Abstract
망막 색소 상피 (RPE) 세포, 감광체 외측 세그먼트 (POS)의 소비 세 말단 단편의 탐식 중요한 기능 중 하나의 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. phototransduction 기계를 포함하는 멤브레인 디스크의 스택과 함께 광 수용체 외부 세그먼트는 지속적으로 망막에 갱신됩니다. 소비 POS는 망막 색소 상피 세포에 의해 매일 제거된다. 설치류, 돼지 / 소 및 인간 RPE 세포는 유사한 방식으로 다양한 종으로부터 POS 인식. 작은 변동으로 큰 시리즈의 실험을 수행하는 것을 용이하게하기 위해, POS의 큰 눈 스톡은 돼지로부터 분리 및 분취 냉동 저장 될 수있다. 이 프로토콜은 어두운 곳에서 보관시 오렌지색 표시 photopigments의 특성을 이용한다. 희미한 붉은 빛에서 절반으로 잘라 열 eyecups에서 버퍼에 망막 수집됩니다. 망막 세포 현탁액을 균질화 연속 수크로오스 구배 상으로 여과시키고로드된다. CEN 후trifugation는 POS는 오렌지 색상 특성을 갖는 그래디언트의 상단부에 개별 대역에 위치한다. POS는 다음 수집, 회전, 세척 버퍼에 순차적으로 재현 탁, 카운트 분주합니다. 이 방법으로 얻어진 POS 식세포 작용 분석 및 POS 도전 후 다양한 시점에서의 단백질 활성 지역화 또는 상호 작용의 분석에 이용 될 수있다. 또한, POS는 전자. 형광 물질로 표시 할 수 g., FITC, 이후의 형광 결합 POS의 정량 또는 말림을 위해, 분취 전에. 다른 가능한 애플리케이션은 산화 스트레스 또는 RPE 세포에 대한 노화의 효과를 연구하기 위해 스트레스 조건과 결합 된 변성 또는 POS POS 도전 사용을 포함한다.
Introduction
망막, 시력은 뇌의 시각 영역까지 뉴런 사이에서 전송 될 수있는 신호로 변환되기 전에, 감광성 opsins 불리는 분자의 이성화에 의해 트리거된다. 이들 분자는 시각 세포의 외부 세그먼트 부 PRS ()를 구성 팬케이크 닮은 멤브레인 디스크 스택에 포함된다. 빛과 산화 스트레스 때문에 상당한 수준으로 일정하게 노출 실시한, 푸에르토 리코 놈들은 지속적으로 잠재적 인 산화 적 손상을 제한하기 위해 자신의 외부 세그먼트를 갱신. 감광체 외부 세그먼트는 인접하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 미세 융모 꼭대기에 밀착된다. RPE 세포는 혈액 망막 장벽의 외측 부분을 구성하며, 이러한 멜라닌 색소, 광 반응성 옵신 성분 망막 재 이성화 제공 영양분 g 통해 광선 담금질 감광체 건강과 기능 1에 중요한 수많은 작업을 보장홍보 대사 처리에 참여하는 요인을 rowth.
또한, RPE 세포는 POS를 보냈다 및 구성 요소, 포유류 망막 2,3의 일주기 리듬에 의해 조절된다 매일 직업을 재활용 제거합니다. 창고 POS의 간격은 PR 생존에 절대적으로 필요하다. 이 완전히 폐기 될 때, POS 파편 축적 PRs를 급속 시력 손실을 야기 4,5- 퇴화. 리듬 프로필이 손실 일정한 활동으로 대체하는 경우, PR 및 RPE 결함은 6 세에 축적된다. 따라서, 해당 장애에 링크 표현형을 이해하기 위해서는 시험관 내에서 RPE 탐식의 분자 특성을 조절하는 것이 매우 중요하다. 흥미롭게도, 망막 색소 상피 세포에서 분자 기계는 세포 사멸을 취소 식세포에서 사용하는 것과 매우 유사하며, 모두 식세포 파편 7-9에 노출 된 포스파티딜 세린의 인식에 따라 달라집니다. 그러나 망막 색소 상피 세포와 대 식세포는 산도를 조절대 식세포는 만남시 사멸 세포의 즉각적인 제거에 대한 선택으로 agocytosis는 다르게, 망막 색소 상피 세포는 리듬 외부 세그먼트 영구 접촉에도 불구하고 하루에 한 번만 POS를 침몰한다. 이것은 아직 완전히 이해되지 않는 특정 규제 메커니즘을 제안한다.
