Protocol
1. generasjon av ovčar-tre menneske ovarialcancerprogrammet Cells stabilt transduserte med lentiviruses Inneholder SOX2 Regulatory Region Reporter Construct
- Generere lentiviral partikler ved trans den HEK 293T-emballasje cellelinje med en reporter konstruere gjenkjenne en SOX2 regulatorisk område som beskrevet 10,21.
MERK: Reporteren konstruere videre inneholder en destabilisering domenet til ProteoTuner Shield System i forkant av tdTomato fluorescens protein. Shield1 binder seg til destabilisering domenet derved forhindrer proteasomet å degradere fluorescens protein 22. - Transduce OVCAR-3-celler med lentivirale partikler i løpet av en tidsperiode på 24 timer. Etterpå fjernes den virale supernatanten og vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) og dyrket i komplett medium (RPMI supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin).
- 48 timer senere, 10 pg / ml puromycin ble tilsatt til kulturene og opprettholdt i 5 dager for å tillate valg av riktig transduserte celler.
2. Utarbeidelse av Cell Sorting og plating
- Legg Shield1 på 1: 1000 fortynning 24 timer før cellesortering. Bruk stabilt transduserte ovčar-3 celler uten Shield1 behandling som negative kontroller (figur 1). Sug medier fra kolbe, vaskes cellene med 1 x PBS og trypsineres cellene med 0,05% Trypsin-EDTA i 3 min.
- Stoppe trypsin ved hjelp av fullstendig medium (se ovenfor), telle antall celler, sentrifuger cellene ved 300 x g ved romtemperatur (15 - 25 ° C) i 5 min.
- Dekanter supernatanten og resuspender celler nøye i 0,5 til 1 ml steril PBS.
- Bruk 40 um cellefilter cap filter for å tilveiebringe enkelt-cellesuspensjon.
- Juster celletall til 5 millioner celler per ml.
- Forbered ultra lav-feste 96-brønners plater med 100 ul medium kuler (MEGM supplert med vekstfaktorer, cytokiner, og kosttilskudd,B-27, heparin-natrium; eller DMEM / F12 supplert med vekstfaktorer, cytokiner, og kosttilskudd, B-27, heparin-natrium med eller uten tilsetning av 1% metylcellulose, se også tabell 1). Eventuelt legge antibiotika til mediet ved en konsentrasjon på 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin å minimalisere risikoen for mulig forurensning.
- Sortering RFP + og RFP- celler fremstilt i 96-brønners plater ovenfra, en celle pr brønn (enkeltcellebasert assay kuler) og 100 celler per brønn (multicellebaserte kuler assay), henholdsvis. Utføre slag på kommersielt tilgjengelig celle sorter (se Materials) ved hjelp av enkelt celle-modus, Sort oppsett: 100 μ dyse, skjede trykk 20 psi, og utbyttet maske 0, renhet maske 32, fase mask 16.
- Vurdere Plating effektivitet ved mikroskopisk utføre brønner inneholdende celler (for enkeltcellebasert assay), og ved å telle antall celler i individuelle brønner (for flercellebasert assay; Figur 2
- Inkuber cellene under standardbetingelser i kuler medium (for sammensetningen se trinn 2.6) ved 37 ° C og 5% CO2. Supplement daglig bFGF (20 ng / ml) og EGF (20 ng / ml).
- Etter én uke, telle antall voksende tumor kuler ved hjelp av en standard mikroskop med 4X eller 10X forstørrelse og et fluorescensmikroskop for å detektere fluorescens-signalet fra den integrerte rapportørsystemet. Telle kuler med diameter over 100 um som "store" kuler og kulene har en diameter 50-100 um som "små" kuler (figur 3). Vær sikker på at du telle ekte kuler og ikke celle klynger.
MERK: I enkelte cellebaserte analyser sfære formasjonen er lettere å score mikroskopisk etter 10 (versus 7) dager kultur. - Beregne andelen av kuledannende celler i RFP + og henholdsvis RFP- celler i én celle-baserte analyser (en 96-brønners plate for hvert enkelt eksperiment) eller flercelle-based kuler analyser (en vel for hver enkelt eksperiment) som presenteres av Shaw et al. 16
MERK: Andel av kuledannende celler (%) = (antall sfærer) / (antall celler sådd) x 100
3. Serieaging av Spheres
- Plassere innholdet fra hver brønn i et egnet sterilt rør og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT. For multicellebaserte assays kuler, samle sammen kulene fra en brønn. Vask godt 3-5 ganger med PBS og sentrifuger 2 min lenger. For enkeltcellebaserte kuler analyser, samle individuelle kuler. På grunn av det lave antall celler, bruker 1,5 ml rør for sentrifugering og vasketrinn.
