Abstract
Análisis de una de las funciones vitales de las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), la fagocitosis de gastados fragmentos distales de edad de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se puede realizar in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos con pilas de discos membranosas que contienen la maquinaria fototransducción se renuevan de forma continua en la retina. POS gastados se eliminan diariamente por células del RPE. Roedor, porcino / bovino y células del RPE humanos reconocen POS de diversas especies de una manera similar. Para facilitar la realización de grandes series de experimentos con poca variabilidad, con un amplio stock de POS puede aislarse de ojos porcinos y se almacena congelado en alícuotas. Este protocolo se aprovecha de la característica de fotopigmentos que muestran un color anaranjado cuando se mantienen en la oscuridad. Bajo una luz roja tenue, retinas se recogen en un buffer de ojeras abiertas cortadas en mitades. La suspensión de células de la retina se homogeneiza, se filtró y se cargó en un gradiente de sacarosa continuo. Después centrifugation, POS se encuentran en una banda discreta en la parte superior del gradiente que tiene un color naranja característico. POS se recogen, hilar, volvieron a suspender de forma secuencial en tampones de lavado, se contaron y se dividen en partes alícuotas. POS obtenidos de esta manera se pueden utilizar para ensayos de fagocitosis y análisis de activación de la proteína, la localización o la interacción en diversos momentos después de la exposición POS. Alternativamente, POS puede marcarse con fluoróforos, e. G., FITC, antes de alícuotas para la posterior cuantificación de fluorescencia de POS de unión o inmersión. Otras posibles aplicaciones incluyen el uso de desafío POS POS modificado o combinado con condiciones de estrés para estudiar el efecto del estrés oxidativo o envejecimiento en las células RPE.
Introduction
En la retina, la visión se activa por isomerización de moléculas fotosensibles llamadas opsinas, antes de ser transformada en una señal que puede ser transmitida entre las neuronas hasta las áreas visuales del cerebro. Estas moléculas están incrustados en las pilas de discos membranosos asemejan panqueques que constituyen las porciones de segmentos externos de las células fotorreceptoras (RP). Ser sometido a la exposición constante a la luz y por lo tanto los niveles considerables de estrés oxidativo, RP renovar continuamente sus segmentos externos para limitar el daño oxidativo potencial. Segmentos externos de los fotorreceptores están en estrecho contacto con microvellosidades apicales de las células vecinas del epitelio pigmentario de la retina (RPE). RPE células constituyen la parte exterior de la barrera hemato-retiniana y aseguran numerosas tareas que son cruciales para la salud y la función de los fotorreceptores 1, tales como apagar los rayos de luz a través de pigmentos de melanina, re-isomerización de la retina componente opsina fotoreactivo, proporcionando nutrientes y grecimiento factores, participando en disposición PR metabolito.
Además, las células RPE eliminan pasaron POS y reciclan sus componentes, una ocupación diaria que está regulado por el ritmo circadiano en la retina de mamíferos 2,3. El aclaramiento de cobertizo POS es absolutamente necesario para la supervivencia de relaciones públicas. Cuando esté completamente abrogada, POS se acumulan escombros y RP degeneran causando una rápida 4,5 pérdida de visión. Si el perfil rítmico se pierde y se sustituye por una actividad constante, PR y RPE defectos se acumulan con la edad 6. Por lo tanto, es muy importante para caracterizar la regulación molecular de la fagocitosis RPE in vitro con el fin de entender fenotipos vinculados a su disfunción. Curiosamente, la maquinaria molecular en las células RPE es muy similar a la utilizada por los macrófagos para eliminar las células apoptóticas y ambos son dependientes de reconocimiento de fosfatidilserina expuesta sobre los desechos fagocítica 7-9. Sin embargo, las células RPE y macrófagos regular el pHagocytosis diferente, como macrófagos optan por la eliminación inmediata de las células apoptóticas en tiempo de encuentro, mientras que las células del EPR rítmicamente engullir POS sólo una vez al día a pesar de su permanente contacto con los segmentos externos. Esto sugiere mecanismos de regulación específicos que aún no se entienden completamente.
