Protocol
1. Génération des droits de cellules de carcinome de l'ovaire de OVCAR-3 transduites de manière stable avec lentivirus contenant le rapporteur Construct région régulatrice SOX2
- Générer des particules lentiviraux par transfection de la lignée cellulaire HEK 293T-emballage avec une construction de rapporteur de reconnaître une région de régulation de la manière décrite SOX2 10,21.
REMARQUE: La construction de rapporteur contient en outre un domaine de déstabilisation du système ProteoTuner bouclier avant de la protéine de fluorescence tdTomato. Shield1 se lie au domaine de déstabilisation empêchant ainsi le protéasome de dégrader la protéine de fluorescence 22. - Transduire des cellules OVCAR-3 avec des particules lentivirales sur une période de temps de 24 heures. Par la suite, retirer le surnageant viral et laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) et mises en culture dans du milieu complet (RPMI complété avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine).
- 48 h plus tard, 10 ng / ml puromycine a été ajouté aux cultures et maintenue pendant 5 jours pour permettre la sélection de cellules transduites correctement.
2. Préparation de la cellule de tri et de Placage
- Ajouter Shield1 au 1: 1000 dilution 24 heures avant le tri de cellules. Utilisation transduites de manière stable des cellules OVCAR-3 sans traitement Shield1 comme témoins négatifs (Figure 1). Aspirer le milieu de flacon, laver les cellules avec PBS 1x et Trypsiniser cellules avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3 min.
- Arrêtez la trypsine en utilisant un milieu complet (voir ci-dessus), compter le nombre de cellules, les cellules de centrifugation à 300 xg à température ambiante (15-25 ° C) pendant 5 min.
- Décanter le surnageant et remettre les cellules soigneusement 0,5 à 1 ml de PBS stérile.
- Utilisez 40 um filtre de bouchon de crépine de cellules pour obtenir une suspension à cellule unique.
- Ajuster le nombre de cellules de 5 millions de cellules par ml.
- Préparer faible fixation des plaques à 96 puits ultra avec 100 ul de milieu sphères (MEGM supplémenté avec des facteurs de croissance, les cytokines, et les suppléments,B-27, l'héparine de sodium; ou DMEM / F12 supplémenté en facteurs de croissance, cytokines, et des suppléments, B-27, l'héparine de sodium avec ou sans addition de 1% de méthylcellulose, voir également le tableau 1). Ajouter éventuellement des antibiotiques dans le milieu à une concentration de 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine afin de minimiser le risque de contamination possible.
- Trier DP + et les cellules RFP- préparés dans des plaques à 96 puits à partir de ci-dessus, une cellule par puits (single sphères de dosage à base de cellules) et 100 cellules par puits de dosage (multi sphères à base de cellules), respectivement. Effectuer tri sur disponible dans le commerce trieur de cellules (voir Matériaux) en utilisant le mode unique de cellules, Trier configuration: 100 μ buse, la pression de la gaine 20 psi, et le masque de rendement 0, masque pureté 32, masque de phase 16.
- Évaluer l'efficacité de placage en marquant au microscope puits contenant des cellules (pour le dosage à base de cellules unique) et en comptant le nombre de cellules dans des puits individuels (pour le dosage à base de cellules multiples; Figure 2
- Incuber les cellules dans des conditions normales dans les sphères moyennes (pour la composition voir l'étape 2.6) à 37 ° C et 5% de CO 2. Supplément quotidien bFGF (20 ng / ml) et de l'EGF (20 ng / ml).
- Après une semaine, compter le nombre de nouvelles sphères tumorales en utilisant un microscope standard avec un grossissement de 10X ou 4X et un microscope à fluorescence pour détecter le signal de fluorescence à partir du système rapporteur intégré. Comptez sphères avec un diamètre supérieur à 100 um comme «grands» des sphères et des sphères d'un diamètre de 50 à 100 um comme "petits" domaines (Figure 3). Assurez-vous que vous comptez sphères réelles et non cellulaires grappes.
