Protocol
1. דור של תאי השחלה אדם OVCAR-3 Carcinoma transduced ביציבות עם Lentiviruses מכיל לבנות כתב Sox2 התקינה האזור
- ליצור חלקיקי lentiviral על ידי transfecting קו תא 293T-אריזת HEK עם לבנות כתב הכרת אזור רגולציה Sox2 כ10,21 תיארו.
הערה: הכתב לבנות עוד מכיל תחום יציבות של מערכת חומת ProteoTuner לפני חלבון פלואורסצנטי tdTomato. Shield1 נקשר לתחום היציבות ובכך למנוע פרוטאזום להשפיל חלבון פלואורסצנטי 22. - Transduce OVCAR-3 תאים עם חלקיקי lentiviral על פני תקופה של 24 שעות זמן. לאחר מכן, להסיר את supernatant ויראלי ולשטוף את התאים עם ופר פוספט (PBS) ותרבית בינונית שלם (RPMI בתוספת 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין).
- 48 שעות מאוחר יותר, 10 מיקרוגרם / מיליליטר פורmycin נוספו לתרבויות ונשמר במשך 5 ימים, כדי לאפשר בחירה של תאי transduced כראוי.
2. הכנת Cell המיון והציפוי
- להוסיף Shield1 ב 1: 1000 שעות דילול 24 לפני מיון תא. השתמש OVCAR-3 תאי transduced ביציבות ללא טיפול Shield1 כפקדים שליליים (איור 1). תקשורת לשאוב מבקבוק, לשטוף תאים עם 1x PBS וtrypsinize תאים עם 0.05% טריפסין- EDTA במשך 3 דקות.
- להפסיק טריפסין באמצעות מדיום מלא (ראה לעיל), לספור מספרי תא, תאי צנטריפוגות ב 300 XG ב RT (15 - 25 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.
- למזוג supernatant ותאי resuspend בזהירות ב 0.5 - PBS סטרילי 1 מיליליטר.
- השתמש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג השעיה תא בודד.
- התאם ספירת תאים 5 מיליון תאים לכל מיליליטר.
- הכן 96-גם צלחות נמוכות מצורפים אולטרה עם 100 μl הישות הזכרית והנקביות בינוניים (MEGM בתוספת גורמי גדילה, ציטוקינים, ותוספי מזון,B-27, heparine-נתרן; או DMEM / F12 בתוספת גורמי גדילה, ציטוקינים, ותוספי מזון, B-27, heparine-נתרן, עם או בלי תוספת של 1% methylcellulose, ראה גם לוח 1). לחלופין להוסיף אנטיביוטיקה למדיום בריכוז של 100 U פניצילין מיליליטר / 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין כדי למזער את הסיכון לזיהום אפשרי.
- מיין + RFP ותאי RFP- ל96-גם צלחות שהוכנו מלמעלה, תא 1 בכל טוב (assay מבוסס תאים בודדים תחומים) וכל גם 100 תאים (assay תחומים מבוססי תאים רב), בהתאמה. בצע סדרן תא מין על זמין מסחרי (ראה חומרים) שימוש במצב תא בודד, מיין התקנה: 100 μ זרבובית, לחץ נדן 20 psi, ומסכת תשואת 0, מסכת טוהר 32, מסכת שלב 16.
- להעריך את היעילות על ידי ציפוי מיקרוסקופי הבקיע בארות המכילות תאים (עבור assay מבוסס התאים הבודד) ועל ידי ספירת מספר תאים בבארות בודדות (לassay מבוסס תאים הרב; איור 2
- דגירה תאים בתנאים סטנדרטיים בתחומים בינוניים (להרכב ראה שלב 2.6) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. להשלים bFGF היומי (20 ng / ml) וEGF (מיליליטר / 20 ng).