Muchas de las moléculas implicadas en la maquinaria fagocítica RPE han sido identificados o validado gracias a la utilización de POS aislado y ensayos de fagocitosis de cultivo celular. El receptor de la integrina alphavbeta5 situado en la superficie celular apical RPE, en coordinación con su ligando MFG-E8, se une específicamente a POS 10-12, que luego se internaliza a través del receptor quinasa de tirosina MerTK 13-15. El receptor scavenger CD36 se ha demostrado que participar en la ingesta de POS e influir en su velocidad de 16,17, y puede servir como un sensor de fosfolípidos oxidados en la superficie POS 18. Internalización necesita la contratación de F-actina del citoesqueleto-culoociated proteínas tales como la anexina 2 19, miosina II 20 y la miosina VIIA 21,22. POS o nativa oxidada in vitro también se utilizan para entender el envejecimiento de fenotipos de células del EPR en vivo vinculados a la acumulación de mal digerido POS oxidado 23-28. La generación de células del EPR derivadas de células madre ha iniciado una nueva aplicación para el aislado POS que se utilizan para probar la funcionalidad de las células antes de que se trasplantan a animales o pacientes 29,30,27.
En primer lugar se describe por Molday y sus colegas en 1987 31, el protocolo para el aislamiento de POS bovina combina una etapa de ultracentrifugación de los homogeneizados de la retina en gradientes de sacarosa continuas con la observación del aspecto de color naranja característico de fotopigmento retinal crudos (llevar 11- cis retinal). En los últimos 10 años, debido a las precauciones tomadas para minimizar el riesgo de la enfermedad de las vacas locas, el uso de ojos porcinos se ha convertido en increasingly prominente. El protocolo descrito aquí muestra cómo obtener grandes cantidades de POS de porcino o de los ojos de la especie bovina que se pueden alícuotas y se almacenan durante periodos prolongados de tiempo. Esto elimina la necesidad de preparar POS de los ojos de roedores, que requiere el uso de un gran número de animales por la preparación y ensayo de POS 32,33,21,22. Además, se dan detalles sobre el etiquetado POS antes de su almacenamiento utilizando moléculas fluorescentes, para cuantificar y visualizar POS de una manera simplificada y comparable para algunas aplicaciones en comparación con POS etiquetado después de que el ensayo de la fagocitosis de 32,10. Por lo tanto, estas grandes stocks permiten reproducibilidad y facilidad de uso en muchos tipos diferentes de experimentos.
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Protocol
Este aislamiento experimento POS es mucho tiempo y puede requerir hasta 12 horas para completar si POS están etiquetados antes de su almacenamiento. El protocolo ha sido adaptado de un artículo publicado por RS Molday y sus colegas en 1987 31 y modificado por SC Finnemann y sus colegas en 1997 10.
Los animales fueron manejados de acuerdo a la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Charles Darwin Pierre y Marie Curie de París-06 y el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Fordham.
1. Configuración General
- Obtener 80 frescos de cerdo o vaca ojos tan frescos, tan pronto después de la matanza como sea posible y mantenerlos refrigerados en la oscuridad. Proporcionar instrucciones al proveedor para que la empresa procede de la misma manera. Este protocolo está optimizado para 80 ojos. Aproceder con más ojos y obtener las reservas más grandes (por ejemplo, desde 160 ojos), el doble de las cantidades de solución y realizar 2 rondas de ultracentrifugación; muestras de la piscina después en la etapa de recolección (ver paso 2.2.2).
- Establecer en el banco de la lámpara de luz de seguridad roja, almohadillas absorbentes, trapos (tabla Materiales). Preparar 15 cm de platos y bolsas de bioseguridad para la recogida de residuos (las partes del ojo no utilizado, vítreos ...). Use bata ajustada, guantes, protectores de mangas y gafas.
- Precauciones:
- Pre-enfriar todas las soluciones luego mantenerlos fríos durante todos los pasos. Mantener los ojos y los gradientes enfrió en hielo tanto como sea posible.
- Mantener los ojos y tejidos derivados en la oscuridad tanto como sea posible hasta que la etapa de recogida después de la ultracentrifugación para evitar photobleaching de pigmentos visuales y la pérdida de la color naranja-rosa de la forma activa de los fotopigmentos.
2. Protocolo de acciones
- Preparar soluciones y gradientes:
- Taurina deshielo stock completamente utilizando un baño de agua a 37 ° C.
- Preparar todas las soluciones de soluciones madre (Tabla 1, las soluciones madre) y mezclar bien la sacarosa con otros ingredientes usando un agitador magnético para cada solución.