망막 색소 상피 식세포 기계에 연루 분자의 대부분은 확인 또는 격리 된 POS 및 세포 배양 식세포 작용 분석의 사용 덕분에 확인되었다. 리간드 MFG-E8와 협응 혀끝 RPE 세포 표면에 위치 alphavbeta5 인테그린 수용체는 다음 MerTK 티로신 키나제 수용체를 통해 내부화되는 13-15 POS 10-12에 특이 적으로 결합. 소제 CD36 수용체 POS 섭취에 참여하고 그 속도 (16, 17)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, POS면 (18)에서 산화 인지질의 센서로서 기능 할 수 있습니다. 국제화는 F-액틴 세포 골격 엉덩이의 채용이 필요이러한 넥신 2 (19), 미오신 II (20)과 미오신 VIIA 21, 22로 ociated 단백질. 체외에서 기본 또는 산화 POS도 제대로 소화 산화 POS 23-28의 축적에 연결된 생체 내에서 망막 색소 상피 세포의 노화 표현형을 이해하기 위해 사용된다. 줄기 세포 유래의 RPE 세포의 생성은 동물이나 환자 29,30,27 이식 전에 세포 기능을 증명하기 위해 사용되는 절연 POS 용의 애플리케이션을 개시하고있다.
먼저 1987 31 Molday와 동료에 의해 기술, 소 POS의 분리를위한 프로토콜 (11- 시스 망막을 운반) 표백 망막 photopigment의 특성 오렌지 모양의 관찰 연속 자당 그라디언트에 망막 균질의 초 원심 분리 단계를 결합합니다. 지난 10 년에 광우병의 위험을 최소화하기 위해 취해진 조치에 의한은 돼지의 사용은 눈 increasi되었다ngly 눈에 띄는. 여기에 설명 된 프로토콜은 돼지 또는 분주 장시간 동안 저장 될 수 소의 눈에서 POS 다량 획득하는 방법을 보여준다. 이 POS 준비 및 분석 32,33,21,22 당 동물의 다수 사용해야 쥐 눈에서 POS를 준비 할 필요를 없애 준다. 또한, 형광 분자를 사용하여 저장하기 전에 POS 라벨에 대한 자세한 내용은 정량화 식균 작용 분석 32, 10 후 라벨 POS에 비해 일부 응용 프로그램에 대한 간단하고 비슷한 방식으로 POS를 시각화하기 위해 제공됩니다. 따라서,이 물량은 큰 실험의 다양한 종류의 재현성 및 사용의 용이성을 허용한다.
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Protocol
이 POS 분리 실험은 시간이 걸리고 POS 저장하기 전에 표시하는 경우 완료하는 데 12 시간까지 요구할 수있다. 프로토콜은 1997 10 SC Finnemann와 동료 1987 (31)에 RS Molday와 동료에 의해 출판 및 수정 된 논문에서 적응하고있다.
동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 (ARVO) 문 협회에 대한 연구에 따라 처리 하였다. 프로토콜을 검토하고 대학의 피에르와 마리 퀴리 - 파리 06에서 찰스 다윈 (Charles Darwin) 윤리위원회와 포드 햄 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 일반 설정까지
- 가능한 도살 후 80 신선한 돼지 또는 소 눈 신선한 빨리 얻기과 어둠 속에서 냉장 보관하십시오. 이 회사는 같은 방식으로 진행 있도록 공급자에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 (80)의 눈에 최적화되어 있습니다. 에더 눈을 진행하고 더 큰 주식을 얻을 수 (예를 들어, 160 눈에서) 솔루션 수량을 두 배로 초 원심의 2 라운드를 수행; 풀 샘플은 이후 단계에서 수집한다 (단계 2.2.2 참조).