NOTE: Dans les essais à base de cellules simples formation sphère est plus facile de marquer au microscope après 10 (contre 7) jours de culture. - Calculer la proportion de cellules de la sphère formation en DP + et les cellules respectivement RFP- dans des dosages à base de cellules simples (une plaque de 96 puits pour chaque expérience individuelle) ou plusieurs cellules-basphères sed essais (un puits pour chaque expérience individuelle) présentés par Shaw et al. 16
REMARQUE: Proportion de cellules formant sphère (en%) = (nombre de sphères) / (nombre de cellules ensemencées) x 100
3. Le passage en série des Sphères
- Placez le contenu de chaque puits dans un tube et centrifuger stérile appropriée à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Pour plusieurs sphères dosages à base de cellules, rassembler les sphères d'un puits. Laver le bien 3-5 fois avec du PBS et centrifuger 2 min plus. Pour sphères simples tests à base de cellules, recueillir des sphères individuelles. En raison du faible nombre de cellules, utilisez tubes de 1,5 ml pour centrifugation et lavage étapes.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de 0,05% de trypsine-EDTA.
- Afin d'obtenir une séparation optimale des cellules, incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 5 min dans un agitateur doux. Optimiser trypsinisation temps pour votre lignée cellulaire à taux de mort cellulaire inférieure: si aucune grandesphères est trituré visible doucement à l'aide d'une pipette de 100 pi. En cas de grosses sphères sont toujours présents, incuber avec de la trypsine autre 3 min, puis passez à l'étape de trituration. En cas de simple tests cellulaires veillez à optimiser le temps pour le rendement cellulaire optimal de cellules vivantes au cours de l'étape de traitement à la trypsine.
- Pour inactiver la trypsine, ajouter 500 pi de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 10 min, dans le cas de dosages cellulaires simples, centrifuger pendant 2 min supplémentaires.
- Éliminer les cellules surnageant et remettre soigneusement dans le milieu des sphères.
- Utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension monocellulaire.
- Dans le cas de l'utilisation DP + et les cellules RFP- dans des dosages cellulaires bassed multiples, évaluer le pourcentage de cellules présentant une fluorescence dans chaque puits après remise en suspension par analyse cytomètre de flux.
- Pour les essais de réensemencement série de cellules individuelles, semences 1 cellule par puits dans une nouvelle plaque de fixation basse ultra 96 puits préparés comme détaillé ci-dessus. D'une sphère individuelle, ensemencer environ 20 puits individuels. Pour les essais de réensemencement de multiples sphères primaires à base de cellules, les cellules obtenues à partir de graines et une des sphères primaires dans une nouvelle plaque à 96 puits et compter le nombre de cellules par microscopie lendemain.
- Évaluer la proportion de cellules de la sphère formant dans les sphères secondaires essais utilisant la formule décrite à l'étape 2.11.
4. Analyse des résultats
- Analyser les résultats des expériences réalisées en triple indépendants et utiliser le test t de Student recto-verso pour analyser les valeurs normalement distribués et autrement Mann-Whitney-Tests pour l'analyse statistique.
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Representative Results
Dans les sphères des analyses classiques, près de 40% des DP + OVCAR-3 cellules contre 20% des cellules RFP- a donné lieu à une sphère de tumeur individuelle dans le dosage des sphères primaire (figure 4A). En outre, les sphères formées par DP + cellules sont plus grandes en taille que ceux qui sont formés par des cellules RFP-.
Lorsque plaqués dans des essais à base de cellules simples, les cellules de la DP + également formés plusieurs sphères que les cellules RFP-, confirmant les résultats ci-dessus. Cependant, il y avait une tendance à la génération de moins de sphères par plaqué dans le seul par rapport au dosage à base de cellules multiples (figure 4A, B), ce qui indique que dans cette formation de la sphère de dosage peut être biaisée par des artefacts techniques telles que la fusion de la sphère mécanique ou dissociation dans le milieu de culture non adhérentes.
Pour explorer davantage ces aspects, nous avons comparé l'influence de la densité de placage de cellules sur la formation des sphères. Nous Plaqué cellules en utilisant dilution limite à partir de 1000 cellules pour 1 cellule par puits dans 96-Bien plaques et a constaté que le nombre de sphères émergents étaient très dépendante sur le nombre de cellules initialement plaquées. Étonnamment, un plus grand nombre de domaines ont été comptés à partir de baisse du nombre de cellules étalées à la fois MEMGES et DMEM / médias basés F12, démontrant que les modalités effet placage biaiser les résultats fortement dans ce test (Figure 5). En revanche, lorsque les cellules ont été immobilisées en ajoutant 1% de méthylcellulose de DMEM / F12-sphères à base de milieu 23,24 de l'efficacité de la formation de sphère est principalement indépendante de la densité cellulaire.
