Abstract
Análise de uma das funções vitais do pigmento epitelial da retina (RPE) células, a fagocitose de fragmentos distais envelhecido gasto de segmentos externos de fotorreceptores (POS) pode ser realizado in vitro. Fotorreceptoras segmentos externos com pilhas de discos membranosos que contêm as máquinas phototransduction é continuamente renovado na retina. Passado POS são eliminados diariamente por células RPE. Roedor, suíno / bovino e células RPE humanas reconhecem POS a partir de várias espécies de um modo semelhante. Para facilitar a realização de uma grande série de experiências com pouca variabilidade, um grande stock de POS podem ser isolados a partir de olhos de porcos e armazenado congelado em alíquotas. Este protocolo tira proveito da característica de photopigments que exibem uma cor laranja quando mantidos no escuro. Sob a luz vermelha ofuscante, retinae são coletados em um buffer de viseiras abertas cortadas em metades. A suspensão de células da retina é homogeneizada, filtrada e carregado num gradiente de sacarose contínuo. Após centrifugation, POS estão localizados em uma banda discreta na parte superior do gradiente que tem uma cor laranja característica. POS são então recolhidas, centrifugadas, ressuspensas em tampões de lavagem sequencialmente, contadas e aliquotadas. POS obtidos deste modo podem ser utilizadas para ensaios de fagocitose e análise de activação da proteína, localização ou interacção em vários momentos após o desafio POS. Alternativamente, POS podem ser marcados com fluoróforos, e. G., FITC, antes de alíquotas para posterior quantificação de fluorescência de ligação de POS ou imersão. Outras aplicações possíveis incluem o uso de POS ou POS desafio modificado combinado com condições de estresse para estudar o efeito do estresse oxidativo ou envelhecimento sobre células RPE.
Introduction
Na retina, a visão é desencadeada por isomerização de moléculas fotossensíveis chamados opsinas, antes de ser transformado em um sinal que pode ser transmitido entre os neurónios para cima para as áreas visuais no cérebro. Estas moléculas são incorporados em pilhas de discos que se assemelham panquecas membranosas que constituem as partes segmentares exterior de células fotorreceptoras (RP). Sendo submetido a constante exposição à luz e, portanto, os níveis consideráveis de estresse oxidativo, PRs renovar continuamente os seus segmentos externos para limitar o dano oxidativo potencial. Segmentos externos fotorreceptoras estão em contato próximo com microvilosidades apical das células do epitélio pigmentado da retina vizinhos (RPE). Células RPE constituem a parte exterior da barreira hemato-retiniana e garantir inúmeras tarefas que são cruciais para fotorreceptores saúde e função 1, como o que extingue os raios de luz através de pigmentos de melanina, re-isomerização do retinal componente opsina fotorreactivo, fornecendo nutrientes e gCRESCIMENTO fatores, participando de eliminação PR metabólito.
Além disso, as células de RPE eliminam gasto POS e reciclar seus componentes, uma ocupação diária, que é regulada pelo ritmo circadiano na retina de mamíferos 2,3. A folga de galpão POS é absolutamente necessário para a sobrevivência PR. Quando ele está completamente revogada, POS detritos se acumulam e PRs degenerar causando 4,5 perda de visão rápida. Se o perfil rítmico é perdida e substituída por uma actividade constante, defeitos PR e RPE acumular com 6 anos de idade. Portanto, é muito importante para caracterizar a regulação molecular de EPR fagocitose in vitro, a fim de compreender fenótipos ligados à sua disfunção. Curiosamente, a maquinaria molecular em células RPE é muito semelhante à utilizada pelos macrófagos para eliminar as células apoptóticas e ambos dependem do reconhecimento de fosfatidilserina exposta em detritos fagocítica 7-9. Ainda, as células de RPE e macrófagos regular o pHagocytosis de forma diferente, como macrófagos optar pela eliminação imediata das células em apoptose em tempo de encontro, enquanto as células RPE ritmicamente engolfar POS apenas uma vez por dia, apesar de estarem em contato permanente com segmentos externos. Isto sugere mecanismos de regulação específicos que ainda não são totalmente compreendidos.