- Preparar 15 ml de la solución de homogeneización a una concentración final de 20% de sacarosa, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM MgCl2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina.
- Preparar la solución de sacarosa al 25% a una concentración final de 25% de sacarosa (usando 70% stock sacarosa), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glucosa y 5 mM de taurina.
- Preparar la solución de sacarosa al 60% a una concentración final de 60% de sacarosa (usando polvo de sacarosa), 20 mM de Tris pH 7,2 etilo, glucosa 10 mM y 5 mM de taurina.
- Preparar la solución de lavado 1 a una concentración final de 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina.
- Prepare la solución de lavado 2a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de acetato de tris pH 7,2 y 5 mM de taurina.
- Preparar la solución de lavado 3 a una concentración final de 10% de sacarosa, 20 mM de fosfato de sodio pH 7,2 taurina y 5 mM.
- Estabilizar el fabricante de gradiente en un agitador magnético e insertar una barra de agitación en la cámara más cercana a la salida donde se insertará la solución al 60%. Utilice una punta de pipeta P200 de corte colocado en la salida de la tubería para lograr velocidad de colada adecuada.
- Reparto de degradados lineales delicadamente diluyendo y agitando la solución de sacarosa al 60% con el 25% uno usando 12 ml de cada solución (es decir, un total de 6 tubos de 80 ojos) en tubos de ultracentrífuga pre-enfriados. Agitar la solución gradualmente-diluyendo sacarosa 60% también. Estabilizar la velocidad del flujo de gradiente, vertiendo la solución de problemas y no demasiado rápido.
NOTA: A fin de obtener un gradiente continuo, lineal, mantenga la abertura de la punta de la pipeta a la derecha en la superficie de la solución para toda la formatio gradienten. - Deje que los gradientes se sientan en hielo durante alrededor de 1 hora para la estabilización. Mantenga los gradientes de temperatura hasta cargado. No agite los tubos para evitar la interrupción de la pendiente.
- Colección de tejidos:
- Recoge los tejidos bajo la luz roja tenue. Tome un ojo en una mano y empuje la parte delantera con el borde de la hoja de afeitar mientras sostiene el ojo lejos (para evitar salpicaduras; Figura 1). Utilice la hoja de afeitar para cortar el globo ocular anterior en 2 mitades (córnea, además de al menos 5 mm en la esclerótica). Retire el objetivo y voltear la ojera adentro hacia afuera de modo que se hace sobre la punta de un dedo exponiendo así a la retina.
- Uso de la hoja de afeitar en un ángulo, raspar suavemente la retina, desprendimiento fácil y que aparece como una capa de color rosado, fuera de la superficie tapetum y cortes en la cabeza del nervio óptico (Figura 1). Recoge todas las retinas en 2 x 50 ml tubos que contienen cada uno 15 ml de solución de homogeneización en hielo.
- Homo Retinahomoge-:
- Agitar la suspensión vigorosamente a mano durante 2 min con el fin de interrumpir las diferentes capas de células, romper POS fuera el resto de la célula PR, fragmento de POS y homogeneizar la suspensión retina.
- Filtro 3x a través de una doble capa de gasa limpia para eliminar fragmentos de tejido grandes y recoger el flujo a través de limpias tubos de 50 ml (Figura 1). La suspensión de la retina de ser bastante grueso, para maximizar el rendimiento, presione suavemente sobre la gasa para liberar los tejidos restantes fragmentados después de cada filtración.
- Fotorreceptor exterior fragmento segmento (POS) Aislamiento:
- Coloque con cuidado la preparación retina crudo, alrededor de 6-7 ml por tubo, más de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga conteniendo cada uno 24 ml de frío continuo fresca 25 - gradiente de sacarosa al 60% (Figura 1). Equilibre los tubos opuestas que sean procedentes para el rotor que se utilizará. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. Eliminar la mayor parte de la solución encima de la banda de color naranja-rosa en el tercio superior del gradiente por aspiración (Figura 2A). Recoger la banda de color naranja-rosa con una punta P1000 de corte en un vaso. Deseche el resto después de neutralizar el uso de cloro (residuos biológicos).
- Diluir con ~ 4 - 5 volúmenes de helado Wash 1 solución. Separar en tantos tubos de 30 ml, según sea necesario. Centrifugar a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Elimine con cuidado el sobrenadante.