- אחרי שבוע אחד, לספור מספרים של מתעוררים תחומי גידול באמצעות מיקרוסקופ רגיל עם הגדלה 4X או 10X ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות אותות הקרינה ממערכת הכתב המשולבת. רוזן התחומים בקוטר העולה על כתחומים "גדולים" 100 מיקרומטר, ותחומים בקוטר 100 - 50 כתחומים "קטנים" מיקרומטר (איור 3). להיות בטוח שאתה לספור תחומים אמיתיים ולא תא אשכולות.
הערה: במבחנים מבוססי תאים בודדים היווצרות כדור קלה יותר להבקיע מיקרוסקופי לאחר 10 (לעומת 7) ימים של התרבות. - חשב את חלקם של תאי יוצרי כדור ב+ RFP ותאי בהתאמה RFP- במבחנים מבוססי תאים בודדים (96-גם צלחת אחת לכל ניסוי בודד) או תא-ba הרבמבחני SED תחומים (טוב אחד עבור כל ניסוי בודד) כפי שהוצג על ידי et al שו. 16
הערה: חלקם של תאי תחום יצירה (%) = (מספר תחומים) / (מספר תאי זרע) x 100
3. Passaging הסידורי של Spheres
- הנח את התוכן של כל אחד גם בצינור סטרילי מתאים וצנטריפוגות ב XG 300 עבור 10 דקות ב RT. עבור מבחני מבוססי תאים רב התחומים, לאסוף יחד את התחומים מאחד גם. לשטוף היטב 3-5 פעמים עם PBS ו צנטריפוגות 2 דקות יותר. עבור מבחני מבוססי תאים בודדים תחומים, לאסוף כדורים בודדים. לאור המספרים הנמוכים של תאים, להשתמש צינורות 1.5 מיליליטר לצעדי צנטריפוגה וכביסה.
- הסר supernatant וגלול גלול ב200 μl של 0.05% טריפסין- EDTA.
- על מנת להשיג הפרדת תא אופטימלית, דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בייקרו רך. לייעל trypsinization זמן לקו הסלולרי שלך לשיעור מוות של תאים תחתון: אם לא גדולהתחומים הוא triturate הגלוי בעדינות באמצעות קצה פיפטה 100 μl. במקרה תחומים גדולים עדיין קיימים, דגירה עם טריפסין עוד 3 דקות ולאחר מכן להמשיך לשלב טחינה דקה. במקרה של יחיד מבחני מבוססי תאים לוודא כדי לייעל את הזמן לתשואת תא אופטימלי של תאי חיים במהלך שלב trypsinization.
- כדי להשבית טריפסין, להוסיף 500 μl בינוני ו צנטריפוגות מלאים ב XG 300 במשך 10 דקות, במקרה של מבחני תא בודדים, צנטריפוגות במשך 2 דקות נוספות.
- הסרת תאי supernatant ו resuspend בזהירות במדיום תחומים.
- שימוש במסנן כובע מסננת תא 40 מיקרומטר לקבל השעיה תא בודד.
- במקרה של שימוש ב+ RFP ותאי RFP- במבחנים-bassed תא רב, להעריך את אחוז תאי ניאון בכל אחד גם לאחר resuspension באמצעות cytometer זרימת הניתוח.
- עבור מבחני סידוריים replating של תאים בודדים, זרע תא 1 לכל גם לתוך צלחת אולטרה חדשה נמוכה מצורף 96-גם הכינו כמפורט לעיל. מכדור אחד בודד, זרע כ 20 בארות בודדות. עבור מבחני replating תחומים עיקריים המבוסס על תאים רב, תאי זרע המתקבלים מכן אחד מתחומים עיקריים לצלחת 96-היטב חדשה ולספור את מספר התאים למחרת על ידי מיקרוסקופ.
- להעריך את חלקם של תאי יוצרי כדור במבחני תחומים משניים באמצעות הנוסחא המתוארת בשלב 2.11.