Muitas das moléculas envolvidas na maquinaria de EPR fagocítica foram identificados e validados graças à utilização de POS isolado e ensaios de fagocitose de cultura de células. O receptor de integrina alphavbeta5 localizado na superfície apical de células RPE, em coordenação com o seu ligando MFG-E8, liga-se especificamente ao POS 10-12, que são então internalizado através do receptor tirosina-quinase MerTK 13-15. O scavenger receptor CD36 tem sido mostrado para participar na ingestão de POS e influenciar a sua velocidade de 16,17, e poderá servir como um sensor de fosfolípidos oxidados na superfície POS 18. Internalização precisa o recrutamento de F-citoesqueleto de actina-assproteínas, tais como a anexina ociated 2 19, 20 e miosina II miosina VIIA 21,22. POS Native ou oxidado in vitro também são utilizados para entender o envelhecimento fenótipos de células RPE in vivo ligados ao acúmulo de mal digeridos POS oxidado 23-28. A geração de células epiteliais pigmentares derivadas de células-tronco deu início a uma nova aplicação para o isolado POS que são usados para provar a funcionalidade das células antes de serem transplantadas para animais ou pacientes 29,30,27.
Descrita pela primeira vez por Molday e colegas em 1987, 31, o protocolo para o isolamento de POS bovina combina um passo ultracentrifugação de homogeneizados de retina em gradientes de sacarose contínuas com observação da aparência laranja característico de fotopigmento retinal crus (levando 11- retinal cis). Nos últimos 10 anos, devido a precauções tomadas, a fim de minimizar o risco de doença da vaca louca, o uso de olhos de porco tornou-se increasingly proeminente. O protocolo aqui descrito mostra como obter grandes quantidades de POS de porcina ou bovina olhos que podem ser distribuídos em alíquotas e armazenados por longos períodos de tempo. Isto elimina a necessidade de preparar a partir de POS de roedores olhos, o que exige a utilização de um grande número de animais em cada preparação e ensaio de POS 32,33,21,22. Além disso, detalhes sobre rotulagem POS antes de armazenamento utilizando moléculas fluorescentes são dadas, para quantificar e visualizar POS de uma forma simplificada e comparáveis para algumas aplicações, em comparação com a rotulagem POS após o ensaio de fagocitose 32,10. Portanto, estes grandes existências permitir a reprodutibilidade e facilidade de utilização, em muitos tipos diferentes de experiências.
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Protocol
Este experimento isolamento POS é demorado e pode precisar de até 12 horas para ser concluído se POS são rotulados antes do armazenamento. O protocolo foi adaptado de um artigo publicado pelo RS Molday e colegas em 1987, 31 e modificado por SC Finnemann e colegas em 1997 10.
Os animais foram tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research. Os protocolos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Charles Darwin Ética da Universidade Pierre e Marie Curie em Paris, 06 e Comitê Institucional Animal Care e Uso da Universidade Fordham.
1. Geral Set Up
- Obter 80 frescas de suíno ou de vaca olhos tão fresco, logo após o abate quanto possível e mantê-los refrigerados no escuro. Fornecer instruções para o provedor para que a empresa procede da mesma maneira. Este protocolo é otimizado para 80 olhos. Paraprosseguir com mais olhos e obter estoques maiores (por exemplo, a partir de 160 olhos), o dobro das quantidades de solução e realizar duas rodadas de ultracentrifugação; amostras de piscina mais tarde, na etapa de coleta (veja o passo 2.2.2).
- Configure no banco a lâmpada safelight vermelho, absorventes, lenços (tabela de materiais). Prepare 15 centímetros pratos e sacos de risco biológico para a recolha de resíduos (partes do olho não utilizado, vítreo ...). Usar apertada labcoat, luvas, mangas de protecção e óculos de proteção.
