والعد ممدود وكذلك POS هامت فيغرفة الفرز الخلية (الشكل 2B). حساب المحصول والتركيز في جزيئات POS لكل مليلتر.
      ملاحظة: يختلف العائد، وهذا يتوقف في الغالب على سن وسلالة من الخنازير / الأبقار وحجم العينين، على سبيل المثال، التحضير الجيد يتراوح بين 5 - 8 عيون × 10 9 POS من 80 خنزير.
    2. اتخاذ قرار بشأن حجم DMEM النهائي (عادة 10-20 مل)، وإضافة السكروز أن تسفر عن تركيز النهائي من 2.5٪ سكروز.
    3. إعداد aliquots من الحجم المطلوب، على سبيل المثال، 5 × 10 7 نقاط البيع في أنبوب لحجم إعادة تعليق 2 مل لإجراء تجربة 96-جيدا في 40 ميكرولتر / جيد. تدور 1 قسامة لمدة 5 دقائق عند 2،300 x ج في RT وتقييم حجم بيليه. إعداد الأحجام قسامة مختلفة لحجم الطلب المختلفة ونقاط البيع يجب أن لا يتم تجميد وإذابة مرتين.
    4. تجميد مأخوذة POS في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
      ملاحظة: مأخوذة مستقرة لعدة شهور. في أيدينا، الخالي من الملصقات أو المسمى POS يمكن تخزينها لمدة سنة واحدة على الأقل.
  5. وضع العلامات POS وaliquoting:
    ملاحظة: نحن عادة استخدام FITC لتسمية POS لالكمي لفحوصات البلعمة، ولكن يمكن استخدام الأصباغ الأخرى كذلك تبعا للاحتياجات.
    1. في resuspend 1 10 ملغ FITC قارورة في 2.5 ملغ / مل تركيز في 0.1 M نا عازلة كربونات درجة الحموضة 9.5 عن طريق خلط 2.6 مل 0.1 M NaHCO 3 درجة الحموضة 8.4 مع 1.4 مل 0.1 M نا 2 CO 3 درجة الحموضة 11.5 (الجدول 2، الحلول المالية). تناوب لمدة 1 ساعة على RT مع حماية من الضوء وتدور لمدة 5 دقائق على السرعة القصوى لتكوير المواد الصلبة FITC غير معلق.
    2. resuspend الكرية POS في 10 مل من غسل 3 حل (أو DMEM) وإضافة 2 مل من محلول FITC 80 العينين. تخزين FITC بقايا المجمدة في -80 ° C. تدوير للا يقل عن 1.5 ساعة على RT. يحفظ بعيدا عن الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
    3. غسل POS المسمى مرتين باستخدام غسل 3 الحل كما هو موضح في القسم 2.3.4، ثم مرة واحدة أو مرتين في DMEM حتى يكاد لا ينظر مجانا FITC في و طافraction. في resuspend POS في DMEM والمضي قدما على النحو للPOS الخالي من الملصقات لالعد وaliquoting (القسم 2.4).
  6. عن طريق نقاط البيع في التجارب:
    1. POS ذوبان الجليد في RT، والاحتفاظ بها في الظلام قدر الإمكان إذا كانت Fluorescently المسمى. تدور لمدة 5 دقائق عند 2،300 x ج في RT. نضح طاف.
