Protocol
1.代OVCAR-3人卵巢癌细胞的稳定转导与慢病毒包含SOX2调控区记者构造
- 产生的慢病毒颗粒转染与报道构建识别SOX2调节区如所述10,21的HEK 293T包装细胞系。
注：记者进一步构建包含ProteoTuner盾系统的不稳定领域领先tdTomato荧光蛋白质。 Shield1结合不稳定域，从而防止蛋白酶体降解的荧光蛋白22。 - 转导OVCAR-3细胞在24小时的时间段的慢病毒颗粒。之后，去除病毒上清并洗涤细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），培养在完全培养基（RPMI补加了10％FBS，100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素）。
- 48小时后，10微克/毫升PURO霉素加入到该培养物，并保持5天，以允许选择正确的转导的细胞。
2.准备细胞分选和镀
- 添加Shield1 1：之前的细胞分选1000稀释24小时。使用稳定转导OVCAR-3细胞，而不Shield1治疗作为阴性对照（ 图1）。从烧瓶中吸出培养基，洗涤细胞用1×PBS和trypsinize细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行3分钟。
- 停止胰蛋白酶通过使用完全培养基（见上），计数细胞数，离心细胞，在300×g离心在RT（15 - 25℃）5分钟。
- 倒出上清和悬浮细胞仔细0.5 - 1毫升无菌PBS。
- 使用40微米的细胞滤网过滤帽，以获得单细胞悬浮液。
- 调整细胞计数到每毫升500万细胞。
- 制备超低附件96孔板用100μl球体介质（MEGM补充有生长因子，细胞因子，和补充剂，B-27，肝素钠;或DMEM / F12补充有生长因子，细胞因子，和补充剂，B-27，肝素-钠加入或不加入1％甲基纤维素，也见表1）。任选添加抗生素的培养基中以100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素的浓度，以减少可能的污染的风险。
- 排序RFP +和RFP-细胞进入准备96孔板从上面，每孔1细胞（单细胞系球法）和每孔，分别为100细胞（多基于细胞球试验）。进行排序市售细胞分选仪（见材料 ），使用单节电池模式，排序设置：100μ喷嘴，护套的压力20磅，和产量面膜0，纯度面膜32，相位掩模16。
- 评估通过显微镜得分含有细胞（对于单基于细胞的测定）的孔并通过在各孔计数的细胞数（对于多基于细胞的测定电镀效率; 图2
- 孵育在球体标准条件下培养基的细胞（对于组合物见步骤2.6）在37℃和5％的CO 2。补充每日的bFGF（20毫微克/毫升）和表皮生长因子（20毫微克/毫升）。
- 一周后，计数使用标准显微镜4X或10X放大率和荧光显微镜检测从综合报告系统的荧光信号出现肿瘤球体的数目。算球体与直径超过100微米的为“大”的球，并且球体，直径50 - 100微米为“小”球（ 图3）。要确保你算真正的球体，而不是细胞群。
注：在单细胞分析领域形成更容易后10（比7）天文化对微观得分。 - 计算球形成细胞中的RFP +和分别RFP-细胞单基于细胞的试验（1 96孔板的每个个体实验）或多细胞-BA的比例SED球体测定（1以及为每个单独的实验），为呈现由Shaw 等人。16
注：球形成细胞（％）=（球数）/（接种的细胞数）的比例×100
球3.连续传代
- 放置的各孔在适当的无菌管中并离心含量在300×g离心在室温10分钟。对于多基于细胞球试验，收集从一个很好的球在一起。用PBS离心2分钟长5倍 - 洗井3。对于单细胞为基础的球试验，收集各个领域。由于低数量的细胞，可使用1.5毫升管离心和洗涤步骤。
- 在200微升0.05％胰蛋白酶EDTA去除上清，重悬沉淀。
- 为了达到最佳的细胞分离，培养的细胞悬浮液，在37℃下进行5分钟，在软摇床。优化胰蛋白酶消化时间为您的细胞系，以更低的细胞死亡率：如果没有大球体是轻轻用100微升枪头可见磨碎。在的情况下的大球仍然存在，孵育胰酶另外3分钟，然后进行研磨步骤。情况下的单细胞分析确认，以优化的时间的活细胞中的胰蛋白酶消化步骤最佳细胞产量。