- Precauções:
- Pré-chill todas as soluções, em seguida, mantê-los frio durante todas as etapas. Manter os olhos e gradientes refrigeradas em gelo tanto quanto possível.
- Manter os olhos e tecidos derivados no escuro, tanto quanto possível até que o passo de recolha após a ultracentrifugação a fim de evitar a fotodegradação de pigmentos visuais e perda da coloração laranja-rosa da forma activa dos photopigments.
2. Protocolo de Ações
- Preparar soluções e gradientes:
- Estoque taurina Thaw completamente através de um banho de água a 37 ° C.
- Prepare todas as soluções de soluções de estoque (Tabela 1, soluções de reserva) e misture bem a sacarose com outros ingredientes, usando um agitador magnético para cada solução.
- Preparar 15 ml da solução de homogeneização a uma concentração final de 20% de sacarose, 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, 2 mM de MgCl 2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina.
- Preparar a solução de sacarose a 25% para uma concentração final de sacarose a 25% (utilizando 70% de sacarose estoque), 20 mM de acetato de tris pH 7,2, 10 mM de glicose e 5 mM de taurina.
- Preparar a solução de sacarose a 60% para uma concentração final de 60% de sacarose (usando pó de sacarose), 20 mM Tris pH 7,2 de etilo, glicose 10 mM e 5 mM de taurina.
- Preparar a solução de lavagem para uma concentração final de 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina.
- Preparar a solução de lavagem 2a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de acetato de tris de pH 7,2 e 5 mM de taurina.
- Preparar a solução de lavagem de 3 a uma concentração final de 10% de sacarose, 20 mM de fosfato de sódio pH 7,2 e taurina 5 mM.
- Firmar o fabricante de gradiente com um agitador magnético e inserir uma barra de agitação na câmara mais próxima da saída, onde a solução de 60% será inserido. Usar uma pipeta de ponta P200 de corte colocado na saída da tubagem para alcançar velocidade de vazamento adequada.
- Fundido gradientes lineares delicadamente por diluição e agitação da solução de sacarose a 60% com o um, 25% a partir de 12 ml de cada solução (isto é, o total de 6 tubos de 80 olhos) em tubos de ultracentrífuga previamente arrefecidos. Mexa bem a solução de sacarose gradualmente-diluição de 60%. Firmar a velocidade do fluxo de gradiente, derramando a solução de forma suave e não muito rápido.
NOTA: De modo a obter um gradiente contínuo, linear, manter a ponta da pipeta de abertura à direita na superfície da solução durante todo o gradiente formation. - Deixe os gradientes de sentar no gelo por cerca de 1 hora para a estabilização. Mantenha os gradientes refrigeradas até carregado. Não agite os tubos para evitar a interrupção do gradiente.
- Coleta de tecido:
- Recolha tecidos sob luz vermelha ofuscante. Tome um olho em uma das mãos e picar a frente com borda de lâmina de barbear, mantendo o olho longe (para evitar respingos; Figura 1). Use a lâmina de barbear para cortar o globo ocular anterior em duas metades (córnea, além de pelo menos 5 mm no esclera). Retire a lente e virar o ocular dentro para fora, de modo que ele pode ser realizada através da ponta de um dedo expondo assim a retina.
- Usando a lâmina em ângulo, raspe a retina, separando facilmente e aparecendo como uma camada rosada, fora da superfície das células do tapete e cortado na cabeça do nervo óptico (Figura 1). Recolha todas as retinas em 2 x 50 ml bisnagas contendo 15 ml de solução de homogeneização sobre gelo.
- Homo Retinahomoge-:
- Agitar a suspensão vigorosamente à mão durante 2 minutos a fim de interromper as diferentes camadas de células, quebrar POS fora do resto da célula PR, POS fragmento e homogeneizar a suspensão retina.
- Filtrar através de um 3x dupla camada de gaze para remover os fragmentos de tecido grandes e recolher o fluxo de passagem em tubos de 50 ml limpos (Figura 1). A suspensão da retina de ser bastante espessa, para maximizar o rendimento, pressionar suavemente sobre a gaze para libertar restantes tecidos fragmentadas após cada filtração.