Pour explorer l'influence des conditions de culture des sphères sur les propriétés du SCC, nous avons analysé le pourcentage de cellules exprimant signal de fluorescence rouge après 7 jours d'incubation dans le dosage des sphères. Nous avons constaté que dans plusieurs sphères cultures à base de cellules d'environ 35% des cellules de DP + sphères perdu leur signal de fluorescence rouge après sept jours de culture (figure 6A), ce qui suggère qu'ils ont undergune différenciation, tandis que 65% ont retenu une DP + signaux suggérant la capacité d'auto-renouvellement. En revanche, les cellules provenant de domaines générés à partir de cellules initialement RFP- restés négatifs DP (figure 6A), ce qui indique qu'ils ne peuvent pas rétablir le potentiel des cellules souches dans ces conditions.
La microscopie à fluorescence effectuée sur des sphères générés à partir de cellules simples confirmé ces résultats montrant que les sphères simples dérivés DP + cellules contenaient deux DP + et les cellules RFP- tout sphères dérivées de cellules RFP- sont restés négatifs pour le signal rouge.
Des résultats similaires ont été observés dans des essais de réensemencement des deux conditions.
Figure 1. Flux de travail de la transduction lentivirale, la sélection et le tri des DP + et les cellules RFP-. Après transduction lentivirale et la sélection positive de cellules transduites avec succès par l'exposition à la puromycine, RFP- et les cellules du FPR + sont triées par FACS dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits dans le milieu des sphères. Pour plusieurs sphères dosages à base de cellules, 100 cellules sont placées dans un puits. Placage efficacité est évaluée par microscopie effectuées après le tri. Sphères ont été marqués par microscopie après sept à dix jours, dissociés en cellules individuelles, analysées par cytométrie de flux et replaquée en sphères secondaires. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. imagerie des déchets triés DP + et les cellules RFP- après placage. Simple DP + et les cellules RFP- triés dans chaque puits d'une plaque de 96 puits sont analysés pour le placage correcte en utilisant un (fluorescente) microscope.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse de la formation de la formation de sphères dans des dosages à base de cellules simples. Sphères est analysée après sept à dix jours. (A) Large (diamètre> 100 um) et (B) de petite taille (diamètre de 50 à 100 um). Sphères se distinguent les unes microscope basés sur la taille Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Efficacité de la tumeur sphères formation de DP +et RFP- OVCAR-3 cellules dans plusieurs contre sphères tests basés sur une seule cellule. Comparaison de l'efficacité de la sphère primaire et secondaire de OVCAR-3 cellules telle que déterminée en multi (A) par rapport simples sphères dosages à base de cellules (B). Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure densité de placage 5. cellulaire fortement impacts sphère compte de cellules OVCAR-3 dans la plusieurs sphères dosage à base de cellules exécuté dans un liquide, mais pas dans la méthylcellulose supplémenté les cultures. L'utilisation de différentes densités cellulaires et les milieux de croissance ont été rapportés dans la littérature pour le cancer des ovaires sphères dosages. Pour analyser les biais possibles introduits par ces variables, les cellules sont étalées à différedensités nt dans 200 pi de différents milieux de culture des sphères (MEMGES, DMEM / F12 avec tous les suppléments tels que détaillés dans la section de protocole, ou DMEM / F12 avec tous les suppléments et contenant 1% de méthylcellulose) et la formation de la sphère est marqué après 7 jours (A) . Présentés dans (B) sont des images de microscopie de cellules étalées à des densités différentes prises un jour après l'étalement dans du DMEM / F12 sphères milieu de culture sans méthylcellulose. Noter les agrégats de cellules émergents à haute densité cellulaire, par opposition à des cellules uniques dans des plaques de vues de basse densité. La barre d'échelle pour les photos:. 50 pm Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Analyse des DP signal dans les sphères de la tumeur formée de DP + et respectivEly RFP- OVCAR-3 cellules (A) cytométrie en flux pour le signal de demande de propositions dans les domaines dissociées dérivées de cellules DP + et RFP- (dosage des sphères à base de cellules multi). (B) Microscopie de sphères dérivés de DP + et les cellules RFP- (titrage des sphères à base de cellules unique) révèle signal de DP hétérogènes dans les domaines dérivés de DP + mais pas de cellules RFP-. Les photos ont été prises au jour 7 pour les sphères classiques et 10 jours pour les simples tests de sphères à base de cellules. Notez la taille plus grande des sphères dérivés de DP + putatifs CSC. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Source de cellules de cancer ovarien humain | Milieu basique | Suppléments | Auteurs |