- 빨간색 안전 등 램프, 흡수 패드는 벤치에 설정, (재료 표)를 정리합니다. (... 유리체되지 않는 눈 부분) 15cm 요리와 생물 학적 가방 폐기물 수집을위한 준비. 꽉 끼는 labcoat, 장갑, 소매 보호 고글을 착용 할 것.
- 주의 사항 :
- 모든 솔루션을 사전 진정 모든 단계에서 감기에 보관하십시오. 가능한 한 많은 얼음에 냉장 눈과 구배를 유지합니다.
- 초 원심 분리 후 수집 단계는 시각적 안료 및 photopigments의 활성 형태의 오렌지 핑크 색상의 손실 photobleaching에 방지 할 때까지 가능한 한 많은 어둠 속에서 눈과 파생 조직을 유지합니다.
2. 프로토콜 작업
- 솔루션과 그라디언트를 준비합니다
- 해동 타우린 주식은 완전히 37 ° C의 물을 욕조를 사용.
- 원액의 모든 솔루션 (표 1, 재고 솔루션)를 준비하고 철저하게 각 솔루션에 대한 자기 교반기를 사용하여 다른 재료와 설탕을 섞는다.
- 20 % 수 크로즈의 최종 농도로 균질화 용액 15ml를 준비, 20 mM 중의 아세테이트 pH7.2 2 mM의 트리스의 MgCl 2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 타우린.
- (70 % 수 크로즈 스톡을 사용) 25 % 슈 크로스, 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2, 10 mM의 포도당과 타우린 5mM의 최종 농도 25 % 수크로오스 용액을 제조 하였다.
- (수크로오스 분말을 사용) 60 %의 자당 최종 농도 60 % 수크로오스 용액을 준비하는 20 mM 아세트산은 pH7.2, 10 mM의 포도당과 5 mM의 트리스 타우린.
- 20 mM 트리스 아세트산의 pH 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도로 세척 한 용액을 준비한다.
- 세척이 솔루션을 준비합니다10 % 수 크로스, 20 mM 트리스 pH를 아세트산 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도.
- 10 % 수 크로스, 20 mM의 인산 나트륨 pH를 7.2 및 5mM의 타우린의 최종 농도 3 워시 용액을 준비.
- 자석 교반기에 그라데이션 메이커 꾸준한 60 % 용액이 삽입됩니다 출구에서 가장 가까운 챔버에서 교반 막대를 삽입합니다. 적절한 주조 속도를 달성하기 위해 튜브의 출구에 배치 된 차단 P200 피펫 팁을 사용한다.
- 섬세 희석 및 사전 냉장 초 원심 분리기 튜브에서의 각 용액 (80 눈 즉, 총 6 튜브)를 사용하여 12 ml의 25 %로 한 60 % 수크로오스 용액을 교반하여 선형 그라디언트 캐스트. 잘 점차-희석 60 % 자당 솔루션을 저어. 너무 빨리 원활하지 용액 쏟아지는 구배 흐름의 속도를 정상.
주 : 연속, 선형 구배를 얻기 위해서는, 전체 오른쪽 그라데이션 상자 형성 용 용액의 표면에 피펫 팁 개구 유지N. - 그라디언트 안정화를 위해 약 1 시간 동안 얼음에 앉아 보자. 로드 될 때까지 냉각 구배를 유지합니다. 그라디언트의 중단을 방지하기 위해 튜브를 흔들지 마십시오.
- 조직 컬렉션 :
- 희미한 붉은 빛 아래 조직을 수집합니다. 한 손으로 눈을 타고 멀리 눈을 유지하면서 면도날의 가장자리에 전면을 찌를 (튀는 것을 방지하기 위해, 그림 1). 2 반 (각막 플러스 공막에 최소 5mm)로 전방 안구를 잘라 면도날을 사용합니다. 렌즈를 제거하고, 따라서 하나의 손가락이 망막의 노출 선단에 걸쳐 유지 될 수 있도록 뒤집어 아이 컵 플립.