- Fjern supernatant og resuspender pelleten i 200 pl av 0,05% Trypsin-EDTA.
- For å oppnå optimal celleseparasjon, inkubere cellesuspensjonen ved 37 ° C i 5 minutter i en myk shaker. Optimalisere trypsinering tid for cellelinje til lavere celledød rate: hvis ingen storkuler er synlig triturate forsiktig ved hjelp av en 100 mL pipette. I tilfelle store kuler er fortsatt til stede, inkuber med trypsin en annen 3 min og deretter gå videre til trituration trinn. Ved en enkelt celle-baserte analyser sørge for å optimalisere tiden for optimal celleutbytte av levende celler under trypsinization trinn.
- For å inaktivere trypsin, tilsett 500 pl komplett medium, og sentrifuger ved 300 xg i 10 min, i tilfelle av enkeltcelleanalyser, sentrifuger i ytterligere 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspender celler nøye i sfærer medium.
- Bruker en 40 um celle sil cap filter for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
- I tilfellet med anvendelse av RFP + og RFP- celler i flercelle-bassed assays bedømme andelen av fluorescerende celler i hver brønn etter resuspensjon via strømningscytometer analyse.
- For serie replating analyser av enkelt celler, frø en celle per brønn inn i en ny ultra low-vedlegg 96-brønns plate forberedt som beskrevet ovenfor. Fra ett individ sfære, frø ca 20 individuelle brønner. For replating analyser av flercellebasert primær kuler, seed-celler oppnådd fra en brønn av primær sfærer i en ny 96-brønners plate og telle antall celler neste dag ved mikroskopi.
- Bedømme andelen av kuledannende celler i sekundære kuler analyser ved anvendelse av formelen beskrevet i trinn 2.11.
4. Resultat Analyse
- Analysere resultater fra eksperimenter utført i uavhengige triplicates og bruke tosidig T-test for å analysere normalfordelte verdier og ellers Mann-Whitney-tester for statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I konvensjonelle kuler assays, nesten 40% av RFP + OVCAR-3-celler sammenlignet med 20% av RFP- celler ga opphav til et individ tumor sfære i det primære sfærer analysen (figur 4A). Videre kuler dannet av RFP + celler var større i størrelse enn de som dannes ved RFP- celler.
Når sådd ut i enkeltcellebaserte analyser, RFP + -celler også dannes flere kuler enn RFP- celler, hvilket bekrefter resultatene ovenfor. Imidlertid, var det en tendens mot dannelse av mindre kuler per belagt i enkelt versus multicellebaserte analysen (figur 4A, B), som indikerer at i denne analysen sfære formasjonen kan være forspent ved tekniske gjenstander som for eksempel mekanisk sfære fusjon eller dissosiasjon i den ikke-heftende kulturmedium.
For ytterligere å utforske disse aspektene, sammenlignet vi påvirkning av celle-pletteringstetthet på kuler formasjonen. Vi belagt celler ved hjelp av begrensende fortynning fra 1000-celler til en celle pr brønn i 96-vel plater og fant at antallet nye sfærer var svært avhengig av antall utgangspunktet belagt celler. Overraskende nok var høyere antall kuler regnet fra lavere antall belagt celler i både MGEM og DMEM / F12-baserte medier, viser at faktisk plating modaliteter høyt skjevhet resultatene i denne analysen (figur 5). I motsetning til dette, når cellene ble immobilisert ved å tilsette 1% metylcellulose i DMEM / F12-medium basert kuler 23,24 effektiviteten av kuledannelsen var hovedsakelig uavhengig av celletetthet.