- 以灭活胰蛋白酶，加入500微升完全培养基中，并离心，在300×g离心10分钟，在单细胞测定法，离心额外2分钟的情况。
- 在球体中小心取出上清和悬浮细胞。
- 使用一个40微米的细胞滤网过滤帽，以获得单细胞悬浮液。
- 在使用RFP +和RFP-细胞在多细胞bassed测定的情况下，通过流式细胞仪分析评估的荧光细胞的百分比在每个后良好的再悬浮。
- 对单个细胞的串行replating测定法，种子，每孔1细胞到一个新的超低附件96孔板制备如上详述。从一个单独的领域，种子大约20个人口井。对于多单元基于初级球体replating测定法，从初级球体的一个孔获得的种子细胞到新的96孔板中。第二天用显微镜计数细胞数。
- 评估球形成细胞中利用在步骤2.11中所述的式次级球测定的比例。
4.结果分析
- 分析来自于独立一式三份进行的实验的结果，并使用双面学生t检验来分析正态分布的值和以其他方式采用Mann-Whitney-测试进行统计分析。
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Representative Results
在常规球测定中，近40％的RFP + OVCAR-3细胞与RFP-细胞的20％就产生了一个单独的肿瘤球在初级球体测定（ 图4A）。此外，通过RFP +细胞形成球在大小上比由RFP-细胞形成的要大。
当在单一的基于细胞的测定法镀，RFP +细胞也形成为比RFP-细胞更球体，证实上述结果。不过，由于是朝向产生较少球体每镀在单相对于多基于细胞的测定（ 图4A，B）中的倾向，这表明在该测定中球形成可通过技术工件如机械球形聚变或解离被偏置在非贴壁培养介质。
为了进一步探讨这些方面，我们比较细胞接种密度对球形成的影响。我们在96采用镀有限稀释细胞1000细胞每孔1单元- 嗯板，发现新兴领域的数字分别为高度依赖于最初铺板细胞的数目。令人惊奇的是，更高的数字球体从铺板细胞既MGEM和DMEM / F12基础培养基中较低的数字进行计数，这表明确实电镀方式高度偏差的结果在该试验中（ 图5）。相反，当细胞通过加入1％甲基纤维素于DMEM / F12基于球体固定介质23,24的球形成的效率主要是独立的细胞密度。
探索对CSC性质球体培养条件的影响，我们分析了细胞后第7天的潜伏期，在球测定的表达红色荧光信号的百分比。我们发现，在多细胞系球体培养后培养物（ 图6A）的七天RFP +球体的细胞的大约35％的失去了红色荧光信号，这表明它们具有期大学生1分化，而65％的保持的RFP +信号用提示的自我更新能力。与此相反，从最初RFP-细胞产生的球体细胞仍然RFP阴性（ 图6A），这表明它们不能重新建立在这些条件下的干细胞的潜力。
从单个细胞生成领域进行荧光显微镜证实这些结果显示，单球源性RFP +细胞同时含有RFP +和RFP-细胞的同时，从RFP-细胞的领域仍然是负的红色信号。
类似的结果，观察在由这两个条件replating测定。
图1.工作流的慢病毒转导，选择和排序RFP +和RFP-细胞。慢病毒转导和积极的选择之后经由嘌呤曝光，RFP-以及RPF +细胞成功转导的细胞通过FACS分类成96孔板球形介质的各个孔中。对于多细胞系球体测定，100个细胞被放入一个阱。电镀效率由排序后进行显微镜评估。球被打进后显微镜七到十天，分离成单个细胞，通过流式细胞仪分析，再接种到二级领域。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.影像排序RFP +和RFP-细胞后镀。单RFP +和RFP-细胞分类到每个孔中的一个96孔板为正确电镀用（荧光）显微镜分析。w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
后七至十天的球体形成在单个基于细胞的测定图3.分析。球体的形成进行了分析。 （A）大（直径> 100微米）及（B）小（直径50 - 100微米）。球是有区别的微观基础上的大小，请点击这里查看该图的放大版本。