- 각도 면도날을 사용하여 쉽게 분리하고 부드럽게 tapetum 표면에서, 분홍빛 층으로서 나타나고 시신경 (도 1)에서 절단, 망막 긁어. 2 × 50 ㎖ 튜브 얼음에 균질화 용액 15 ml에 포함 된 각각의 모든 망막를 수집합니다.
- 망막 호모genization :
- , 다른 세포 층을 방해 PR 세포, 조각 POS의 나머지 떨어져 POS 휴식과 망막 서스펜션을 균질화하기 위해 2 분 동안 손으로 적극적으로 서스펜션을 흔들어.
- 깨끗한 거즈 이중층를 필터링 3X 큰 조직편을 제거하고 관류 깨끗한 50ml의 튜브 (도 1)에 수집한다. 망막 서스펜션은 부드럽게, 수율을 극대화 각 여과 후 남은 조각 조직을 해제 거즈에 눌러, 아주 두껍게.
- 광 수용체 외부 세그먼트 조각 (POS) 분리 :
- 60 % 자당 그라데이션 (그림 1) - 30 × 6 이상 ML의 초 원심 분리기 튜브 신선한 냉장 연속 25의 각 포함한 24 ml의 튜브 당 7 ml의 - 부드럽게, 6 주위를 원유 망막 준비를하다. 로터가 사용될 수 있도록 적절한 균형 대향 튜브. 4 ° C에서 50 분 동안 106,000 XG에 초 원심 분리기. 흡인 (그림 2A)에 의해 그라디언트의 상위 세 번째에 오렌지 핑크 밴드 위의 솔루션의 대부분을 제거합니다. 커에 컷오프 P1000 팁과 오렌지 핑크 밴드를 수집합니다. 표백제 (생물학적 폐기물)를 사용하여 중화 한 후 나머지를 폐기하십시오.
- 얼음처럼 차가운 세척 한 용액의 5 볼륨 - ~ 4로 희석. 필요한만큼 30 ml의 튜브로 분리합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- 위에서 설명한 바와 같이 10ml에 재현 탁 펠렛 10 분 동안 3,000 XG에이 솔루션 스핀을 씻으십시오. (15) 용액에 재현 탁 펠렛 3 씻고 10 분 동안 3,000 XG에 다시 스핀. 워시 2 원심 분리하기 전에 필요한 튜브의 수를 줄이고 3 솔루션을 세척하기 위해 여러 펠릿에서 현탁액을 결합합니다.
- POS는 표시하지 않고, 분취 :
- 20 ml의 DMEM - 10에 재현 탁 POS. 예비 희석 (10) 490 μL DMEM (1시 50분)에 μL와에 휙 POS뿐만 아니라 신장 카운트세포 계수 챔버 (도 2B). 1 mL 당 POS 입자의 수율과 농도를 계산한다.
참고 : - 8 × 10 9 POS에서 80 돼지 눈 수율은 예를 들어 연령 및 변형 돼지 / 소와 눈의 크기에 주로 따라 달라집니다, 좋은 준비는 5 범위. - 최종 부피 DMEM 결정 (전형적 10-20 ml) 및 2.5 % 수 크로스의 최종 농도를 수득 크로즈를 추가한다.
- 예를 들어, 원하는 크기의 분량을 준비 / 웰 40 μL에서 96 웰 실험 2 ML의 재 부상 볼륨에 대한 튜브 당 5 × 10 7 POS. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 1 나누어지는 스핀과 펠릿 크기를 평가한다. POS 두 번 냉동 및 해동하지 말아 서로 다른 응용 프로그램의 볼륨에 대한 다양한 나누어지는 크기를 준비합니다.
- 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 POS 씩 동결.
참고 : 분취 량 몇 달 동안 안정하다. 우리의 손에, 레이블 또는 레이블 POS는 1 년 이상 저장할 수 있습니다.
- 20 ml의 DMEM - 10에 재현 탁 POS. 예비 희석 (10) 490 μL DMEM (1시 50분)에 μL와에 휙 POS뿐만 아니라 신장 카운트세포 계수 챔버 (도 2B). 1 mL 당 POS 입자의 수율과 농도를 계산한다.