ניתוח 4. תוצאה
- לנתח את התוצאות מניסויים שבוצעו בtriplicates העצמאי ולהשתמש במבחן t דו-צדדי לנתח ערכים מתפלגים נורמלי ואחר Mann-Whitney-בדיקות לניתוח סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במבחני התחומים קונבנציונליים, כמעט 40% מRFP + OVCAR-3 תאים לעומת 20% מתאי RFP- הולידו תחום גידול בודד בassay תחומים העיקרי (איור 4 א). יתר על כן, תחומים שהוקמו על ידי RFP + תאים היו גדולים יותר בגודל יותר מאלה שהוקמו על ידי תאי RFP-.
כאשר מצופים במבחנים מבוססי תאים בודדים, תאי RFP + גם יצרו יותר תחומים מאשר תאי RFP-, המאשרים את התוצאות לעיל. עם זאת, הייתה נטייה לכיוון הדור של פחות התחומים למצופים בבודד לעומת assay מבוסס תאים הרב (איור 4 א ', ב'), מצביע על כך שבהיווצרות כדור assay זה עלול להיות מוטה דרך חפצים טכניים כגון היתוך תחום מכאני או ניתוק במדיום התרבות שאינה חסיד.
כדי להמשיך לחקור היבטים אלה, השווינו את ההשפעה של צפיפות ציפוי תא על היווצרות תחומים. אנו מצופים תאים באמצעות דילול מגביל מ1,000 תאים לתא 1 לכל גם ב 96צלחות "טוב ומצאו כי מספרם של התחומים מתפתחים היו תלויים מאוד במספרם של תאים בתחילה מצופים. באופן מפתיע, מספרים גבוהים יותר של תחומים נספרו ממספרים נמוכים של תאים מצופים בשני MGEM וDMEM / מדיה מבוססת-F12, הוכחה כי אכן שיטות ציפוי מאוד תוצאות הטיה בassay זה (איור 5). לעומת זאת, כאשר תאים היו משותקים על ידי הוספת methylcellulose 1% ל/ תחומים המבוסס על F12 DMEM בינוני 23,24 היעילות של היווצרות כדור הייתה עצמאית בעיקר של צפיפות תאים.
כדי לחקור את ההשפעה של תנאי תרבות תחומים על נכסי CSC, נתחנו את אחוז התאים לבטא אות הקרינה אדומה לאחר 7 ימים של דגירה בassay תחומים. מצאנו כי בתרבויות המבוססים על תאים רב התחומים כ -35% מהתאים מRFP + תחומים איבדו אות הקרינה האדומה שלהם לאחר שבעה ימים של התרבות (איור 6 א), המצביע על כך שיש להם undergבידול אחד, ואילו 65% שמרו על RFP + אות המצביע על יכולת התחדשות עצמית. בניגוד לכך, תאים מתחומים שנוצרו מהתאים בתחילה RFP- נותרו שלילי RFP (איור 6 א), מצביעים על כך שהם לא יכולים להקים מחדש את הפוטנציאל של תאי גזע בתנאים אלה.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוצע על תחומים שנוצרו מהתאים בודדים אישר תוצאות אלו מראה כי התחומים בודדים נגזרים RFP + תאים הכילו שני + RFP ותאי RFP- בעוד תחומים שמקורם בתאי RFP- נותרו שליליים לאות האדומה.
תוצאות דומות נצפו במבחני replating משני התנאים.