For å undersøke innflytelsen av kuler dyrkningsforhold på CSC egenskaper, analyserte vi prosentandelen av celler som uttrykker rød fluorescens-signal etter 7 dagers inkubering i kuler assayet. Vi har funnet at i flercellebaserte kuler kulturer omtrent 35% av cellene fra RFP + kuler mistet sin røde fluorescens-signal etter syv dagers dyrking (figur 6A), noe som tyder på at de har undergen differensiering, mens 65% beholdt en RFP + signal som tyder på selvfornyelse kapasitet. I kontrast, celler fra kuler som genereres fra opprinnelig RFP- celler forble RFP negativ (figur 6A), noe som indikerer at de ikke kan re-etablere stamcellepotensial under disse betingelser.
Fluorescens mikroskopi utføres på kuler generert fra enkeltceller bekreftet disse resultatene viser at single kuler avledet RFP + celler inneholdt både RFP + og RFP- celler mens kulene stammer fra RFP- cellene forble negativ for rødt signal.
Lignende resultater ble observert i replating analyser fra begge tilstander.
Figur 1. Arbeidsflyt av lentiviral transduksjon, utvalg og sortering av RFP + og RFP- celler. Etter lentiviral transduksjon og positiv utvelgelse av hell transduserte celler via puromycin eksponering, RFP- og RPF + celler, sortert ved hjelp av FACS i individuelle brønner i en 96-brønners plate i sfærer medium. For multicellebaserte assays kuler, er 100-celler plassert i en brønn. Plating effektivitet vurderes ved mikroskopi utføres etter sortering. Kuler ble scoret av mikroskopi etter sju til ti dager, dissosiert i enkeltceller, analysert via flowcytometri og replated inn sekundære kuler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. avbildning av sortert RFP + og RFP- celler etter utplating. Enkelt RFP + og RFP- celler sortert i hver brønn av en 96-brønnsplate ble analysert for korrekt plettering ved hjelp av en (fluorescerende) mikroskop.w.jove.com/files/ftp_upload/52259/52259fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av kuler dannelse i enkeltcellebaserte analyser. Spheres formasjonen blir analysert etter syv til ti dager. (A) Stor (diameter> 100 mm) og (B) små (diameter 50-100 mikrometer). Sfærer skilles mikroskopisk basert på størrelse Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effektivitet av tumor Kuler formasjonen fra RFP +og RFP- OVCAR-tre celler på fler versus encellede basert kuler analyser. Sammenligning av primær og sekundær sfære effektivitet fra ovčar-tre celler som analysert i multi (A) versus encellete baserte kuler analyser (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Cellepletteringstetthet sterkt støt sfære teller fra OVCAR-3 celler i flercelle-basert kuler analysen utført i væske, men ikke i metylcellulose supplert kulturer. Bruk av forskjellige celletettheter og vekstmedier er blitt rapportert i litteraturen for ovarial cancer kuler analyser. Å analysere mulige skjevheter introdusert av disse variablene, blir cellene belagt på different tettheter i 200 mL av ulike sfærer kultur media (MGEM, DMEM / F12 med alle kosttilskudd som beskrevet i protokollen delen, eller DMEM / F12 med alle kosttilskudd og inneholder 1% metylcellulose) og sfære formasjonen er scoret etter 7 dager (A) . Vist i (B) er mikroskopibilder av celler belagt med forskjellige tettheter som er tatt av en dag etter utplating i DMEM / F12 kuler kulturmedium uten metylcellulose. Legg merke til cellegruppene fremvoksende ved høy mobiltetthet i motsetning til enkeltceller sett i lav tetthet plater. Målestokk for bilder:. 50 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Analyse av RFP signal i tumor sfærer dannet fra RFP + og respectivEly RFP- OVCAR-3-celler (A) Strømningscytometri-analyse for RFP signal i dissosierte sfærer avledet fra RFP + og RFP- celler (multicellebasert assay kuler).; (B) Mikroskopi av kuler som stammer fra RFP + og RFP- celler (enkelt celle-baserte kuler assay) avslører heterogen RFP signal i kuler som stammer fra RFP + men ikke fra RFP- celler. Bildene ble tatt på dag 7 for konvensjonelle kuler og dag 10 for enkeltcellebaserte sfære analyser. Legg merke til den større størrelse på kuler som stammer fra RFP + antatte cscs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Menneskelig eggstokkreft celle kilde | Grunnleggende medium | Kosttilskudd | Forfattere |