| OVCAR-3, Caov-3, matière première | MEGM | 20 ng / ml regF, 20 ng ml de bFGF /, B-27, 4 ug / ml d'héparine, de l'hydrocortisone, de l'insuline (kit SingleQuot) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml d'insuline, 10 ng / ml regF, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ug / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 2% de B-27, 0,4% de BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 10 ng / ml de bFGF, 2% de B-27, 1 ng / ml d'hydrocortisone | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, matériau primaire | DMEM / F12 | 5 ug / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 10 ng / ml de bFGF, 0,4% de BSA | T. Xiang et al. |
| Matière première | DMEM / F12 > | 5 ug / ml d'insuline, 10 ng / ml regF, 10 ng / ml de bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% de BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 20 ng ml de bFGF /, 2% de B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 20 ng ml de bFGF /, 2% de B-27 | MF Shi et al. |
| Matière première | DMEM / F12 | 5 ug / ml d'insuline, 20 ng / ml regF, 10 ng / ml de bFGF, 0,4% de BSA | Shu Zhang et al. |
| Matière première | EBM-2 ou X-VIVO | 5 ug / ml d'insuline, 20 ng / ml regF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml regF, 20 ng / ml de bFGF, B-27, 4 ug / ml d'héparine | Dongming Liang et al. |
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Discussion
Sphères cultures sont une méthode largement utilisée pour analyser le potentiel de cellules souches du cancer et enrichir en cellules souches-comme dans un large éventail de cellules tumorales humaines 15,25,26. Dans ces conditions de culture, les cellules cancéreuses qui ne ont pas la capacité d'auto-renouvellement se attend à différencier et, éventuellement, subir une mort cellulaire. Bien qu'ils puissent former initialement des agrégats de cellules ou même des sphères de tumeurs primaires dans des dosages en particulier, ils ne sont pas en mesure de maintenir la capacité de la sphère formant lors de réensemencement en série en raison du manque de propriétés d'auto-renouvellement. Sphères dosages sont utilisés comme substituts des dosages pour identifier les cellules souches cancéreuses et d'évaluer leur fréquence dans les populations de cellules tumorales entières.
Cependant, une importante variabilité peut être observée entre sphères dosages effectués suivant différents protocoles publiés 5,10,27-35 (tableau 1). Dans notre laboratoire, nous avons déjà publié la formation de la sphère à partir de cellules de carcinome ovarien humain en utilisant MEGM complétées avec B-27, BFGF, héparine et SingleQuot TM (contenant de l'insuline, regF et de l'hydrocortisone). D'autres laboratoires utilisent toute DMEM / F12 moyenne, tandis que certains ajoutent que B-27 et regF. Dans ce rapport, plusieurs sphères à base de cellules test in OVCAR-trois cellules ont donc été effectuée en utilisant des conditions différentes. Utilisation MEGM ou DMEM / F12 avec tous les suppléments aucune différence significative dans la formation de domaine a été observé dans ces cellules (figure 5A). En outre, certains laboratoires ont spéculé que l'EGF et FGF peuvent être rapidement dégradées et ont établi des protocoles ajoutant ces facteurs de croissance quotidienne au milieu. Par conséquent, nous avons comparé les sphères dosages effectués dans un milieu dans lequel on ajoute l'EGF et FGF qu'au début des sphères dosages avec addition quotidienne d'EGF et FGF pour la culture de cellules, et on trouve ces dosages pour obtenir des résultats équivalents dans les cellules OVCAR-3 (données non présentées), ce qui suggère que la supplémentation quotidienne coûteux et laborieux avec de l'EGF et FGF ne est pas toujours nécessaire. Que ces résultatssont applicables à des cellules d'autres lignées cellulaires de cancer de l'ovaire ou des prélèvements élémentaires, ou dans différentes conditions expérimentales reste à déterminer.