    2. و resuspend فورا في حجم مناسب من حل الفحص وفقا لما تمليه التجربة. في حالة أوقات مختلفة من التحدي POS، معلق متجر POS في RT في الظلام بين نقاط الوقت لعدة ساعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مزيج من الانحدار الخطي السكروز وتنبيذ فائق يسمح للفصل المكونات المختلفة من تعليق الشبكية التي كتبها الكثافة. خلايا الحطام وRPE أكبر الشبكية الثقيلة تغرق أو بالقرب من أسفل التدرج (الشكل 2A). أخف وزنا POS والخلايا الفردية أخف وزنا أو الحطام خلية من الشبكية تهاجر العصابات منفصلة للوصول إلى النصف العلوي من التدرج في نهاية الفترة الطرد المركزي. عن طريق الحفاظ على العينين والعينات في الظلام حتى بعد خطوة الطرد المركزي، والفرقة التي تحتوي على POS يمكن التعرف على الفور من قبل لونه برتقالي مشرق. العرض وشدة هذه الفرقة يعتمد على نوعية الانحدار والارتفاع أنبوب (ويفضل 89 ملم الارتفاع). عادة، عندما معزولة بشكل صحيح POS يجب أن يظهر ممدود، مباشرة أو عازمة عندما لاحظ على شريحة المجهر (الشكل 2B). اعتمادا على متن الطائرة التركيز على المجهر، وأنها يمكن أن تظهر إما الظلام أو لامعة. إن لم يكن resuspended بشكل صحيح، انهم سيبقون في كتل. إذا كانت معطوبة (انظر الفقرة أدناه)، فإنها سوف تظهر القطع كما أصغر بكثير، قليلا مثل خلفية "المغبرة".

المشاكل التي يمكن أن تنشأ في معظمها ذات الصلة إلى ثلاث قضايا. أول قضية الممكنة هي أن الخطوة تهز من الخليط الشبكية ليست قوية بما فيه الكفاية، الأمر الذي يؤدي إلى POS المتبقية تعلق على المستفيدين الرئيسيين بالتالي العائد انخفضت. وترتبط القضية الثانية المحتملة لضعف الصب التدرج أو فقدان الجودة التدرج لضيق الوقت لتحقيق الاستقرار قبل التحميل أو أنبوب المفرط تهتز في أي خطوة قبل المجموعة. في هذه الحالة، يمكن أن العصابات لا يكون حاليا بشكل صحيح وPOS لا يمكن جمعها في أنبوب المقابل. وأخيرا، دعت مشكلة محتملة الثالثة إذا كان الرقم الهيدروجيني من أي من الحلول هو الخطأ: الأغشية POS قد تتفكك وتظهر فقط صغير الحطام POS على المجهر عندما تصور لهم لتقييم العائد.

تنقيته POS يمكنيتم استخدامها لعدد من التطبيقات المختلفة ذات الصلة لدراسة وظيفة الخلايا البلعمية RPE. وعادة ما تستخدم الخلايا RPE كخطوط الخلية أو في الثقافة الأولية من النماذج الحيوانية 32،6،12،18-21. وفي الآونة الأخيرة، والخلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية إعادة برمجة مثل IPSC أو ESC وقد استخدمت 29،30،27،34. POS معزولة تعمل على اختبار مباشر على قدرة الخلايا البلعمية RPE متحولة؛ على سبيل المثال، POS والمبتلعة بسهولة عن طريق الخلايا RPE الأولية من النوع البري الفئران، في حين أن الخلايا من إنتغرين beta5 ومبدعين-E8 الفئران خروج المغلوب يبلعم أقل POS في نفس مقدار الوقت 6،12. ويمكن أن يتم تقدير حجم POS البلعمة إما عن طريق عد FITC المسمى POS يدويا على الصور المجهر 6 (الشكل 3A)، وذلك باستخدام معدات قادرة على قراءة كثافة مضان 10،24،15،35 أو تدفق عداد الكريات بعد خلية trypsinization 36،27. وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تقييم كمية POS وتدهور سن immunoblots بحثها عن opsins 37،38،27.