| OVCAR-3, Caov-3, primærmateriale | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparin, hydrokortison, insulin (SingleQuot kit) | Bareiss et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Li Ma et al. |
| A2780 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 2% B-27, 0,4% BSA | Haiwei Wang et al. |
| SKOV3 | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 2% B-27, 1 ng / ml hydrokortison | Yong-Rui Du et al. |
| A2780, primærmateriale | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | T. Xiang et al. |
| Primærmateriale | DMEM / F12 > | 5 ug / ml insulin, 10 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 12 ng / ml LIF, 0,3% BSA | Te Liu et al. |
| MLS | DMEM / F12 | 10 ng / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | Soritau et al. |
| 3AO | DMEM / F12 | 1 mg / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, 2% B-27 | MF Shi et al. |
| Primærmateriale | DMEM / F12 | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF, 10 ng / ml bFGF, 0,4% BSA | Shu Zhang et al. |
| Primærmateriale | EBM-2 eller X-VIVO | 5 ug / ml insulin, 20 ng / ml rEGF | Ilona Kryczek et al. |
| OVCAR-3 | MEGM | 20 ng / ml rEGF, 20 ng / ml bFGF, B-27, 4 ug / ml heparin | Dongming Liang et al. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kuler kulturer er en mye brukt metode for å analysere kreft stamcelle potensial og anrike for stilk-lignende celler i et bredt spekter av humane tumorceller 15,25,26. Under disse dyrkingsbetingelser, er kreftceller som mangler evne til selvfornyelse forventes å differensiere og til slutt gjennomgår celledød. Selv om de kan i utgangspunktet danne celle klynger eller svulst kuler særlig i grunnskolen analyser, er de ikke i stand til å opprettholde sfære dannende evne på serie replating grunn av mangel på selvfornyende egenskaper. Kuler analyser blir brukt som surrogat analyser for å identifisere cscs og vurdere sin frekvens i hele tumorcellepopulasjoner.
Imidlertid kan betydelig variabilitet observeres mellom kuler analyser utført ved å følge forskjellige publiserte protokoller 5,10,27-35 (tabell 1). I vårt laboratorium har vi tidligere publiserte sfære formasjonen fra menneskelige ovarialcancerprogrammet celler ved hjelp MEGM supplert med B-27, BFGF, Heparin og SingleQuot TM (som inneholder insulin, rEGF og hydrokortison). Andre laboratorier bruker hele DMEM / F12 Medium, mens noen bare legge B-27 og rEGF. I denne rapporten ble det multicellebaserte kuler analysen i OVCAR-tre celler derfor utføres med ulike forhold. Ved hjelp MEGM eller DMEM / F12 med alle bilag ingen signifikant forskjell i sfære formasjonen ble observert i disse cellene (Figur 5A). I tillegg har noen laboratorier spekulert at EGF og FGF kan være hurtig degradert og har etablert protokoller legge disse vekstfaktorer daglig til mediet. Vi har derfor sammenlignet kuler analyser utført i et medium hvor EGF og FGF ble tilsatt bare ved begynnelsen av sfærene analyser med daglig tilsetning av EGF og FGF til cellekulturen, og vi finner disse analysene for å gi tilsvarende resultater i OVCAR-3-celler (data ikke vist), noe som tyder på at den dyre og arbeidskrevende daglig tilskudd med EGF og FGF kan ikke alltid være nødvendig. Hvorvidt disse resultatenegjelder for celler fra andre eggstokkreft cellelinjer eller primære prøver, eller under forskjellige eksperimentelle betingelser, gjenstår å bestemmes.