איור 1. Workflow של התמרה, בחירה ומיון של lentiviral + RFP ותאי RFP-. לאחר התמרה lentiviral וסלקציה חיובית של תאי transduced בהצלחה באמצעות חשיפת puromycin, RFP- ותאי RPF + מסודרים על ידי FACS לתוך בארות בודדות של צלחת 96-היטב במדיום תחומים. עבור מבחני מבוססי תאים רב התחומים, 100 תאים ממוקמים לתוך אחד היטב. יעילות ציפוי מוערכת על ידי מיקרוסקופ שבוצע לאחר המיון. התחומים הובקעו על ידי מיקרוסקופ לאחר שבוע עד עשרה ימים, ניתקו לתוך תאים בודדים, ניתחו באמצעות הזרימה cytometry וreplated לתחומים משניים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הדמיה 2. איור של + RFP ממוין ותאי RFP- לאחר. RFP ציפוי יחיד + ותאי RFP- מסודרים לבאר כל צלחת 96-היטב מנותחות לציפוי נכון באמצעות מיקרוסקופ (ניאון)."Target =" w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
היווצרות איור 3. ניתוח של היווצרות התחומים במבחנים מבוסס תאים בודדים. Spheres מנותח לאחר שבוע עד עשרה ימים. גדול (קוטר> 100 מיקרומטר) (א) וקטן (בקוטר 100 - 50 מיקרומטר) (ב). התחומים נבדלים מבוססים על גודל מיקרוסקופי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יעיל איור 4. גידול של תחומי יצירה מRFP +וRFP- OVCAR-3 תאים ברב לעומת מבחני תחומים תא בודד מבוססים. השוואה של יעילות תחום ראשית ומשנית מOVCAR-3 תאים כassayed ברב () לעומת מבחני יחידים מבוסס תאי תחומים (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
צפיפות ציפוי 5. תא איור מאוד תחום השפעות סופרת מOVCAR-3 תאים בתחומי assay מבוססי תאים הרב שבוצע בנוזל, אך לא בתרבויות methylcellulose תוספת. שימוש בצפיפות תא שונה ותקשורת צמיחה כבר דווחה בספרות לסרטן השחלות תחומי מבחני. כדי לנתח הטיות אפשריות שהוצגו על ידי המשתנים הללו, תאים מצופה בdiffereצפיפויות NT ב200 μl של תקשורת בתרבות תחומים שונה (MGEM, DMEM / F12 עם כל התוספים כמפורט בסעיף הפרוטוקול, או DMEM / F12 עם כל התוספים ומכילים 1% methylcellulose) והיווצרות כדור הוא הבקיע לאחר 7 ימים () . מוצג (B) תמונות מיקרוסקופית של תאים מצופים בצפיפויות שונות לקחו יום אחד לאחר ציפוי בDMEM / F12 תחומי תרבות בינונית ללא methylcellulose. שים לב לצבירי התאים המתעוררים בצפיפות גבוהה סלולרית בניגוד לתאים בודדים ראו בצלחות בצפיפות נמוכות. בר סולם לתמונות:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. ניתוח של RFP אות בתחומים גידול שנוצרה מ+ RFP וrespectivאיליי RFP- OVCAR-3 תאים () Cytometry זרימת הניתוח לאות RFP בתחומים ניתק שמקורם בתאים + RFP וRFP- (assay תחומים מבוססי תאים רב).; (ב) מיקרוסקופית של תחומים הנגזרים מ+ RFP ותאי RFP- (assay תחומים מבוסס תא בודד) מגלה אות הטרוגנית RFP בתחומים הנגזרים מRFP + אבל לא מתאי RFP-. תמונות צולמו ביום 7 לתחומים קונבנציונליים ויום 10 למבחני תחום המבוסס על תא בודדים. שים לב לגודל הגדול יותר של תחומים הנגזרים מCSCS RFP + המשוער. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מקור תאי סרטן השחלות אדם | בינוני בסיסי | תוספי | מחברים |