- Pellets de resuspender en 10 ml lavado 2 solución y centrifugado a 3000 xg durante 10 min como se detalló anteriormente. Bolitas Resuspender en 15 ml de lavado 3 y girar de nuevo a 3.000 g durante 10 min. Combinar suspensiones de varias bolitas para reducir el número de tubos necesarios antes de la centrifugación en Wash 2 y 3 Lave soluciones.
- POS alicuotear sin etiquetado:
- Resuspender POS en 10-20 ml de DMEM. Prediluya 10 l en 490 l DMEM (1:50) y el recuento alargado, así como POS giró en uncámara de recuento de células (Figura 2B). Calcular el rendimiento y la concentración en partículas POS por ml.
NOTA: El rendimiento varía, dependiendo principalmente de la edad y cepa de cerdos / vacas y el tamaño de los ojos, por ejemplo, una buena preparación varía de 5 - 8 x 10 ojos 9 POS de 80 cerdos. - Decidir sobre el volumen de DMEM final (típicamente 10 a 20 ml) y se añade sacarosa para producir una concentración final de 2,5% de sacarosa.
- Preparar alícuotas del tamaño deseado, por ejemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para un volumen de resuspensión 2 ml para un experimento de 96 pocillos a 40 l / pocillo. Tirada 1 alícuota durante 5 min a 2300 xg a TA y evaluar el tamaño del pellet. Preparar alícuotas diferentes tamaños para diferentes volúmenes de aplicación como POS NO debe congelarse y descongelarse dos veces.
- Congele alícuotas POS a -80 ° C hasta su uso posterior.
NOTA: Las alícuotas son estables durante muchos meses. En nuestras manos, no marcado o etiquetado POS se puede almacenar durante al menos un año.
- Resuspender POS en 10-20 ml de DMEM. Prediluya 10 l en 490 l DMEM (1:50) y el recuento alargado, así como POS giró en uncámara de recuento de células (Figura 2B). Calcular el rendimiento y la concentración en partículas POS por ml.
- Etiquetado POS y alícuotas:
NOTA: normalmente utilizamos FITC para etiquetar POS para la cuantificación de ensayos de fagocitosis, pero otros colorantes se pueden usar también en función de las necesidades.- Resuspender 1 10 mg vial FITC a una / ml de concentración 2,5 mg en 0,1 M tampón de carbonato de Na pH 9,5 mediante la mezcla de 2,6 ml 0,1 M de NaHCO3 pH 8,4 con 1,4 ml 0,1 M Na 2 CO 3 pH 11,5 (tabla 2, las soluciones de archivo). Girar durante 1 hora a RT mientras se protege de la luz y de centrifugado durante 5 min a velocidad máxima para sedimentar los sólidos FITC no resuspendidas.
- Resuspender el precipitado POS en 10 ml de Wash 3 solución (o DMEM) y añadir 2 ml de solución de FITC durante 80 ojos. Guarde las sobras FITC congelado a -80 ° C. Rotar durante al menos 1,5 horas a RT. Proteger de la luz utilizando papel de aluminio.
- Lave POS marcado dos veces utilizando Wash solución 3 como se describe en la sección 2.3.4, a continuación, una o dos veces en DMEM hasta que casi no FITC libre se ve en el sobrenadante fraction. Resuspender POS en DMEM y proceda como para POS sin etiqueta para contar y alícuotas (sección 2.4).
- Uso de POS en los experimentos:
- POS Descongelar a temperatura ambiente, y mantenerlos en la oscuridad tanto como sea posible si están etiquetados con fluorescencia. Haga girar durante 5 minutos a 2300 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
- Inmediatamente resuspender en volumen apropiado de solución de ensayo según lo dictado por el experimento. En caso de diferentes tiempos de desafío POS, POS tienda volvió a suspender a TA en la oscuridad entre los puntos de tiempo durante varias horas.