- Fotorreceptores exterior fragmento segmento (POS) de isolamento:
- Cuidadosamente, coloque o prep retina bruto, cerca de 6-7 ml por tubo, mais de 6 x 30 ml tubos de ultracentrífuga, cada uma contendo 24 ml de frescas, refrigeradas contínua 25-60% gradiente de sacarose (Figura 1). Equilibrar os tubos opostos, conforme apropriado para o rotor a ser utilizado. Ultracentrífuga a 106.000 xg durante 50 min a 4 ° C. Remover a maior parte da solução acima da banda laranja-rosa no terço superior do gradiente por aspiração (Figura 2A). Colher a faixa laranja-rosa com um P1000 ponta de corte para um copo. Descartar o resto depois neutralizar o uso de alvejante (resíduos biológicos).
- Dilui-se com ~ 4 - 5 volumes de gelado de lavagem uma solução. Separa-se em tantos tubos de 30 ml, conforme necessário. Centrifugar a 3.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante cuidadosamente.
- Ressuspender as pelotas em 10 ml de solução de lavagem 2 e centrifugação a 3000 xg durante 10 min como descrito acima. Ressuspender as pelotas em 15 ml Lavar 3 e roda de novo a 3000 xg durante 10 min. Combinar suspensões de vários peletes para reduzir o número de tubos necessários antes da centrifugação em 2 de lavagem e lava-se três soluções.
- POS alíquotas sem rotulagem:
- Ressuspender POS em 10-20 ml DMEM. Pré-diluir 10 ml em 490 DMEM ul (1:50) e contagem alongados, bem como POS girou em umcâmara de contagem celular (Figura 2B). Calcule o rendimento e concentração em partículas POS por mL.
NOTA: O rendimento varia, dependendo principalmente da idade e da estirpe de porcos e vacas / tamanho dos olhos, por exemplo, uma boa preparação varia 5-8 x 10 9 a partir de POS 80 olhos de porco. - Decidir sobre o volume final de DMEM (tipicamente 10 - 20 ml) e adicionar sacarose para se obter uma concentração final de 2,5% de sacarose.
- Preparar alíquotas do tamanho desejado, por exemplo, 5 x 10 7 POS por tubo para um volume de 2 ml para a ressuspensão de 96 poços de ensaio a 40 ul / poço. Gire uma alíquota de 5 min a 2.300 xg à temperatura ambiente e avaliar o tamanho da pelota. Prepare vários tamanhos alíquotas para diferentes volumes de aplicação como POS não devem ser congeladas e descongeladas duas vezes.
- Congelar alíquotas POS a -80 ° C até à sua utilização.
NOTA: As aliquotas são estáveis durante muitos meses. Em nossas mãos, sem rótulo ou rotulados POS podem ser armazenados por pelo menos um ano.
- Ressuspender POS em 10-20 ml DMEM. Pré-diluir 10 ml em 490 DMEM ul (1:50) e contagem alongados, bem como POS girou em umcâmara de contagem celular (Figura 2B). Calcule o rendimento e concentração em partículas POS por mL.
- Rotulagem POS e alíquotas:
NOTA: De modo geral, utilizar FITC para marcar POS para a quantificação de ensaios de fagocitose, mas outros corantes podem ser usados também em função das necessidades.- Ressuspender 1 10 mg de FITC a um frasco de 2,5 mg / ml de concentração em 0,1 M de tampão de carbonato de Na de pH 9,5 por mistura de 2,6 ml de NaHCO3 0,1 M pH 8,4 com 1,4 ml de 0,1 M de Na 2 CO 3 pH de 11,5 (Quadro 2, soluções de reserva). Girar durante 1 hora à temperatura ambiente ao mesmo tempo proteger da luz e centrifugação durante 5 minutos à velocidade máxima, para sedimentar os sólidos não-FITC ressuspensas.