في الجسم الحي، وعملية امتصاص POS يحدث بالتتابع كما الاعتراف / تسبق ملزمة متزامنة استيعاب 6. يمكن للمراحل مختلفة من امتصاص تميز أيضا في المختبر باستخدام الإجراءات التجريبية المناسبة 39. تجارب نبض مطاردة يمكن القيام بها باستخدام مفتاح درجة الحرارة: POS ملزمة يحدث عند 20 درجة مئوية في حين استيعاب يحتاج إلى درجة حرارة 37 ° C المضي قدما 32،40،7. يوجد هذا التمييز أيضا في الضامة، والتي يمكن التعرف POS وكذلك وفيه الآلية الجزيئية للقضاء على الخلايا أفكارك هي مشابهة جدا لماكينات وRPE في 7. بعد FITC-POS البلعمة، ملزمة واستيعاب يمكن قياسها كميا في عينات منفصلة من قبل التبريد وFITC مضان من POS-ملزمة السطح خلال مرحلة ما قبل الحضانة مع الأزرق التريبان قبل تحديد الخلايا 10. في الخلايا الزرقاء المعالجة التريبان، المتدرب الوحيدسيتم تصور آل POS، وPOS ملزمة يمكن قياسها كميا عن طريق طرح POS الداخلي من إجمالي تعداد POS مضان. عندما يتم تقييم البلعمة على immunoblots تم الحصول عليها باستخدام لست] جمعت بعد التحدي POS، وعلاج ما يعادلها مع EDTA قبل تحلل تسمح مفرزة من POS ملزمة على سطح الخلية لالداخلية مقابل إجمالي POS مقارنة البلعمة 37،38.

تم إحراز تقدم هائل في تحديد آلية أكلة بفضل التجارب توظيف POS المنقى. ويمكن تقييم التوظيف البروتين عن طريق فحوصات المناعي شارك في توطين 13-15،19-21،37،41 (الشكل 3B). التوظيف البروتين أو تفعيل يمكن التحقق من صحة على immunoblots بعد مناعي أو عن طريق التحقق من الفسفرة 7،10،12-15،17،19،20،27،35،37،41 (الشكل 3C). المزيد من الدراسات انتهت المفتوحة على التغيرات الشاملة التعبير الجيني بعد أوقات مختلفة من التحدي POS لهايسوتو تم تنفيذ 42.

ويمكن أيضا POS معزولة استخدامها لدراسة القضاء POS من الخلايا RPE. في الواقع، خلال الشيخوخة الطبيعية و / أو عندما لا يتم هضمها POS بشكل صحيح، ومنتجات تدهور POS تتراكم تدريجيا ودائع يبوفوسين ويمكن أن تؤدي إلى أمراض بسبب آليات الأكسدة 24،27. وبالتالي، فهم تأثيرات الضوء والضرر التأكسدي ذات الصلة قد تتطلب التحدي POS الخلايا RPE 18،26. وأخيرا، كرر تغذية طبيعية مع 27 أو المؤكسد 25،28 POS يمكن استخدامها لإحداث تأثيرات المتراكمة في الخلايا RPE في الثقافة من أجل فهم الآليات المرضية التي تتطور في الجسم الحي على مدى فترات أطول من الوقت.

الشكل (1)
الشكل 1. الشبكية بمعزل عن أعين الخنازير. رسم تبين خطوات مختلفة من تشريح العين من أجللجمع والتجانس شبكية العين قبل خطوة تنبيذ فائق على التدرجات السكروز مستمرة، بدءا أعلى اليسار. ويستخدم 60 مم شفرة واسعة لخفض بالتتابع العين على جانب واحد ثم الآخر من أجل أن تكون قادرة على امتداد عليه من الداخل إلى الخارج على طرف الإصبع، مما يعرض شبكية العين. وبعد ذلك، يتم جمع شبكية العين عن طريق التخلص من وبساط مع شفرة. ثم يتم هز الشبكية المجمعة بدقة في المخزن التجانس، تصفية 3 مرات خلال طبقات مزدوجة من الشاش وسكب بدقة على رأس الخطي 25 - 60٪ التدرج السكروز.