| , חומר עיקרי OVCAR-3, Caov-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 bFGF מיליליטר / ng, B-27, 4 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, הידרוקורטיזון, אינסולין (ערכת SingleQuot) | BAREISS et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, ng 12 / מיליליטר LIF, BSA 0.3% | Li מא et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | אינסולין / מיליליטר 5 מיקרוגרם, 20 ng / ml rEGF, 2%, BSA 0.4% B-27 | Haiwei ואנג et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 2% ng 1 / הידרוקורטיזון מיליליטר B-27, | יונג-רוי Du et al. |
| A2780, חומר עיקרי | DMEM / F12 | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, BSA 0.4% | ט יאנג et al. |
| חומר עיקרי | DMEM / F12 > | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, ng 12 / מיליליטר LIF, BSA 0.3% | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml אינסולין, 20 ng / ml rEGF, 20 bFGF מיליליטר / ng, 2% B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 מ"ג / מיליליטר אינסולין, 20 ng / ml rEGF, 20 bFGF מיליליטר / ng, 2% B-27 | MF שי et al. |
| חומר עיקרי | DMEM / F12 | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, BSA 0.4% | שו ג'אנג et al. |
| חומר עיקרי | EBM-2 או X-VIVO | 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 20 ng / ml rEGF | אילונה Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 מיקרוגרם / מ"ל הפרין | Dongming יאנג et al. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרבויות תחומים הן שיטה נפוצה לassay תא גזע סרטני פוטנציאלי ולהעשיר לתאי גזע כמו-במגוון רחב של תאים סרטניים אנושיים 15,25,26. בתנאים אלה התרבות, תאי סרטן שאין יכולת התחדשות עצמית צפויים לבדל וסופו של דבר לעבור מוות של תאים. למרות שהם עשויים בתחילה יוצרים צבירי תאים או אפילו תחומים גידול במיוחד במבחנים ראשוניים, הם לא יוכלו לקיים את היכולת להרכיב תחום על replating הסידורי בשל חוסר תכונות עצמי חידוש. מבחני Spheres משמשים כפונדקאיים מבחני לזהות ולהעריך CSCS תדירותם באוכלוסיות תאי גידול כולו.
עם זאת, שונות משמעותי ניתן להבחין בין מבחני שבוצעו התחומים הבאים פרוטוקולים שפורסמו שונים 5,10,27-35 (טבלה 1). במעבדה שלנו, יש לנו פרסמתי היווצרות כדור בעבר מהתאים אנושי השחלות קרצינומה באמצעות MEGM בתוספת B-27, BFGF, הפרין וSingleQuot TM (המכיל אינסולין, rEGF והידרוקורטיזון). מעבדות אחרות משתמשות DMEM / F12 בינוני שלם, וחלקם רק להוסיף B-27 וrEGF. בדוח זה, assay תחומים מבוססי תאים רב בOVCAR-3 תאים לכן מבוצע באמצעות תנאים שונים. באמצעות MEGM או DMEM / F12 עם כל התוספים לא נמצאות הבדל משמעותי בהיווצרות כדור נצפה בתאים אלה (איור 5 א). בנוסף, חלק מהמעבדות העריכו כי EGF וFGF עשוי להיות מושפלים במהירות ובהקימו פרוטוקולי הוספת גורמי גדילה אלה יומיים למדיום. לפיכך, אנו לעומת תחומים מבחני שבוצעו במדיום שבי EGF וFGF נוספו רק בתחילת מבחני תחומים עם תוספת יומית של EGF וFGF לתרבית התאים, ואנו מוצאים את מבחני אלה כדי להניב תוצאות מקבילות בתאי OVCAR-3 (מידע לא מוצג), טוען כי התוספים יומיים היקרים ומייגעים עם EGF וFGF לא תמיד הכרחיים. אם תוצאות אלהחלים על תאים משורות תאי סרטן השחלות אחרות או דוגמאות עיקריות, או בתנאי ניסוי שונים עדיין לא נקבע.