- POS 라벨 및 분취 :
참고 : 우리는 일반적으로 식균 작용 분석의 정량화를위한 POS 라벨을 FITC를 사용하지만, 다른 염료를 사용뿐만 아니라 필요에 따라 할 수있다.- 1.4 ml의 0.1 M 나 2 CO 3의 pH 11.5 (표 2, 재고 솔루션)와 2.6 ml의 0.1 M의 NaHCO3 pH가 8.4를 혼합하여 0.1 M 나 탄산 완충액 pH 9.5에서 2.5 ㎎ / ㎖ 농도로 재현 탁 (1) 10 mg을 FITC 유리 병. 비 재현 탁 FITC 고체 펠릿 최대 속도로 5 분 동안 빛과 스핀에서 보호하면서 실온에서 1 시간 동안 회전합니다.
- 워시 3 솔루션 (또는 DMEM) 10ml에 POS 펠렛을 재현 탁 80 눈 FITC 용액 2 ㎖를 추가합니다. -80 ° C에서 냉동 남은 FITC 저장합니다. 실온에서 적어도 1.5 시간 동안 회전합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 2.3.4 절에 설명 된대로 거의 무료 FITC가 뜨는 F에서 볼되지 않을 때까지 한 번 또는 두 번 DMEM에 두 번 씻으 3 솔루션을 사용하여 표시 POS를 씻으raction. DMEM에 재현 탁 POS 및 계산하고, 분취 (2.4 절)에 대한 레이블이없는 POS 용으로 진행합니다.
- 실험에 POS를 사용 :
- 해동 RT에서 POS, 그들이 형광 표지 된 경우 최대한 어두운에 보관. RT에서 2,300 XG에서 5 분 동안 스핀. 뜨는을 기음.
- 실험에 의해 지시 된 바와 같이 즉시 분석 용액의 적절한 용적에 재현 탁. POS 도전 달라지는 경우, 저장소는 수 시간 동안 시간 어두운 점 사이에서 RT에서 POS 재현 탁.
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Representative Results
선형 자당 구배 초 원심 분리의 조합은 망막 밀도 현탁액의 다른 구성 요소의 분리를 허용한다. 크고 무거운 망막 및 RPE 세포 파편은 구배 (도 2a)의 바닥 또는 근처에 가라. 망막 라이터 POS 라이터 개별 세포 또는 세포 파편은 원심 분리 기간의 종료에 의해 그라데이션의 상단 절반에 도달하는 등의 별도의 대역을 이동한다. 원심 분리 단계 이후까지 어두운 눈과 샘플을 유지함으로써, POS 함유 대역 즉시 밝은 오렌지 색으로 인식 할 수있다. 이 밴드의 폭과 강도는 그라데이션 품질과 튜브 높이 (89mm 높이가 바람직)에 따라 달라집니다. 제대로 격리 할 때 현미경 슬라이드 (그림 2B)에서 관찰 할 때 일반적으로 POS는 직선 또는 구부러진, 길게 나타납니다. 현미경의 초점 평면에 따라, 그들은 어둡거나 빛나는 하나를 표시 할 수있다. 하지 resus 경우제대로 보류, 그들은 대단히 짧은 시간에 남아있을 것입니다. 그들은 (아래 단락 참조) 손상된 경우, 그들은 약간의 '먼지'배경처럼 많은 작은 조각을 나타납니다.
발생할 수있는 문제는 세 가지 문제에 주로 관련이 있습니다. 첫 번째 가능한 문제는 망막 균질의 흔들림이 단계는 감소 수율에 따라서의 PR에 부착 된 나머지 POS에 이르게 충분한 활발한되지 않는 것입니다. 로드하거나 과도한 튜브 수집하기 전에 어떤 단계에서 떨고 전에 두 번째 가능한 문제는 불충분 한 안정화 시간에 가난한 그라데이션 주조 또는 그라데이션 품질의 손실로 연결되어 있습니다. 이 경우, 밴드는 올바르게 구별 할 수없고 해당 POS 튜브에 수집 될 수 없다. POS 막이 분해 할 수 있고 수율 평가들을 시각화 때만 POS 작은 파편은 현미경에 표시 : 용액의 임의의 pH가 잘못되면 마지막으로 세 번째 잠재적 인 문제가 발생한다.