图4.效率肿瘤球体从RFP形成+和RFP- OVCAR-3细胞原发性和继发性球的效率，从OVCAR-3多细胞与单细胞基于球体的检测。作为对比测定多（A）与单细胞为基础的领域分析（B）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图5.细胞铺板密度强烈影响球计数从OVCAR-3细胞中在液体执行多基于细胞的测定法领域，但不是在甲基纤维素补充培养物。使用不同的细胞密度和生长培养基已经在文献中报道为卵巢癌球体检测。分析由这些变量可能引入的偏差，将细胞铺板在各色在200微升不同领域的文化传媒（MGEM，DMEM / F12与详见协议部分或全部补充DMEM / F12含1％甲基纤维素所有补充剂）和球体形成打进7天后NT密度（A） 。示于（B）是细胞铺板在电镀中的DMEM / F12之后拍摄1天不同密度的显微镜照片球体培养基而不甲基纤维素。注意，信元簇新兴在高细胞密度，而不是单细胞见于低密度板。比例尺的图片：50微米请点击此处查看该图的放大版本。
RFP分析，从RFP +和respectiv形成肿瘤球信号图6.伊利RFP- OVCAR-3细胞（A） 的流式细胞术分析中，从RFP +和RFP-细胞衍生离解的球体的RFP信号（多基于细胞球试验）。从RFP +和RFP-细胞（单细胞系球试验）衍生球（B）的显微镜揭示了在从RFP衍生球体异构RFP +信号，但不是从RFP-细胞。照片拍摄于7天的传统领域和10日的单细胞为基础的球体检测。请注意，从RFP +推测肿瘤干细胞衍生的球体较大的尺寸。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 人类卵巢癌细胞源 | 基本培养基 | 拾遗 | 作者 |
| OVCAR-3，CAOV-3，主材料 | MEGM | 20纳克/毫升rEGF，20毫微克/毫升的bFGF，B-27，4微克/毫升肝素，氢化可的松，胰岛素（SingleQuot套件） | 巴雷斯等。 |
| SKOV3 | 的DMEM / F12 | 5微克/毫升的胰岛素，10纳克/毫升rEGF，10纳克/ ml的bFGF，12纳克/毫升的LIF，0.3％BSA的 | 黎呒啊等。 |
| A2780 | 的DMEM / F12 | 5微克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，2％的B-27，0.4％BSA的 | 海维Wang 等人。 |
| SKOV3 | 的DMEM / F12 | 5微克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，10纳克/ ml的bFGF，2％的B-27，1毫微克/ ml氢化可的松 | 永芮顿等人。 |
| A2780，主要材料 | 的DMEM / F12 | 5微克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，10纳克/ ml的bFGF，0.4％BSA的 | T. Xiang 等。 |
| 主要材料 | 的DMEM / F12 > | 5微克/毫升的胰岛素，10纳克/毫升rEGF，10纳克/ ml的bFGF，12纳克/毫升的LIF，0.3％BSA的 | 碲Liu等 |
| MLS | 的DMEM / F12 | 10纳克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，20纳克/ ml的bFGF，2％的B-27 | Soritau 等 。 |
| 3AO | 的DMEM / F12 | 1mg / ml的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，20纳克/ ml的bFGF，2％的B-27 | MF石等。 |
| 主要材料 | 的DMEM / F12 | 5微克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF，10纳克/ ml的bFGF，0.4％BSA的 | 数丈等。 |
| 主要材料 | EBM-2或X-VIVO | 5微克/毫升的胰岛素，20纳克/毫升rEGF | 伊洛娜Kryczek 等。 |
| OVCAR-3 | MEGM | 20纳克/毫升rEGF，20毫微克/毫升的bFGF，B-27，4μg/ mL的肝素 | 东明Liang 等。 |