الشكل 2
الشكل 2. POS تنقية من أعين الخنازير (A) صورة من مختلف طبقات لوحظ على 25 - التدرج السكروز 60٪ بعد تنبيذ فائق من الخليط شبكية العين. الفرقة البرتقال يناظر POS التي يتعين جمعها. البيضاء يتوافق الشريط العلويإلى المواد غير POS ذات الصلة، فضلا عن الحطام أكبر المهاجرة بالقرب أو في الجزء السفلي من الأنبوب. (ب) صورة POS معزولة كما لوحظ على المجهر حقل مشرق على خلية العد لتقييم العائد. POS موجودة في ممدود (أ، أ "، ج، د) وهامت (أ، أ" أشكال، د، ب، ب '). بعض POS ممدود يمكن عرض أقصى ملفوف (ج). عند تغيير الطائرة من التركيز، والتحولات ظهور POS من لامعة إلى الظلام (مقارنة و 'وباء وب'). ويوضح لوحة البريد POS التي لم يتم معلق بشكل صحيح ويقيمون في كتل. لوحة و معارض POS التي تضررت وليست صالحة للاستعمال، فقط قطع صغيرة قابلة للكشف. توسيع نطاق 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
تينلدى عودتهم 3. تحليل البلعمة RPE باستخدام POS المنقى. (A) الصورة المجهر متحد البؤر وتقدير المقابلة لعدد من phagosomes في زنزانة مع الوقت تبين أن FITC المسمى POS (الأخضر) تم أقل المبتلعة من قبل خلايا RPE الأولية معزولة عن beta5 إنتغرين خروج المغلوب (β5 - / -) مقارنة البرية من نوع الفئران (WT أو β5 + / +) السيطرة على النحو المشار إليه. وصفت نوى (أحمر) باستخدام دابي وتقاطعات الخلية (الأزرق) باستخدام تقاطع علامة ضيقة ZO-1. على نطاق ويمنع 10 ميكرون. . مستنسخة من © Nandrot وآخرون، 2004، نشرت أصلا في مجلة الطب التجريبي 200 (12): 1539-1545. (B) صور المجهر متحد البؤر تظهر شارك في التعريب (الأصفر والبنفسجي، لوحة اليمنى السفلى) بين β5-GFP البروتينات الانصهار (الأخضر، أعلى اللوحة اليسرى)، αvβ5 سطح إنتغرين مستقبلات (الأحمر وأعلى اللوحة اليمنى) ونقاط البيع (الأزرق والقاعاللوحة اليسرى). مقياس شريط 10 ميكرون. . مستنسخة من Nandrot وآخرون، 2012، نشرت أصلا في علم الأحياء من خلية 104 (6): 326-341، © بورتلاند صحافة المحدودة. (C) Immunoblots (WB) والمقابلة الكمي (quantif.) تبين أن التحدي POS (POS) يزيد الفسفرة من FAK على بقايا Tyr397 بالمقارنة دون علاج (/) أو تحدى مع المتوسط ​​وحده (م) التحكم في الخلايا (ج) في حين أن الخلايا إبداء شكل غير نشط من FAK (F) لا تتفاعل، كما هو مبين. مستنسخة من Finnemann 2003، نشرت أصلا في مجلة EMBO 22 (16): 4143-4154 يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Name Company Catalog Number Comments
Specific Material/Equipment
2 Chamber gradient maker Gradient maker with 30 ml chambers
3 mm diameter silicone tubing tubing for gradient casting
Small size magnetic stir bar Stir bar fitting the gradient maker chamber
Red safelight lamp Inactinic lamp for dissection in the dark
Ultra Clear 25 x 89 cm tubes Beckman 344058 Ultracentrifugation tubes
PP Oak Ridge tubes Nalgene 3119-0050 30 ml centrifugation tubes
Optima LE-80K Beckman Coulter 365668 Ultracentrifuge
SW 32Ti swing rotor Beckman Coulter 369694 Swing rotor for ultracentrifuge
Avanti J-26 XP Beckman Coulter 393124 Centrifuge
JA-25.50 rotor Beckman Coulter 363058 Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge
FITC Isomer I Life Technologies F-1906 Fluorescent dye
Other Material/Equipment
Counting chamber (such as Neubauer or Malassez)
Dark ice buckets with lids
Scales
Magnetic stirrer and upholding pole
Refrigated microcentrifuge
37 °C water bath
-80 °C freezer
Consumables
Labcoat Health and safety
Gloves
Sleeve protectors
Goggles
Absorbent pads
Biohazard trash bags and bins
Weck-Prep blades Dissection 60 mm/2.25 inch wide razor blades
15 cm plastic dish
Sterile gauze sheets
15 and 50 ml tubes Common consumables
Microtubes
Aluminum foil

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Young, R. W., Bok, D. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process. J. Cell Biol. 42 (2), 392-403 (1969).