정제 된 POS 수망막 색소 상피 세포의 탐식 기능을 공부에 관련된 여러 프로그램에 사용할 수. RPE 세포는 일반적으로 세포 라인 또는 동물 모델에서 32,6,12,18-21 초대 배양에 사용된다. 최근 IPSC ESC 또는 재 프로그램 등 줄기 세포 유래의 RPE 세포를 29,30,27,34 사용되어왔다. 격리 POS 직접 돌연변이 RPE 세포의 탐식 능력 테스트하는 역할, 예를 beta5 인테그린 및 MFG-E8 녹아웃 마우스의 세포가 같은 시간에 덜 POS를 탐식하는 반면, POS 용이 야생형 마우스의 일차 RPE 세포에 의해 포식되고 6,12. POS 탐식의 정량화 할 수있는 하나, 현미경 사진 (6) (도 3A)에서 수동으로 FITC 표지 된 POS를 카운트 형광 강도 10,24,15,35 또는 세포를 트립신 처리 후 36,27 플로우 사이토 미터를 판독 할 수있는 장비를 사용함으로써. 최근 POS 섭취 열화 O를 평가 된opsins 37,38,27 조사해서 n 개의 면역 블롯.
생체 내에서, POS 흡수 과정은 내재화 6 동기화 인식 / 바인딩 선행 순차적으로 발생한다. 흡수 상이한 위상은 적절한 실험 절차 (39)를 사용하여 시험 관내에서 구별 할 수있다. 펄스 추적 실험은 온도 스위치를 사용하여 수행 될 수있다 : 내재화가 진행 32,40,7 37 ° C의 온도를 필요로하는 동안 POS 결합은 20 ° C에서 발생한다. 이러한 차이는 사멸 세포를 제거하기 위해 잘하는 분자 기계 POS를 인식 할 수있는 대 식세포에 존재는 RPE의 기계 (7)와 매우 유사합니다. FITC-POS의 식균 작용 후, 바인딩 및 국제화는 셀 (10)를 고정하기 전에 트리 판 블루와 사전 부화하는 동안 표면에 결합 된 POS의 FITC 형광을 담금질에 의해 별도의 샘플에서 정량화 할 수있다. 트리 판 블루 처리 한 세포에서 만 인턴알 POS가 가시화 될 것이고, 결합은 총 POS POS 형광 카운트 POS에서 내부를 감산함으로써 정량화 할 수있다. 식균 작용은 POS의 공격 후 수집 된 해물을 사용하여 얻은 면역 블롯에 평가 될 때, 용해 전에 EDTA와 동등한 치료는 총 POS의 식균 작용 비교 37, 38 대 내부의 세포 표면에 결합 된 POS의 분리를 허용합니다.
엄청난 진보 정제 POS를 사용하는 실험에 탐식 기계 감사의 식별 이루어지고있다. 단백질 모집 면역 형광 공동 현지화 분석 13-15,19-21,37,41 (그림 3B)에 의해 평가 될 수있다. 단백질 모집 또는 활성화는 면역 후 면역 블롯 또는 인산화 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (그림 3C)를 확인하여 유효성을 검사 할 수 있습니다. POS 도전의 다른 시간을 한 후 전체 유전자 발현의 변화에 더 개방적 연구LSO (42)를 수행.
격리 POS는 RPE 세포에 의해 POS 제거를 연구하는데 이용 될 수있다. 실제로, 정상시 노화 및 / 또는 POS가 제대로 소화되지 않는 경우, POS 분해물 리포 푸신이 침착 점차 축적 및 산화 메커니즘 24,27 인한 병변을 초래할 수있다. 따라서, 빛과 관련된 산화 손상의 영향을 이해하는 것은 망막 색소 상피 세포 (18, 26)의 POS 도전을 필요로 할 수있다. 마지막으로, 통상 27 또는 25, 28 산화 POS가 오랜 기간 동안 생체 내에서 개발 병리 기전을 이해하기 위해 배양 RPE 세포의 누적 효과를 유도하기 위해 사용될 수있다 먹이로 반복했다.