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Representative Results
La combinación del gradiente de sacarosa lineal y la ultracentrifugación permite la separación de los diferentes componentes de la suspensión de la retina por la densidad. Células de escombros y RPE más grande de la retina pesados se hunden en o cerca de la parte inferior del gradiente (Figura 2A). Encendedor POS y las células individuales más ligeros o restos de células de la retina migran como bandas separadas para llegar a la media parte superior del gradiente por el final del período de centrifugación. Al mantener los ojos y las muestras en la oscuridad hasta después de la etapa de centrifugación, la banda que contiene POS puede ser reconocido inmediatamente por su brillante color naranja. El ancho y la intensidad de esta banda depende de la calidad de gradiente y la altura del tubo (se prefiere 89 mm de altura). Típicamente, cuando se aíslan adecuadamente POS debe aparecer alargada, recta o doblada cuando se observa en un portaobjetos de microscopio (Figura 2B). Dependiendo del plano de enfoque en el microscopio, pueden aparecer ya sea oscuro o brillante. Si no Resuspendidos correctamente, se quedarán en grupos. Si están dañados (véase el párrafo siguiente), aparecerán como piezas mucho más pequeñas, un poco como un fondo 'polvo'.
Problemas que pueden surgir son en su mayoría relacionados con tres temas. El primer problema posible es que el paso de agitación de los homogeneizados de la retina no es lo suficientemente vigorosa, lo que conduce a POS que permanezcan unidas a los RP por lo tanto a la disminución de rendimiento. El segundo problema posible se vincula a la mala fundición gradiente o pérdida de calidad gradiente de tiempo de estabilización insuficiente antes de cargar o tubo excesiva agitación a cualquier paso antes de la colección. En este caso, las bandas no pueden ser distinguido y POS no pueden ser recogidos en el tubo correspondiente. Por último, el tercer problema potencial surge si el pH de cualquiera de las soluciones es incorrecto: membranas POS puede desintegrarse y sólo pequeños desechos POS aparece en el microscopio cuando visualizarlos para la evaluación del rendimiento.
Purificada POS puedeser utilizado para un número de diferentes aplicaciones relacionadas con el estudio de la función fagocítica de las células del RPE. Células del RPE se utilizan generalmente como líneas celulares o en cultivo primario de modelos animales 32,6,12,18-21. Más recientemente, las células de RPE derivadas de células madre reprogramadas como IPSC o ESC se han utilizado 29,30,27,34. POS aislados sirven para probar directamente la capacidad de fagocitosis de las células RPE mutantes, por ejemplo, puntos de venta son fagocitados fácilmente por las células RPE primarias de ratones de tipo salvaje, mientras que las células de la integrina beta5 y ratones knockout MFG-E8 fagocitan menos POS en la misma cantidad de tiempo 6,12. La cuantificación de la fagocitosis POS puede hacerse contando marcado con FITC POS manualmente en imágenes de microscopio 6 (Figura 3A), usando un equipo capaz de leer la intensidad de fluorescencia 10,24,15,35 o un citómetro de flujo después de tripsinización de células 36,27. Más recientemente, la ingesta de POS y la degradación se ha evaluado on immunoblots determinada por opsinas 37,38,27.
In vivo, el proceso de absorción de POS se produce secuencialmente como el reconocimiento precede / internalización de unión 6 sincronizados. Las diferentes fases de absorción también pueden distinguirse in vitro mediante el uso de procedimientos experimentales apropiadas 39. Experimentos de pulso-caza se pueden realizar con el interruptor de temperatura: POS unión se produce a 20 ° C, mientras que la internalización necesita una temperatura de 37 ° C para proceder 32,40,7. Esta distinción también existe en macrófagos, que pueden reconocer POS, así y en el que la maquinaria molecular para eliminar las células apoptóticas es muy similar a la maquinaria de la RPE 7. Después de FITC-POS fagocitosis, la unión y la internalización se pueden cuantificar en muestras separadas por apagado el FITC fluorescencia del POS unido a la superficie durante la pre-incubación con azul tripano antes de fijar las células 10. En las células azules tratados tripano, sólo pasanteal POS se visualizará, y POS unido puede cuantificarse restando POS interna de los recuentos totales de fluorescencia POS. Cuando se evalúa la fagocitosis en inmunoblots obtenidos utilizando lisados recogidos después del desafío POS, un trato equivalente con EDTA antes de la lisis permitirá que el destacamento de POS con destino en la superficie celular para uso en interior frente POS total de comparación fagocitosis 37,38.
Grandes avances se han hecho en la identificación de las máquinas fagocíticas gracias a los experimentos que emplean POS purificada. Reclutamiento de proteínas se puede evaluar mediante ensayos de inmunofluorescencia co-localización de 13-15,19-21,37,41 (Figura 3B). Reclutamiento de proteínas o activación pueden ser validadas en inmunoblots después de inmunoprecipitación o mediante la comprobación de la fosforilación 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figura 3C). Estudios más de composición abierta sobre los cambios globales de expresión génica después de diferentes tiempos de desafío POS tienen unlso ha realizado 42.