Imidlertid ble det observert en betydelig skjevhet i de mengder som oppnås kuler som innføres av en annen variabel testet, cellepletteringstetthet. Overraskende, podet brønner med lavere antall celler viste høyere antall kuler. Begrensning av cellemobilitet med 1% metylcellulose førte til den samme effektiviteten av sfæren formasjonen, uavhengig av antall opprinnelig belagte celler. Disse resultatene tyder på at celleklumpdannelse og sfære fusjon eller dekomponering kan forekomme modifisere sfære tall, og som fører til unøyaktige resultater i multicellebaserte assays kuler. Når cellene blir sådd ut på riktig tetthet, multicellebaserte assays imidlertid føre til resultater ganske sammenlignbare data som er samlet i en enkelt cellebaserte assays sfære (figur 4). Å utforske disse resultatene ytterligere vi sammenlignet single og multi cellebasertanalyser ved hjelp av eggstokkene karcinomceller sortert i antatte cscs via en nylig publisert lentiviral RFP uttrykker reporter system for en SOX2 regulatorisk region 10. Faktisk begge analysene bekreftet den forbedrede primær og sekundær sfære dannende kapasitet på RFP + versus RFP- celler (figur 4A, B). Viktigere er de høyere antall kuler observert fra RFP + -celler var ikke på grunn av høyere proliferativ kapasitet av SOX2 uttrykkende celler (data ikke vist), som er på linje med tidligere resultater som viser at induksjonen av SOX2 fremmer sfærer formasjon og in vivo tumorgenisitet uten akselerer cellesyklusprogresjon 10.
Tatt sammen, enkeltcellebaserte assays kulene er mer arbeidskrevende og kostbare, men de resulterer i mer nøyaktige data, som også er bekreftet ved høyere reproduserbarhet av resultater mellom eksperimentene. Siden plating tetthet i sterk grad påvirker resultatene på fler celle-based suspensjon Kuler analyser, upfront titrering av tilstrekkelig plating tettheten er nødvendig for hver enkelt svulst celletype før analysering sfære dannelse ved hjelp av disse analysene. Alternativt kan de mer nøyaktige enkeltcellebaserte assays anvendes på forhånd, eller metylcellulose tilskudd for å forbedre nøyaktigheten av resultatene ved å redusere mekaniske gjenstander. Hvis kuledannelse er sammenlignet mellom tilstander hvor den genetiske modifikasjon eller behandling kan sterkt endre levedyktighet av cellene, og dermed redusere celletetthet, kan enkeltcellebaserte assays sfære være obligatorisk for å unngå falske positive resultater.
I sammendrag, under riktige eksperimentelle betingelser både flercellebasert assay kuler og enkeltcellebaserte analysen sfærer er i stand til å indikere forskjeller i kule potensial mellom forskjellige cellepopulasjoner (stammen og ikke-stamceller). Imidlertid, multicellebaserte assays kuler som vanligvis blir utført i flytende kulturer er mer utsatt for errors introdusert av eksperimentell design gjennom plating tetthet. Tilskudd av metylcellulose (1%) til multicellebaserte assays kan begrense gjenstander knyttet til celleklumpdannelse og sfære fusjon. Basert på disse dataene, anbefaler vi encellete baserte kuler analyser som skal utføres med mindre detaljerte titrering analysene er utført på forhånd og negative virkningen av eksperimentelle forhold på celle levedyktighet og dermed celletettheten har blitt utelukket. Imidlertid enkeltcellebaserte assays kulene er mer arbeidskrevende og mer kostbare, og kan ikke være nødvendig i hver eksperimentell innstilling. Metylcellulose-supplert multicellebaserte assays kuler kan representere en annen alternativ i visse eksperimentelle innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-attachment plate | Corning | 3474 | |
| MEGM | Lonza | CC-3151 | |
| Insulin | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Lonza | CC-4136 | SingleQuots™ Kit |
| EGF | Sigma | E9644 | end concentration: 20 ng/ml |
| FGF | PeproTech | 100-18B | end concentration: 20 ng/ml |
| B-27 | Invitrogen/ Gibco | 17504-044 | end concentration: 1X |
| Heparin-Natrium-25000 IE | Ratiopharm | N68542.02 | dilution 1:1,000 |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| FCS | Gibco | 10500-064 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Dulbecco’s PBS (1X) | Gibco | 14190-094 | |
| Shield1 | Clontech | 632189 | dilution 1:1,000 |
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| DMEM/F12 (powder) | Gibco | 42400-010 | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Puromycin dihydrochloride | Applichem | A2856 | |
| Cell sorter | BD | Aria III cell sorter | |
| FACS analyser | BD | Accuri c6 flow cytometer | |
| Microscope | Olympus | IX50 Osiris |
References
- Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
- Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
- Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
- Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
- Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
- Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
- Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42 (2011).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
- Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
- Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
- Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
- Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
- Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
- Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062 (2010).
- Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
- Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
- Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905 (2013).
- Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
- Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
- Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
- Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
- Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
- Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201 (2012).