돼지의 눈에서 그림 1. 망막 격리. 위해 눈 해부의 다른 단계를 보여주는 그리기수집하고 왼쪽 상단을 시작 연속 자당 그라디언트에 초 원심 분리 단계 전에 망막을 균질화한다. 60mm 폭 블레이드 따라서 망막 노출 손가락 끝에 안쪽 잡아 늘릴 수 있도록하기 위해 한쪽 눈 순차적으로 절단하고, 다른 데 사용된다. 다음으로, 망막은 블레이드 tapetum에서 폐차에 의해 수집됩니다. 풀링 된 망막은, 균질화 버퍼에 철저하게 흔들리고 필터링 3 회 거즈의 더블 레이어를 통해 섬세하게 선형 (25)의 상단에 부어 - 60 % 자당 기울기.
돼지의 눈에서 그림 2. POS 정화 (25) 관찰 다양한 계층의 (A) 사진 -. 망막 균질의 초 원심 분리 후 60 % 자당 기울기. 오렌지 밴드를 수집하기 위해 POS에 해당합니다. 화이트 위 밴드 대응비 POS 관련 자료뿐만 아니라 근처 또는 튜브의 하단에 마이그레이션 큰 부스러기. 수율 평가를위한 계산 셀에 밝은 필드 현미경 관찰로 고립 된 POS의 (B) 그림. POS는 (a, 긴 존재 ', C, D) 및 (, 휙', B, B ', D) 형태. 일부 연장 POS는 코일 말단 (C)를 표시 할 수 있습니다. 초점 평면을 변경할 때, 어둠에서 반짝이 POS 외관 변화는 (A와 A ', B와 B'를 비교). 패널 전자 제대로 재현 탁하고 덩어리에 거주하지 않은 POS를 보여줍니다. 패널 f는 손상 사용할 수 없습니다 된 POS를 보여줍니다 만 작은 조각이 검출됩니다. 10 μm의 크기를 조절합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무화과정제 POS를 사용하여 망막 색소 상피 식균 작용의 우레 3. 분석. (A) 공 초점 현미경 사진 및 FITC 표지 POS (녹색)가 적은 beta5 인테그린에서 분리 된 망막 색소 상피 일차 전지에 의해 포식 된 것을 보여주는 시간 셀 당 phagosomes의 수에 해당하는 정량 녹아웃 (β5 - / -) 야생 형 바와 같이 (중량 또는 β5 + / +) 제어 마우스에 비해. 핵 (적색) 꽉 접합 마커에게 ZO-1을 사용 DAPI 및 세포 접합 (파란색)를 사용하여 표시 하였다. 규모는 10 μm의 바. . © Nandrot 등, 2004 년 재현, 원래 실험 의학 (200) (12)의 저널에 발표 : 1539-1545합니다. (B) β5-GFP 융합 단백질 (녹색, 왼쪽 패널), 표면 αvβ5 인테그린 수용체 (빨간색, 오른쪽 상단 패널) 및 POS (파란색, 하부와의 사이의 공동 현지화 (노란색, 자홍, 오른쪽 아래 패널)를 표시하는 공 초점 현미경 사진왼쪽 패널). 스케일 바 10 μm의. . Nandrot 등, 2012 년부터 재현, 원래 셀 (104) (6)의 생물학에 발표 : 326-341, © 포틀랜드를 눌러 제한. 치료 (/)없이 비교 또는 제어 세포에서 혼자 매체 (m) (C)와 도전을 할 때 (C) 면역 블롯 (WB) 및 해당 정량 (quantif.) 그 POS 도전 (POS)를 표시는 Tyr397 잔류에 FAK 인산화를 증가 FAK (F)의 불 활성화 된 형태를 발현하는 세포가 반응하지 않는 상태로는 지적했다. 원래 EMBO 저널 22에 발표 Finnemann, 2003에서 재현 (16). 4143-4154 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
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