Cependant, nous avons observé un biais important dans le nombre de sphères marqués introduits par une autre variable testée, la densité de placage de la cellule. De manière surprenante, les puits ensemencés avec des nombres plus faibles de cellules ont montré un plus grand nombre de sphères. La limitation de la mobilité cellulaire par méthylcellulose à 1% a donné lieu à la même efficacité de la formation de la sphère, indépendant du nombre de cellules initialement plaquées. Ces résultats suggèrent que l'agglutination des cellules et de la sphère de fusion ou de désagrégation peuvent survenir modifier les numéros de sphère et conduisant à des résultats inexacts dans plusieurs sphères dosages à base de cellules. Lorsque les cellules sont étalées à la densité adéquate, des essais à base de cellules multiples mais conduisent à des résultats plutôt comparables à des données recueillies dans des essais simples de la sphère à base de cellules (figure 4). Pour explorer davantage ces résultats, nous avons comparé à base de cellules mono et multitests utilisant des cellules de carcinome ovarien triés dans les CSC putatifs via un DP lentiviral système rapporteur exprimant récemment publié une région régulatrice de SOX2 10. En effet, les deux tests ont confirmé la capacité sphère formant primaire et secondaire amélioré de DP + par rapport aux cellules RFP- (figure 4A, B). Fait important, l'augmentation du nombre de sphères observés à partir de la DP + cellules ne étaient pas dues à une plus grande capacité de prolifération des cellules SOX2 expression (données non présentées), ce qui est conforme avec les résultats précédents montrant que l'induction de SOX2 favorise la formation des sphères et à la tumorigénicité in vivo sans accélérer la progression du cycle cellulaire 10.
Pris ensemble, simples sphères à base de cellules-tests sont plus laborieux et coûteux, mais elles aboutissent à des données plus précises, ce qui est également confirmé par la reproductibilité élevée des résultats entre expériences. Depuis densité de placage fortement influences résultats dans plusieurs cellules-based suspension sphères essais, titration initial de densité de placage adéquate est nécessaire pour chaque type de cellule tumorale individuelle avant la formation de la sphère dosage utilisant ces essais. Alternativement, les dosages à base de cellules individuelles plus précises peuvent être utilisés dès le départ, ou la méthylcellulose supplémentation pour améliorer la précision des résultats en réduisant les artefacts mécaniques. Si la formation de la sphère est comparée entre les conditions où la modification génétique ou traitement médicamenteux peuvent sérieusement altérer la viabilité des cellules, ce qui diminue la densité cellulaire, simples tests de sphères à base de cellules peuvent être obligatoires pour éviter des résultats faussement positifs.
En résumé, dans des conditions expérimentales appropriées à la fois le dosage de plusieurs sphères à base de cellules et le dosage des sphères unique à base de cellules sont capables d'indiquer les différences de potentiel de champ entre les différentes populations de cellules souches et de cellules (non-souches). Cependant, plusieurs sphères dosages à base de cellules qui sont couramment effectuées dans des cultures liquides sont plus sensibles à l'errors introduites par la conception expérimentale travers densité de placage. La supplémentation de méthylcellulose (1%) pour des essais à base de cellules multiples peut limiter les artefacts liés à la cellule agglutination et la fusion sphère. Sur la base de ces données, nous vous recommandons de simples sphères essais cellulaires à être effectuées sauf analyses de titrage détaillées ont été effectuées à l'avance et l'impact négatif des conditions expérimentales sur la viabilité cellulaire et ainsi la densité cellulaire a été écartée. Cependant, simples sphères à base de cellules tests sont plus laborieux et plus coûteux, et peuvent ne pas être nécessaires dans chaque cadre expérimental. Méthylcellulose complété plusieurs sphères dosages à base de cellules peuvent représenter une autre alternative dans certains paramètres expérimentaux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
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