- Ressuspender o sedimento em 10 ml de POS de lavagem de solução de 3 (ou DMEM) e juntar 2 ml de solução de FITC para 80 olhos. Armazenar sobra FITC congelado a -80 ° C. Para rodar, pelo menos, 1,5 horas à temperatura ambiente. Proteger da luz usando papel alumínio.
- Lavar POS marcado duas vezes, utilizando solução de lavagem 3, como descrito na secção 2.3.4, em seguida, uma vez ou duas vezes em DMEM até quase nenhuma FITC livre é visto no sobrenadante frAction. Ressuspender POS em DMEM e proceder como para POS não marcado para contagem e alíquotas (seção 2.4).
- Usando POS em experiências:
- POS Thaw à RT, e mantê-los no escuro, tanto quanto possível, se eles são fluorescently marcado. Girar durante 5 minutos a 2300 xg à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante.
- Imediatamente ressuspender em volume apropriado de solução de ensaio como ditado pela experiência. Em caso de diferentes tempos de desafio POS, loja novamente suspensas no POS RT no escuro entre pontos de tempo por várias horas.
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Representative Results
A combinação do gradiente linear de sacarose e a ultracentrifugação permite a separação dos diferentes componentes da suspensão da retina por densidade. As células de RPE e detritos pesados maior da retina para afundar ou perto do fundo do gradiente (Figura 2A). Isqueiro POS e células mais leves individuais ou detritos celulares a partir da retina migram como bandas distintas para alcançar o topo da metade do gradiente até ao final do período de centrifugação. Ao manter os olhos e as amostras no escuro até depois da etapa de centrifugação, a banda contendo POS pode ser imediatamente reconhecida por sua cor laranja brilhante. A largura e a intensidade desta banda depende da qualidade do gradiente e da altura do tubo (89 mm de altura é o preferido). Normalmente, quando isolado corretamente POS deve aparecer alongada, em linha reta ou dobrado quando observado em uma lâmina de microscópio (Figura 2B). Dependendo do plano de focagem sobre o microscópio, podem aparecer tanto escuro ou brilhante. Se não resuspended corretamente, eles vão ficar em grupos. Se eles forem danificados (ver parágrafo abaixo), eles aparecerão como peças muito menor, um pouco como um fundo "empoeirado".
Problemas que podem surgir estão mais relacionadas a três questões. A primeira questão é possível que o passo de agitação dos homogenatos da retina não é suficientemente vigorosa, o que leva a POS permanecendo ligado PRs assim à diminuição de rendimento. A segunda questão está ligada à possível má fundição gradiente ou perda da qualidade de gradiente para tempo de estabilização insuficiente antes do carregamento ou tubo excessiva agitação em qualquer etapa antes da coleta. Neste caso, as bandas não podem ser adequadamente distinto e POS não pode ser coletado no tubo correspondente. Finalmente, o terceiro problema potencial surge se o pH de qualquer uma das soluções está errado: membranas POS pode desintegrar-se e apenas pequenos detritos POS aparece no microscópio quando visualizá-los para a avaliação de rendimento.
Purificada POS podeser utilizado para um número de diferentes aplicações relacionadas com o estudo da função fagocítica de células RPE. As células de RPE são geralmente utilizados como linhas celulares ou em culturas primárias a partir de modelos animais 32,6,12,18-21. Mais recentemente, as células epiteliais pigmentares derivadas de células tronco reprogramadas como iPSC ou CES foram utilizados 29,30,27,34. Isolado POS servir para testar diretamente a capacidade fagocitária de células RPE mutantes, por exemplo, POS são facilmente fagocitado por células RPE primários de camundongos selvagens, enquanto que as células de integrina beta5 e camundongos knockout MFG-E8 fagocitam menos POS na mesma quantidade de tempo 6,12. Quantificação de POS fagocitose pode ser feito através da contagem marcado com FITC POS manualmente em imagens de microscópio 6 (Figura 3A), utilizando um equipamento capaz de ler a intensidade de fluorescência 10,24,15,35 ou um citómetro de fluxo após tripsinização de células 36,27. Mais recentemente, o consumo de POS e degradação foi avaliado on immunoblots sondados para opsins 37,38,27.