עם זאת, אנו נצפו הטיה משמעותית במספרם של תחומי הבקיע הוצגו על ידי אחרת משתנים נבדק, צפיפות ציפוי תא. באופן מפתיע, בארות זרע עם מספרים נמוכים של תאים הראו מספרים גבוהים יותר של תחומים. ניידות תא הגבלה על ידי methylcellulose 1% נבעה באותה היעילות של היווצרות כדור, עצמאית במספר תאים בתחילה מצופים. תוצאות אלו מצביעות על כך שclumping התא והיתוך תחום או disaggregation יכולים להתרחש שינוי מספרי תחום ומובילים לתוצאות לא מדויקות במבחנים מבוססי תאים רב התחומים. כאשר תאים מצופה בצפיפות נכונה, מבחני מבוססי תאים רב זאת להוביל לתוצאות לא דומות לנתונים שנאספו במבחני תחום המבוסס על תא בודד (איור 4). כדי להמשיך לחקור את התוצאות הללו השווינו מבוססי תא בודד ורבמבחני באמצעות תאי קרצינומה של השחלות מסודרים לCSCS המשוער באמצעות מערכת כתב להביע RFP lentiviral שפורסמה לאחרונה לאזור הרגולציה Sox2 10. ואכן, שני מבחני אישרו את היכולת המשופרת ראשונית ומשנית תחום יוצרים של RFP + לעומת תאי RFP- (איור 4 א ', ב'). חשוב לציין, המספרים גבוהים יותר של תחומים שנצפו מRFP + תאים לא היו בשל קיבולת גבוהה יותר שגשוג של תאי Sox2 להביע (מידע לא מוצג), אשר עולים בקנה אחד עם תוצאות קודמות שהראו שזירוז של Sox2 מקדם היווצרות תחומים ובtumorigenicity vivo ללא ההאצה התקדמות מחזור תא 10.
יחדיו, מבחני תחומים מבוססי תא בודדים יותר מייגע ויקרים, אבל הם לגרום לנתונים מדויקים יותר, שגם אושר על ידי שחזור גבוה יותר של תוצאות בין ניסויים. מאז צפיפות ציפוי מאוד תוצאות השפעות בתא-bas הרבההשעיה ed תחומי מבחני, טיטרציה מראש של צפיפות ציפוי נאותה נדרש לכל סוג תא סרטני בודד לפני מנסה לאמוד היווצרות כדור באמצעות מבחני אלה. לחלופין, ניתן להשתמש במבחנים מבוססי תאים בודדים מדויקים יותר מראש, או בתוספי methylcellulose כדי לשפר את הדיוק של תוצאות על ידי צמצום חפצים מכאניים. אם היווצרות כדור היא בהשוואה בין תנאים שבם השינוי הגנטי או הטיפול תרופתי עלול קשה לשנות כדאיות של התאים, ובכך להקטין צפיפות תאים, מבחני תחום המבוסס על תא בודד יכולים להיות חובה כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות.
לסיכום, בתנאי ניסוי מתאימים גם assay הרב מבוסס תאי תחומים וassay תחומים מבוססי תא הבודד יכול להצביע על הבדלים בפוטנציאל תחום בין אוכלוסיות תאים שונות (גזע ותאים הלא-גזע). עם זאת, מבחני תחומים מבוססי תאים רב אשר בדרך כלל מבוצעים בתרבויות נוזלית רגישים יותר לדוארrrors הוצג על ידי עיצוב ניסיוני באמצעות ציפוי צפיפות. תוספת של methylcellulose (1%) למבחנים מבוססי תאים רב יכולה להגביל חפצים הקשורים לתא clumping והיתוך תחום. על סמך נתונים אלה, אנו ממליצים מבחני מבוססי תאים בודדים תחומים שיש לבצע, אלא אם כן ניתוחי טיטרציה מפורטים בוצעו השפעה מראש ושלילית של תנאי ניסוי על כדאיות תא ובכך צפיפות תאים נשללה. עם זאת, מבחני תחומים מבוססי תא בודדים יותר מייגע ויקרים יותר, וייתכן שלא יהיה צורך בכל הגדרה ניסיונית. מבחני מבוססי תאים רבי בתוספת Methylcellulose התחומים עשויים לייצג אלטרנטיבה אחרת בכמה הגדרות ניסיוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