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Discussion
球体培养物是一种广泛使用的方法，以测定癌症干细胞潜能，并在广泛的人类肿瘤细胞15,25,26的富集干细胞样细胞。在这些培养条件下，缺乏自我更新能力的癌细胞预期分化并最终发生细胞死亡。尽管它们可能最初形成细胞团，甚至肿瘤球特别是在主试验中，它们不能够维持在串行replating球体形成能力因缺乏自我更新的特性。球形检测作为替代试验，以确定肿瘤干细胞，并评估其在整个肿瘤细胞群的频率。
然而，大量的变异性，可以球体测定之间不同以下公布的协议5,10,27-35（ 表1）的观察进行的。在我们的实验室，我们以前出版领域形成使用MEGM人类卵巢癌细胞辅以B-27和bFGF，肝素和SingleQuot TM（含胰岛素，rEGF和氢化可的松）。其他实验室使用全DMEM / F12中，而一些只添加B-27和rEGF。在这份报告中，在OVCAR-3细胞的多细胞系球体测定法来执行，因此使用不同的条件。使用MEGM或DMEM / F12与球形成无显著差异，观察在这些细胞中（ 图5A）的所有补充剂。此外，一些实验室已经推测EGF和FGF可以是快速降解和已建立的方案每日添加这些生长因子在培养基中。因此，我们比较了在其中的EGF和FGF才被加入的球体测定每日加成的EGF和FGF向细胞培养之初的培养基进行球体测定法，我们发现这些测定，得到的结果等效于OVCAR-3细胞（数据未显示），这表明了昂贵和费力的每日补充EGF和FGF可能并不总是必要的。不管这些结果适用于细胞从其他卵巢癌的细胞系或原始样品，或在不同的实验条件下仍有待确定。
然而，我们在由另一个测试变量，细胞铺板密度引入打进球体的数目观察到实质性的偏差。出人意料的是，井接种细胞数量低具有较高的号码球。通过1％的甲基纤维素限制性细胞迁移导致的球形成的，独立于最初铺板细胞的数目相同的效率。这些结果表明，细胞聚集和球形聚变或分解可发生改变球的数字，并导致不准确的结果中的多细胞系球体测定。当细胞以合适的密度，多基于细胞的测定但是导致的结果，而可比收集在单个细胞系球体测定数据（ 图4）。为了进一步探讨这些结果，我们比较单一和多细胞为基础的使用卵巢癌细胞分成公认的肿瘤干细胞通过一个SOX2监管区域10最近公布的慢病毒表达RFP报告系统检测。事实上，这两个测定法证实RFP的增强初级和次级领域形成能力+与RFP-细胞（ 图4A，B）。重要的是，更高的数字从RFP +细胞中观察到球的人不会因SOX2表达细胞更高的增殖能力（数据未示出），这是在与先前的结果表明诱导SOX2的线推动球的形成和在体内致瘤性不加速细胞周期进程10。
两者合计，单细胞系球体测定是更费力和昂贵的，但它们会导致更准确的数据，这也是由实验结果之间的更高的再现性确认。由于电镀密度高的影响导致的多细胞浅编悬浮球体测定，需要用于测定使用这些测定球体形成之前每个单独的肿瘤细胞类型的足够铺板密度前期滴定。可替代地，更准确的单细胞分析可用于前期，或甲基纤维素补充通过减少机械的工件，以提高结果的准确性。如果球的形成条件之间进行比较，其中所述的遗传修饰或药物治疗可能会严重地改变细胞的活力，从而降低细胞密度，单细胞系球体测定法可以是强制性的，以避免假阳性结果。
总之，合适的实验条件下，无论是多细胞系球体测定和单细胞系球体法是能够指示不同的细胞群（干和非干细胞）之间球面电位差。然而，这通常是在液体培养基中进行多个小区为基础的球测定更容易受到以电子邮件rrors通过电镀密度实验设计介绍。甲基纤维素（1％），以多基于细胞的测定的补充可以限制细胞聚集和球形聚变相关构件。根据这些数据，我们建议要执行的单细胞系球体测定除非详细滴定分析已经进行的实验条件的前期和负面影响对细胞活力，从而细胞密度已被排除。然而，单细胞系球体测定是更费力的，更昂贵，并且可能不需要在每个实验设置。甲基纤维素补充的多细胞系球体测定可代表在一些实验设置另一种选择。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
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