POS aislada también puede ser usado para estudiar la eliminación POS por las células del RPE. De hecho, durante el envejecimiento normal y / o cuando POS no se digieren correctamente, productos de degradación POS se acumulan gradualmente a medida que los depósitos de lipofuscina y pueden conducir a patologías debidas a los mecanismos de oxidación 24,27. Por lo tanto, la comprensión de los efectos de la luz y el daño oxidativo relacionado puede requerir desafío POS de células del EPR 18,26. Finalmente, se repite la alimentación con 27 normales u oxidadas 25,28 POS pueden ser utilizados para inducir efectos acumulativos en las células del RPE en cultivo con el fin de comprender los mecanismos patológicos que se desarrollan in vivo durante períodos de tiempo más largos.
Figura 1. Retina aislamiento de los ojos porcinos. Dibujo que muestra las diferentes etapas de la disección del ojo con el finrecoger y homogeneizar la retina antes de la etapa de ultracentrifugación en gradientes de sacarosa continuas, empezando arriba a la izquierda. Una amplia hoja de 60 mm se utiliza para cortar secuencialmente el ojo de un lado y luego el otro con el fin de ser capaz de estirar de dentro a fuera en una punta del dedo, exponiendo así a la retina. A continuación, la retina se recoge por desguace desde el tapetum con la cuchilla. Retinae reunidas se agitó a fondo a continuación, en tampón de homogeneización, se filtró 3 veces a través de dobles capas de gasa y delicadamente vierte en la parte superior de la lineal de 25 - 60% gradiente de sacarosa.
Figura 2. POS purificación de los ojos de porcino (A) Fotografía de las diversas capas observadas en un 25 -. Gradiente de sacarosa del 60% después de ultracentrifugación de homogeneizados de retina. La banda naranja corresponde al POS que ser recogidos. Los corresponde superiores de banda blancaa los materiales no-POS relacionados, así como los residuos más grandes migrando cerca o en la parte inferior del tubo. (B) Imagen aislado POS como se observa en un microscopio de campo brillante en una celda de conteo para la evaluación del rendimiento. POS existe en alargado (a, a ', c, d) y se volvió (a, a' formas, d, b, b '). Algunos POS alargado puede mostrar una extremidad enrollada (c). Al cambiar el plano de enfoque, POS cambios de apariencia de brillante a oscuro (comparan ay a ', b y b'). Panel e ilustra POS que no se han resuspendido correctamente y residir en grupos. Panel F muestra POS que se han dañado y no son utilizables, sólo trozos pequeños son detectables. Escala 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
HigoUre 3. Análisis de la fagocitosis RPE usando POS purificada. (A) imagen de microscopio confocal y la correspondiente cuantificación del número de fagosomas por célula con el tiempo que muestran que POS marcado con FITC (verde) han sido menos fagocitados por las células de RPE primarias aisladas de la integrina beta5 knockout (β5 - / -) en comparación con ratones de tipo salvaje (WT o β5 + / +) de control como se indica. Los núcleos (rojo) se marcaron utilizando DAPI y uniones celulares (azul) usando el marcador de unión estrecha ZO-1. Escala de Barras 10 micras. . Reproducido de © Nandrot et al, 2004, publicado originalmente en The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) imágenes microscopio confocal que muestran co-localización (amarillo-magenta, panel inferior derecho) entre las proteínas β5-GFP fusión (verde, panel superior izquierdo), αvβ5 superficie integrina receptores (rojos, panel superior derecho) y POS (azul, fondopanel izquierdo). Barra de escala 10 micras. . Reproducido de Nandrot et al, 2012, publicado originalmente en Biología de la Célula de 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) Las inmunotransferencias (BM) y la correspondiente cuantificación (quantif.) Que muestra que desafío POS (POS) aumenta la fosforilación de FAK en el residuo Tyr397 en comparación sin tratamiento (/) o desafiados con medio solo (m) en las células control (c) mientras que las células que expresan una forma inactiva de la FAK (F) no reaccionan, como se indica. Reproducido de Finnemann de 2003, originalmente publicado en EMBO Journal 22 (16):. 4.143 a 4.154 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
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