  3. LaVail, M. M. Rod outer segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science. 194 (4269), 1071-1074 (1976).
  4. Mullen, R. J., LaVail, M. M. Inherited retinal dystrophy: primary defect in pigment epithelium determined with experimental rat chimeras. Science. 192 (4241), 799-801 (1976).
  5. Nandrot, E., et al. Homozygous deletion in the coding sequence of the c-mer gene in RCS rats unravels general mechanisms of physiological cell adhesion and apoptosis. Neurobiol. Dis. 7 (6 pt B), 586-599 (2000).
  6. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. J. Exp. Med. Nandrot, E. F., Kim, Y., Brodie, S. E., Huang, X., Sheppard, D., Finnemann, S. C. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  7. Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Macrophage and retinal pigment epithelium phagocytosis: apoptotic cells and photoreceptors compete for alphavbeta3 and alphavbeta5 integrins, and protein kinase C regulates alphavbeta5 binding and cytoskeletal linkage. J. Exp. Med. 190 (6), 861-874 (1999).
  8. Savill, J., Dransfield, I., Hogg, N., Haslett, C. Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis. Nature. 343 (6254), 170-173 (1990).
  9. Ruggiero, L., Connor, M. P., Chen, J., Langen, R., Diurnal Finnemann, S. C. localized exposure of phosphatidylserine by rod outer segment tips in wild-type but not Itgb5-/- or Mfge8-/- mouse retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8145-8148 (2012).
  10. Finnemann, S. C., Bonilha, V. L., Marmorstein, A. D., Rodriguez-Boulan, E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alphavbeta5 integrin for binding but not for internalization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12932-12937 (1997).
  11. Lin, H., Clegg, D. O. Integrin alphavbeta5 participates in the binding of photoreceptor rod outer segments during phagocytosis by cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39 (9), 1703-1712 (1998).
  12. Nandrot, E. F., Anand, M., Almeida, D., Atabai, K., Sheppard, D., Finnemann, S. C. Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (29), 12005-12010 (2007).
  13. Feng, W., Yasumura, D., Matthes, M. T., LaVail, M. M., Vollrath, D. Mertk triggers uptake of photoreceptor outer segments during phagocytosis by cultured retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (19), 17016-17022 (2002).
  14. Finnemann, S. C. Focal adhesion kinase signaling promotes phagocytosis of integrin-bound photoreceptors. EMBO J. 22 (16), 4143-4154 (2003).
  15. Nandrot, E. F., Silva, K. E., Scelfo, C., Finnemann, S. C. Retinal pigment epithelial cells use a MerTK-dependent mechanism to limit the phagocytic particle binding activity of αvβ5 integrin. Biol. Cell. 104 (6), 326-341 (2012).
  16. Ryeom, S. W., Sparrow, J. R., Silverstein, R. L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium. J. Cell Sci. 109 (2), 387-395 (1996).
  17. Finnemann, S. C., Silverstein, R. L. Differential roles of CD36 and alphavbeta5 integrin in photoreceptor phagocytosis by the retinal pigment epithelium. J. Exp. Med. 194 (9), 1289-1298 (2001).
  18. Sun, M., et al. Light-induced oxidation of photoreceptor outer segment phospholipids generates ligands for CD36-mediated phagocytosis by retinal pigment epithelium: a potential mechanism for modulating outer segment phagocytosis under oxidant stress conditions. J. Biol. Chem. 281 (7), 4222-4230 (2006).
  19. Law, A. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Mol. Biol. Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  20. Strick, D. J., Feng, W., Vollrath, D. Mertk drives myosin II redistribution during retinal pigment epithelial phagocytosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (5), 2427-2435 (2009).
  21. Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6481-6486 (2003).
  22. Gibbs, D., Diemer, T., Khanobdee, K., Hu, J., Bok, D., Williams, D. S. Function of MYO7A in the human RPE and the validity of shaker1 mice as a model for Usher syndrome 1B. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51 (2), 1130-1135 (2010).