In vivo, o processo de captação de POS ocorre seqüencialmente como reconhecimento / precede vinculativas sincronizados internalização 6. As diferentes fases de absorção também podem distinguir-se in vitro usando os procedimentos experimentais adequados 39. Experimentos pulse-chase pode ser realizada utilizando o interruptor de temperatura: POS ligação ocorre a 20 ° C, enquanto a internalização necessita de uma temperatura de 37 ° C para prosseguir 32,40,7. Esta distinção também existe nos macrófagos, o qual pode reconhecer POS bem e em que a maquinaria molecular para eliminar as células apoptóticas é muito semelhante à construção da EPR 7. Depois de FITC-POS fagocitose, vinculativa e internalização podem ser quantificados em amostras separadas por têmpera a FITC-fluorescência de POS ligado à superfície durante a pré-incubação com azul de tripan antes de fixar as células 10. Em células tratadas azuis-tripano, só estagiárioai POS irá ser visualizado, e PDV ligado pode ser quantificada, subtraindo POS interna a partir das contagens totais de POS de fluorescência. Quando a fagocitose é avaliada em imunoblots obtidos utilizando lisados colhidos após o desafio de POS, um tratamento equivalente, com EDTA, antes de lise vai permitir que o descolamento do POS se liga à superfície da célula para interno contra POS total de comparação fagocitose 37,38.
Grandes avanços têm sido feitos na identificação das máquinas fagocíticas, graças às experiências que empregam POS purificada. Recrutamento de proteínas pode ser avaliada por ensaios de imunofluorescência co-localização 13-15,19-21,37,41 (Figura 3B). Recrutamento ou activação de proteína pode ser validado em imunoblots após imunoprecipitação ou através da verificação de fosforilação 7,10,12-15,17,19,20,27,35,37,41 (Figura 3C). Estudos mais aberta sobre mudanças globais de expressão de genes de diferentes tempos de desafio POS têm umlso foram realizados 42.
Isolado POS também pode ser utilizado para estudar a eliminação de POS por células RPE. Com efeito, durante o envelhecimento normal e / ou quando POS não são digeridos adequadamente, produtos de degradação de POS acumulam gradualmente à medida que depósitos de lipofuscina e pode conduzir a patologias devidas a mecanismos de oxidação 24,27. Assim, a compreensão dos efeitos de luz e dano oxidativo relacionado pode exigir POS desafio de células RPE 18,26. Finalmente, com alimentação repetida normais 27 ou oxidados 25,28 POS podem ser utilizados para induzir efeitos cumulativos em células RPE em cultura, de modo a compreender os mecanismos patológicos que se desenvolvem in vivo durante longos períodos de tempo.
Figura 1. Retina isolamento olhos porcinos. Desenho mostrando as diferentes etapas da dissecção olho em ordempara coletar e homogeneizar a retina antes da etapa de ultracentrifugação em gradientes de sacarose contínuos, a partir superior esquerdo. Uma lâmina 60 milímetros de largura é utilizada para cortar o olho sequencialmente de um lado e depois para o outro, a fim de ser capaz de esticar de dentro para fora em uma ponta do dedo, expondo assim a retina. Em seguida, a retina é recolhido por desfazendo-o de tapete com a lâmina. Retinae reunidas são então agitadas cuidadosamente em tampão de homogeneização, filtrou 3 vezes através de duas camadas de gaze e delicadamente deitada no topo de 25 a linear - 60% de gradiente de sacarose.
Figura 2. POS purificação a partir de olhos de porco (A) fotografia das várias camadas observados em um 25 -. De gradiente de sacarose de 60% após ultracentrifugação de homogenatos retina. A banda de laranja corresponde ao POS para ser coletado. Os corresponde banda superior brancopara materiais não-POS relacionadas, bem como maior migração de detritos perto ou na parte inferior do tubo. (B) Imagem de isolado POS como observado em um microscópio de campo claro em uma célula de contagem para a avaliação de rendimento. POS existir em alongada (a, a ', c, d) e girou (a, a' formas, d, b, b '). Alguns POS alongado pode exibir uma extremidade enrolada (c). Ao alterar o plano de foco, POS turnos aparência de brilhante para escuro (compare e a ', b e b'). Painel e ilustra POS que não foram novamente suspensas corretamente e residir em aglomerados. Painel f mostra POS que foram danificados e não são utilizáveis, apenas pequenas peças são detectáveis. Escala de 10 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figoure 3. Análise de fagocitose EPR usando POS purificada. (A) imagem de microscópio confocal e correspondente quantificação do número de fagossomas por célula com o tempo, mostrando que marcado com FITC POS (verde) foram menos fagocitose por células primárias isoladas de RPE beta5 integrina nocaute (β5 - / -) em comparação com ratinhos de tipo selvagem (wt ou β5 + / +) de controlo, como indicado. Núcleos (vermelho) foram rotulados com DAPI e junções celulares (azul), utilizando o marcador junção apertado ZO-1. Barras de escala 10? M. . Reproduzido da © nandrot et al, 2004, publicado originalmente em The Journal of Experimental Medicine 200 (12): 1539-1545. (B) imagens de microscópio confocal mostrando co-localização (amarelo-magenta, painel inferior direito) entre proteínas β5 GFP-fusão (verde, o painel superior esquerdo), aVp5 superfície integrina receptores (vermelhas, painel superior direito) e POS (azul, fundopainel da esquerda). Barra de escala 10? M. . Reproduzido da nandrot et al, 2012, originalmente publicado em Biology of the Cell 104 (6): 326-341, © Portland Press Limited. (C) As imunotransferências (WB) e correspondente quantificação (quantif.) Mostrando que desafio POS (POS) aumenta a fosforilação de FAK em Tyr397 o resíduo quando comparadas sem tratamento (/) ou estimuladas com meio sozinho (m) em células de controlo (c) enquanto que as células que expressam uma forma inactivada de FAK (F) não reagem, como indicado. Reproduzido de Finnemann de 2003, publicado originalmente em EMBO Journal 22 (16):. 4143-4154 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specific Material/Equipment | |||
| 2 Chamber gradient maker | Gradient maker with 30 ml chambers | ||
| 3 mm diameter silicone tubing | tubing for gradient casting | ||
| Small size magnetic stir bar | Stir bar fitting the gradient maker chamber | ||
| Red safelight lamp | Inactinic lamp for dissection in the dark | ||
| Ultra Clear 25 x 89 cm tubes | Beckman | 344058 | Ultracentrifugation tubes |
| PP Oak Ridge tubes | Nalgene | 3119-0050 | 30 ml centrifugation tubes |
| Optima LE-80K | Beckman Coulter | 365668 | Ultracentrifuge |
| SW 32Ti swing rotor | Beckman Coulter | 369694 | Swing rotor for ultracentrifuge |
| Avanti J-26 XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge |
| JA-25.50 rotor | Beckman Coulter | 363058 | Rotor for Avanti J-26 XP centrifuge |
| FITC Isomer I | Life Technologies | F-1906 | Fluorescent dye |
| Other Material/Equipment | |||
| Counting chamber (such as Neubauer or Malassez) | |||
| Dark ice buckets with lids | |||
| Scales | |||
| Magnetic stirrer and upholding pole | |||
| Refrigated microcentrifuge | |||
| 37 °C water bath | |||
| -80 °C freezer | |||
| Consumables | |||
| Labcoat | Health and safety | ||
| Gloves | |||
| Sleeve protectors | |||
| Goggles | |||
| Absorbent pads | |||
| Biohazard trash bags and bins | |||
| Weck-Prep blades | Dissection | 60 mm/2.25 inch wide razor blades | |
| 15 cm plastic dish | |||
| Sterile gauze sheets | |||
| 15 and 50 ml tubes | Common consumables | ||
| Microtubes | |||
| Aluminum foil | |||
References
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