  23. Kennedy, C. J., Rakoczy, P. E., Constable, I. J. Lipofuscin of the retinal pigment epithelium: a review. Eye (Lond.). 9 (Pt 6), 763-771 (1995).
  24. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  25. Sugano, E., Tomita, H., Ishiguro, S., Isago, H., Tamai, M. Nitric oxide-induced accumulation of lipofuscin-like materials is caused by inhibition of cathepsin. S. Curr. Eye Res. 31 (7-8), 607-616 (2006).
  26. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  27. Singh, R., et al. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Invest. Ophthalmol. Vis Sci. 54 (10), 6767-6778 (2013).
  28. Lei, L., Tzekov, R., McDowell, J. H., Smith, W. C., Tang, S., Kaushal, S. Formation of lipofuscin-like material in the RPE Cell by different components of rod outer segments. Exp. Eye Res. 112, 57-67 (2013).
  29. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), 8152 (2009).
  30. Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells reveal early developmental molecular correlates with a probable Leber congenital amaurosis type I. Cell. Reprogram. 15 (3), 233-246 (2013).
  31. Molday, R. S., Hicks, D., Peripherin Molday, L. A rim-specific membrane protein of rod outer segment discs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 28 (1), 50-61 (1987).
  32. Chaitin, M. H., Hall, M. O. Defective ingestion of rod outer segments by cultured dystrophic rat pigment epithelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (7), 812-820 (1983).
  33. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  34. Carr, A. J., et al. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15, 283-295 (2009).
  35. Dun, Y., Vargas, J., Brot, N., Finnemann, S. C. Independent roles of methionine sulfoxide reductase A in mitochondrial ATP synthesis and as antioxidant in retinal pigment epithelial cells. Free Radic. Biol. Med. 65, 1340-1351 (2013).
  36. Xu, Y. T., Wang, Y., Chen, P., Xu, H. F. Age-related maculopathy susceptibility 2 participates in the phagocytosis functions of the retinal pigment epithelium. Int. J. Ophthalmol. 5 (2), 125-132 (2012).
  37. Mao, Y., Finnemann, S. C. Essential diurnal Rac1 activation during retinal phagocytosis requires αvβ5 integrin but not tyrosine kinases focal adhesion kinase or Mer tyrosine kinase. Mol. Biol. Cell. 23 (6), 1104-1114 (2013).
  38. Mao, Y., Finnemann, S. C. Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture. Methods Mol. Biol. 935, 285-295 (2013).
  39. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  40. Hall, M. O., Abrams, T. Kinetic studies of rod outer segment binding and ingestion by cultured rat RPE cells. Exp. Eye Res. 45 (6), 907-922 (1987).
  41. Bulloj, A., Duan, W., Finnemann, S. C. PI 3-kinase independent role for AKT in F-actin regulation during outer segment phagocytosis by RPE cells. Exp. Eye Res. 113, 9-18 (2013).
  42. Chowers, I., et al. Changes in retinal pigment epithelial gene expression induced by rod outer segment uptake. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (7), 2098-2106 (2004).
  43. Edwards, R. B., Szamier, R. B. Defective phagocytosis of isolated rod outer segments by RCS rat retinal pigment epithelium in culture. Science. 197 (4307), 1001-1003 (1977).
  44. Philp, N. J., Bernstein, M. H. Phagocytosis by retinal pigment epithelium explants in culture. Exp. Eye Res. 33 (1), 47-53 (1981).
  45. Burstyn-Cohen, T., Lew, E. D., Través, P. G., Burrola, P. G., Hash, J. C., Lemke, G. Genetic dissection of TAM receptor-ligand interaction in retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Neuron. 76 (6), 1123-1132 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 94، شبكية العين، مبصرة، الجزء الخارجي، والتدرج السكروز، وتنقية، تنبيذ فائق، البلعمة الفحص، الصباغ الشبكية ظهارة
واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parinot, C., Rieu, Q., Chatagnon,… More

Parinot, C., Rieu, Q., Chatagnon, J., Finnemann, S. C., Nandrot, E. F. Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (94), e52100, doi:10.3791/52100 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter