Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52298
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

وقد تم تطوير طريقة لاستخلاص مباشرة الخلايا الجذعية العصبية البشرية من الخلايا الاصلية المكونة للدم التخصيب من خلايا الدم الطرفية.

Abstract

الأمراض التي تصيب البشر الثقافات العصبية محددة ضرورية لتوليد نماذج في المختبر للأمراض العصبية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم الوصول إلى الكبار البشري الثقافات العصبية الأولية يثير تحديات فريدة من نوعها. التطورات الأخيرة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) توفر نهجا بديلا لاستخلاص الثقافات العصبية من الخلايا الليفية الجلد من خلال المريض IPSC محددة، ولكن هذه العملية كثيفة العمالة، ويتطلب خبرة خاصة وكميات كبيرة من الموارد، ويمكن أن يستغرق عدة أشهر. هذا يمنع تطبيق واسع لهذه التكنولوجيا لدراسة الأمراض العصبية. للتغلب على بعض من هذه القضايا، وقد وضعنا طريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من الكبار البشري الدم المحيطي، وتجاوز عملية الاشتقاق IPSC. كانت الخلايا الاصلية المكونة للدم المخصب من الكبار البشري الدم المحيطي المستزرعة في المختبر، وtransfected مع ناقلات فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل النسخي Sox2 أكتوبر3/4، Klf4، وج. Myc على. نتائج ترنسفكأيشن في تغيرات شكلية في الخلايا التي يتم اختيارها مزيد باستخدام البشري المتوسطة السلف العصبية التي تحتوي على عامل أساسي نمو الخلايا الليفية (bFGF) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وتتميز الخلايا الناجم عن ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية، مثل nestin وSOX2. هذه الخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تكون متباينة أيضا على الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا و oligodendrocytes في وسائل الإعلام التمايز محدد. يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق عينات الدم المحيطية الإنسان، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية لمزيد من التمايز للخلايا العصبية في المختبر لنماذج من الاضطرابات العصبية ويمكن أن تقدم الدراسات المتعلقة المرضية وعلاج تلك الأمراض.

Introduction

في المختبر وقد استخدمت الثقافات العصبية كأداة أساسية للدراسات الأمراض العصبية. الحيوان الأساسي (ومعظمهم من القوارض) الثقافات العصبية 1 و 2 و خطوط الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الاورام الدبقية أو الأورام الأخرى هي الأكثر استخداما في مثل هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد تم الاعتراف بأن هناك اختلافات كبيرة بين القوارض والخلايا البشرية. لا يمكن أن تترجم العديد من النتائج على أساس القوارض للإنسان. وعلاوة على ذلك، مع التطورات السريعة في تحليل المعلومات الجينومية الجماعية والتحرير الجين السهل نسبيا وكله تسلسل الجينوم، فإن الاتجاه هو المزيد والمزيد من استعداداتها لاكتشاف المرض الجينات معرضة وترسيم وظائفهم وأدوارهم في أمراض معينة، مما يجعل الخلايا العصبية البشرية قليلة وقد خطوط الخلايا استخدام تقتصر فقط. من الناحية النظرية، والثقافات العصبية الأولية الإنسان المستمدة من عينات من الجهاز العصبي المريض هي أفضل خيار إلا أنه من المستحيل للحصول عليها. ميث بالتالي البديلالمواد المستنفدة للأوزون ضرورية. في السنوات الأخيرة، تم ملاحقة بعض المناهج، مع اثنين من كونها الأكثر تمييزها. بعد تطوير هذه التقنية لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) باستخدام الماوس والخلايا الجسدية الإنسان 3، 4، والخلايا العصبية يمكن أن يكون أبعد متباينة منها 5-7. ومع ذلك، وتوليد وتوصيف IPSC يطالب كثيفة العمالة، والتقنيات، والمدخلات الوقت، وأحيانا حتى باهظة. بعد فترة وجيزة، تم تطوير نهج آخر لتحويل الخلايا العصبية مباشرة من الخلايا الجسدية 8، 9. وبما أن الخلايا العصبية الناتجة غير التكاثري، فإنه يحد تطبيقه في الدراسات المكثفة وفحص المخدرات، الأمر الذي يتطلب كمية كبيرة من الخلايا. للاستفادة من التقنيات على حد سواء، الاشتقاق المباشر للالجذعية العصبية / الخلايا الاصلية من الخلايا الجسدية تم استكشافها من قبل عدة مجموعات 10-12، التي تتجاوز عملية شاقة من الجيل IPSC وتوصيف ولكن لا يزال. نحن نتعاملقصر عدد محترم من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز العصبي لاحق. لقد أظهرنا سابقا أنه بعد إدخال عوامل النسخ ياماناكا في الخلايا الاصلية المكونة للدم والخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تتولد مباشرة باستخدام خلية العصبية السلف اختيار المتوسطة 13. هنا، ونحن التقرير الطريقة بالتفصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إثراء المكونة للدم السلف خلايا من الدم الكامل الكبار

ملاحظة: السلف المكونة للدم الخلايا أو CD34 + الخلايا يمكن تنقيته من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) المستمدة من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك دم الحبل السري، المواد فصادة الكريات البيض والدم كله باستخدام الأساليب القائمة على التدرج الكثافة الطرد المركزي. طريقة سردها هنا يستخدم الدم الكامل كمثال على ذلك.

  1. عزل PBMCs من الدم المجموع:
    1. إضافة 4.5 مل من فصل الخلايا اللمفاوية المتوسطة إلى أنبوب SepMate من قبل pipetting من خلال ثقب المركزي للإدراج.
    2. تمييع عينة من الدم مع حجم مساو من DPBS العقيمة التي تحتوي على مصل الإنسان 2٪ (ت / ت). على سبيل المثال، وتمييع 5 مل من العينة مع 5 مل من DPBS + 2٪ مصل البشري.
    3. إضافة نموذج المخفف من قبل pipetting عليه الجانب من الأنبوب. والحرص على عدم صب عينة مباشرة من خلال ثقب مركزي.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 1،200 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. إزالة بعناية طاف فوق طبقة PMBC.
    6. جمع طبقة PBMC (غائم) في أنبوب جديد.
    7. إضافة 15 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) المحتوية على مصل الإنسان 2٪ في أنبوب والطرد المركزي في 150 x ج لمدة 10 دقيقة في RT مع قبالة الفرامل.
    8. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 15 مل من DPBS المحتوية على مصل الإنسان 2٪. حساب عدد الخلايا.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 690 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة كافة طاف من الأنبوب.
    10. Resuspend الخلايا في 1 × 10 7 خلايا في 15 مل من تعديل Dulbecco Iscove في متوسطة (IMDM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية (ت / ت) والمصل البشري 10٪ (ت / ت).
    11. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة قبل عزل خلايا CD34 +.
  2. اختيار الإيجابي للCD34 + الخلايا من PBMCs باستخدام CD34 MultiSort كيت:
    ملاحظة: العمل بسرعة واستخدام حلول تبريد مسبقا لجعل خلايا البرد ومنع السدالأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع العلامات الخلايا غير محدد فقا للتعليمات عدة.
    1. جمع كل PMBCs في أنبوب 50 مل وحساب عدد من مجموع الخلايا في المتوسط.
    2. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة كافة طاف تماما.
    3. و resuspend تصل إلى 10 8 خلايا لكل 300 ميكرولتر العازلة في حبة (DPBS تحتوي على 0.5٪ مصل الإنسان (ت / ت) و 2 ملي EDTA).
    4. إضافة 100 ميكرولتر من FCR حجب الكاشف وإضافة 100 ميكرولتر من MultiSortMicroBeads CD34.
    5. تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الثلاجة (2-8 ° C).
    6. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من العازلة حبة لكل 10 8 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة طاف تماما.
    7. و resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة.
    8. وضع العمود MACS LS في المجال المغناطيسي لMACS فاصل وإعداد العمود قبل الشطف مع 3 مل من العازلة حبة.
    9. تطبيق تعليق خلية على CENTEص من العمود. غير المسماة الخلايا سوف تتدفق من خلالها يمكن جمعها إذا المفضل.
    10. غسل العمود ثلاث مرات مع 3 مل من العازلة حبة.
    11. إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب 15 مل.
    12. إضافة 5 مل من العازلة حبة على العمود وتدفق على الفور خارج الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس في العمود.
    13. إضافة 20 ميكرولتر من MultiSort الإصدار الكاشف لكل 1 مل من التعليق الخلية. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الثلاجة (2-8 ° C).
    14. إضافة 1 - 2 مل من العازلة حبة لكل 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة طاف تماما.
    15. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة حبة لكل 10 7 الخلايا.
    16. إضافة 30 ميكرولتر من MultiSort وقف الكاشف لكل 10 7 الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة.
    17. إضافة 5 مل من العازلة حبة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.

2. اشتقاق المستحثة الخلايا الجذعية العصبية من CD34 + الخلايا

  1. CD34 + الخلايا الثقافة:
    ملاحظة: يجب أن تستخدم أعدت طازجة المتوسطة خلال 7 أيام عند تخزينها في الثلاجة. ويمكن ملاحظة هامة فقدان خلايا CD34 بعد 24 ساعة ولكن ينبغي أن يكون انتشار كبير من خلايا ملحوظ، وخاصة بعد يوم 5. إذا يقلل من عدد الخلايا بشكل مستمر أو عدم وجود انتشار، فإنه يعني إما نوعية سيئة من خلايا متوسطة أو CD34 والخلايا لا ينبغي أن تستخدم للخطوة التالية.
    1. في resuspend والثقافة CD34 + الخلايا في CD34 الحفاظ المتوسطة (StemSpan SFEM المتوسطة التي تحتوي على ثرومبوبويتين الإنسان (TPO، 100 نانوغرام / مل)، FMS مثل التيروزين كيناز 3 (العميد بحري-3) يجند (100 نانوغرام / مل)، ووقف عامل الخلية (SCF، 100 نانوغرام / مل)، انترلوكين 6 (IL-6، 20 نانوغرام / مل)، وانترلوكين 7 (IL-7، 20 نانوغرام / مل)) في لوحة 24-جيدا (حتى 3 × 10 5 / جيد في 1 مل من المتوسط ​​لكل بئر) في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    2. AFثالثا مدار 24 ساعة، وجمع الخلايا العائمة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 110 x ج في RT للتخلص من أي خلايا المرفقة والحطام الخلية. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من CD34 الحفاظ على الطازجة المتوسطة والبذور في الجديدة 24 لوحة جيدا (تصل إلى 1 × 10 5 / جيد) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 5 أيام إضافية.
    3. استبدال نصف المتوسط ​​كل يوم الآخرين من خلال الشفط بعناية النصف العلوي من طاف في حين أن CD34 + الخلايا تطفو على الجزء السفلي من الآبار (الشكل 1A).
  2. سينداي ترنسفكأيشن الفيروس:
    1. في يوم 5، وجمع خلايا CD34 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.
    2. resuspend الخلايا في متوسطة جديدة في 1 × 10 5 / بشكل جيد في لوحة 24-جيدا في 1 مل من المتوسط.
    3. ذوبان الجليد مجموعة إعادة برمجة cytotune-الجذع سينداي عن طريق غمر أولا قيعان من الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 ثانية ثم ذوبان الجليد تماما لتي RT. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب ووضعها على الجليد. تحضير خليط فيروس سينداي عن طريق خلط حجم الموصى بها من كل فيروس المدرجة على شهادة تحليل (COA) لالكثير المقابلة. MOI 15 يوصى.
    4. إضافة سينداي مزيج الفيروس إلى كل بئر من خلايا CD34. مزيج من الآبار عن طريق هز بلطف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. مراقبة كفاءة ترنسفكأيشن بعد 24 ساعة. لاحظ أن المجاميع الخلية وتكوين المجال هي مؤشرات للنجاح ترنسفكأيشن (الشكل 1B).
    6. تغيير نصف المتوسط ​​عن طريق نقل بعناية النصف العلوي من متوسطة إلى آخر أيضا. إذا كانت هناك مجالات الخلايا في البئر الجديد، إضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة.
    7. تغيير المتوسطة كل في اليوم الآخر بتكرار الخطوة 2.2.6.
  3. العصبية تحريض الخلايا الجذعية:
    ملاحظة: اعتمادا على الظروف الخلية، وبعد حوالي 5 أو 7 أيام ترنسفكأيشن، سوف الخلايا الملتصقة أحادي الطبقة تصل الى 30 -50٪ التقاء (الشكل 1C).
    1. إزالة supernatants تحتوي على خلايا العائمة والمجالات وثم يضاف 1 مل من العصبية المتوسطة السلف (Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة: خليط من المغذيات F-12 (DMEM / F12)، التي تحتوي على 1X N2 ملحق، 0.1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري ( BSA)، 1٪ (ت / ت) المضادات الحيوية، و 20 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، و 20 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)) في الخلايا الملتصقة.
    2. اختياريا، فصل المجالات الخلية بواسطة pipetting بلطف وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من العصبية المتوسطة السلف في 24 لوحة جيدا الجديدة المغلفة مع matrigel في التعليمات والنسخ الاحتياطي.
    3. تغيير المتوسطة كل يوم حتى تصل إلى خلايا 60-80٪ متموجة، وعادة بعد 1 أسبوع.
    4. تجاهل طاف وإضافة في 1 مل من الجذعية العصبية المتوسطة الخلية (المصل خالية المتوسطة، NSC SFM). فصل الخلايا باستخدام مكشطة الخلية يتبعقبل pipetting لطيف جدا.
    5. إزالة الخلايا والبذور كل منهم في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. إضافة 1 مل أخرى من العصبية المتوسطة الخلايا الجذعية لجعل 2 مل سائل الإعلام لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    6. تغيير المتوسطة كل في اليوم الآخر.
    7. وعندما وصلت خلايا 60٪ التقاء، وفصل replate الخلايا في نسبة 1: 3 باتباع الخطوات المذكورة في 2.3.4 و2.3.6.
  4. تجميد الخلايا الجذعية العصبية:
    1. إعداد الخلايا الجذعية العصبية تجميد المتوسطة من خلال إضافة 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية. إبقاء المتوسطة تجميد على الجليد.
    2. فصل الخلايا في لوحة 6 جيدا، وذلك باستخدام مكشطة خلية تليها pipetting بلطف. عدد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.
    3. resuspend الخلايا العصبية في متوسطة الخلايا الجذعية في 1 × 10 6 / مل. إضافة نفس الحجم من تجميد متوسطة إلى الخلايا.
    4. إضافة 1 مل (5 × 10 5 مجموع الخلايا) من الخلايا في cryovial. تجميد الخلايا باستخدام تجميد حاوية السيد Froster اتباع تعليمات.

3. تمايز الخلايا العصبية

  1. الخلايا العصبية التمايز:
    1. عندما تصل الخلايا الجذعية العصبية 80٪ التقاء، فصل الخلايا الجذعية العصبية باستخدام شرطي المطاط ثم فصل من قبل pipetting بلطف.
    2. عد الخلايا وضبط تركيز إلى 1 × 10 5 / مل في العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية.
    3. لتمايز الخلايا العصبية، لوحة الخلايا على بولي-D-يسين / laminin المغلفة غطاء ينزلق في 24 لوحات جيدا في 1 × 10 5 / جيد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    4. استبدال المتوسطة مع العصبية المتوسطة التمايز (DMEM / F12 تحتوي على 1X N2 ملحق، 1X B27 ملحق، 300 نانوغرام / مل المخيم، 0.2 ملي فيتامين C، 10 نانوغرام / مل الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (BDNF) و 10 نانوغرام / مل الخلايا الدبقية مشتقة عامل التغذية العصبية (GDNF)) AFثالثا 24 ساعة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. تغيير العصبي المتوسطة التمايز مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع.
  2. التمايز Astroglial:
    1. فصل الخلايا الجذعية العصبية من قبل pipetting.
    2. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10 4 خلية / مل. البذور الخلايا على 24 لوحات جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. استبدال المتوسطة مع DMEM / F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة.
    4. تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع. إذا خلايا الوصول إلى نقطة التقاء قبل 2 أسابيع، replate الخلايا الخطوات التالية 3.2.1 و3.2.2.
  3. دبقية قليلة التغصن التمايز:
    1. فصل الخلايا الجذعية العصبية من قبل pipetting.
    2. عدد الخلايا والبذور 1 × 10 5 الخلايا على بولي-L-الأورنيثين المغلفة 24 لوحات جيدا في 1 مل من دبقية قليلة التغصن differentiمتوسطة أوجه تتألف من DMEM / F12 تحتوي على ملحق N2، 10 نانوغرام / مل من الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو-AA (PDGF-AA)، 2 نانوغرام / مل من neurotrophin-3 (NT-3)، 2 نانوغرام / مل من القنفذ سونيك ( SHH)، و 3 نيوتن متر من ثلاثي يودو ثيرونين (T3). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع.
    4. استبدال المتوسطة مع DMEM / F12 مع 1xN2 ملحق و 3 نيوتن متر من T3 و ثقافة الخلايا لمدة أسبوع إضافي لالبروتين الأساسي المايلين (ب ب) الإنتاج.

4. المناعي تلطيخ

  1. استبدال وسائل الإعلام مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. تجاهل PFA وتغسل مع PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-T) 3 مرات، 5 دقائق في كل مرة.
  3. Permeabilize الخلايا مع PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. منع الخلايا مع PBS-T تحتوي على 4٪ مصل الماعز لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. احتضان الخلايا مع antibo الأساسي المقابلةوفاة مخففة في تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 2 ساعة على RT أو O / N في غرفة باردة PBS-T.
  6. غسل الخلايا لمدة 3 مرات مع PBS-T، 5 دقائق في كل مرة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب وجود تألقي باستخدام 1 المقابلة: 400 التخفيف في تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 1 ساعة على شاكر في الظلام PBS-T.
  7. غسل الخلايا مع تحتوي على 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 10 دقيقة في RT PBS-T.
  8. غسل الخلايا مرتين أخريين مع PBS-T لمدة 5 دقائق كل في RT.
  9. مراقبة الخلايا المسمى باستخدام المجهر والتقاط الصور (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نوعية خلايا CD34 أمر بالغ الأهمية لنجاح العصبي التنبيغ الخلايا الجذعية. خلايا CD34 جودة عالية تتكاثر خلال أول يومين من الثقافة ويبدو أنها غير ملتصقة، وخلايا مستديرة متجانس، وتطفو فوق الجزء السفلي من السفن الثقافة (الشكل 1A). نتائج العدوى الناجحة في المجاميع خلية، والذي يوسع على مر الزمن (الشكل 1B)، في حين قد تحدث المجاميع خلية غير محددة خلال زراعة الخلايا، التي تعمل على توسيع والجمعيات هي فضفاضة. وعادة ما تظهر الخلايا الملتصقة حول ثلاثة إلى خمسة أيام بعد ترنسفكأيشن. وهم في الغالب ثنائي القطب، وسوف تتكاثر لجعل الطبقات الوحيدة (الشكل 1C). بعد التحديد مع السلف العصبي المتوسطة خلية معظم الخلايا الملتصقة هي nestin وSOX2 ايجابية ولكن OCT4 السالب (الشكل 2). الخلايا الجذعية العصبية التي يسببها يمكن أن يكون أبعد متباينة إلى الخلايا العصبية والدبقية (الشكل 3).

والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (1)
يمكن ملاحظة الشكل 1. التغيرات المورفولوجية للخلايا CD34 بعد ترنسفكأيشن فيروس سينداي. (A) عدد كبير من خلايا CD34 في وقت ترنسفكأيشن. (ب) المجال مثل الركام الخلايا يمكن ملاحظة 24 ساعة بعد سينداي ترنسفكأيشن الفيروس الذي يوسع خلال الوقت. ظهرت (C) الخلايا الملتصقة القطبين في الغالب بعد 5 أيام من ترنسفكأيشن. ويبين (D و E) الأشكال التضاريسية النموذجية للخلايا الجذعية العصبية بعد الاستقراء مع العصبي المتوسطة السلف والتوسع. شريط مقياس: 200 ميكرون ل(A) و (B)، 400 ميكرون للآخرين الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

هين صفحة = "دائما"> الشكل 2
الشكل 2. الخلايا الجذعية المستحثة العصبي تعبر عن علامات الخلايا الجذعية العصبية. الخلايا الجذعية العصبية تعبر عن nestin وSOX2 ولكن ليس OCT4. شريط مقياس: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. العصبية الخلايا الجذعية التمايز. قد تختلف الخلايا الجذعية العصبية إلى الخلايا العصبية مع علامة (A)، astroglial GFAP علامة (B)، وعلامات دبقية قليلة التغصن O4 (C). شريط مقياس: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرد بروتوكول مفصلة لتوليد مباشرة الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الاصلية المكونة للدم الطرفية.

مقارنة مع الخلايا الليفية، الدم المحيطي البشري هو أكثر سهولة. باستخدام بروتوكول المقدمة، أكثر من 1 × 10 5 الخلايا المكونة للدم السلف، أو خلايا إيجابية CD34، يمكن المخصب من 10 مل من الدم الكامل. على الرغم من أن التلوث مع الصفائح الدموية وعادة لا يمكن الوقاية منها، ويمكن تقليص النتيجة عن طريق الطرد المركزي أقل سرعة وأنها لا تتداخل مع جيل الخلايا الجذعية العصبية. ومع ذلك، فإن نوعية وعدد الخلايا CD34 تحديد الإنتاج النهائي من الخلايا الجذعية العصبية. نوعية خلايا CD34 يمكن الحكم تقريبا من استجابتها للثقافة CD34 المتوسطة. استجابة إيجابية، وهذا يعني انتشار السريع للخلايا CD34 في المتوسط، أمر بالغ الأهمية للتحول الناجح لاحق. إذا فشلت خلايا CD34 لتتكاثر، أو حتى الخضوع لفقدان الخلية كبيرة، ثم transfoسوف rmation يصبح من الصعب، مما أدى إلى خلايا أقل التكاثري. وهكذا يقترح لبدء التحول مع الخلايا CD34 نوعية جيدة فقط. وعلى الرغم من 1 × 10 5 خلايا CD34 تكفي لباحث من ذوي الخبرة، ويمكن استخدام 3 × 10 5 خلايا بالنسبة للمبتدئين.

باستخدام فيروس سينداي يوفر عدم اندماج، إلى حد كبير طريقة فعالة ومريحة لإدخال العوامل النسخي إلى خلايا تستهدف 14 و 15. في الأصل تستخدم لتوليد IPSC، تم أيضا استخدام معاملات ياماناكا بنجاح لتوليد الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من الخلايا الليفية (11). في تقرير سابق باستخدام بروتوكول المقدمة، فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا ويمكن أيضا أن تستخدم لتوليد الخلايا الجذعية العصبية من دم الحبل السري أو الخلايا المكونة للدم الدم الطرفية الكبار. مقارنة مع استخدام خزعة الجلد لزراعة الخلايا الليفية، والدم هو أكثر سهولة وملاءمة للحصول على. الى جانب ذلك، تشير التقارير إلى أن السلف المكونة للدمخلايا أيضا التعبير عن بعض علامات محددة العصبية 16، مما يجعلها الخيار الأفضل لتوليد الخلايا الجذعية العصبية. في الواقع، بعد عدوى فيروس سينداي، فإن معظم الخلايا أحادي الطبقة المرفقة أعرب nestin، والعصبية علامة الخلية الجذعية، باستثناء المستعمرات المدمجة أكثر المجمعة، والبعض منها قد تؤدي إلى IPSC في نقطة زمنية لاحقة. وهكذا أحادي الطبقة المرفقة من خلايا يتم جمع وزيادة المحتضنة في العصبي المتوسطة خلية سلفية، التي استخدمت على نطاق واسع في زراعة الخلايا العصبية السلف الأولية، لتسهيل مصير الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا.

هناك توازن دقيق في الحفاظ على الخلايا الجذعية العصبية. من ناحية، ويفضل أن الخلايا لديها القدرة على نحو أفضل المتكاثرة وأن passaged عدة مرات ممكن. من ناحية أخرى، وسهولة التفريق لهم الخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية أيضا. وتستخدم اثنين من وسائل الإعلام المختلفة لتحقيق هذا التوازن. يتم اختيار تستخدم على نطاق واسع المتوسطة السلف العصبي للنeural وقف هوية الخلية الحث / الاختيار، وهي عملية حاسمة في المقام الأول. ويمكن أن تستخدم أيضا في الممرات لاحقة لتعزيز قدرات التمايز العصبية. ومع ذلك، فإن الخلايا الجذعية العصبية هشة جدا وحساسة للغاية أن التعرض لفترات طويلة لالعصبي المتوسطة خلية سلفية قد تمنع تكاثر الخلايا بشكل كبير ويؤدي إلى التفريق المفرط. وهكذا يستخدم العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية للمساعدة في الانتعاش خلية وتسهيل التوسع الخلية. يتم استخدام المتوسطة السلف العصبي لتحريض العصبي في الممر 1، عندما تصبح الخلايا متموجة. إذا لاحظت تثبيط الإفراط في تكاثر الخلايا وسمية، فمن الضروري استبدال المتوسطة في وقت مبكر مع الخلايا الجذعية العصبية المتوسطة. ومع ذلك، العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية هو أقل فعالية في اختيار العصبية. وبالتالي مع مرور الوقت، خاصة مع الإفراط في متموجة الخلايا الجذعية أو تأخير الركض العصبية، يمكن أن تلوث مع الخلايا غير العصبية أو عدم التمايز العصبي يحدث. وهكذا فإن الخلايا بحاجة لأن passaged بانتظام، عند أقل من 60٪ متموجة ومرة ​​واحدة على الأقل في الأسبوع. اختيار العصبية مع العصبية المتوسطة خلية سلفية ممكنة في الممرات في وقت لاحق لإعادة تأسيس الهوية العصبية. وثمة عامل آخر يؤثر على stemness من الخلايا الجذعية العصبية هو طلاء لوحات زراعة الأنسجة. طلاء مع matrigel أو بولي-D-يسين يمكن أن تساعد في مرفق الخلية في البداية في حالة الخلايا يصعب إرفاق خلال replating. ولكن التعرض لفترة طويلة لنتائج طلاء بأعداد مرور أقل. وذلك لأن طلاء يعزز عملية تمايز الخلايا، ويمكن أن يؤدي إلى المزيد من الضرر للخلايا أثناء التفكك.

كملخص، وتستخدم هذا البروتوكول فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل ياماناكا لاشتقاق مباشرة الخلايا الجذعية العصبية البشرية غضون 3 - 4 أسابيع من الخلايا الاصلية المكونة للدم البالغين تم الحصول عليها من الوصول إليها عينات الدم الطرفية. الخلايا الجذعية العصبية يمكن أن يكون أبعد متباينة إلى الخلايا العصبية والدبقية. يتجاوز هذه الطريقةعمليات الجيل IPSC طويلة ومعقدة المستخدمة حاليا، ويمكن استخدامه لفي المختبر خلية النمذجة الثقافة لمختلف الاضطرابات العصبية، والتي قد تمثل أفضل الاختلافات الوراثية في اضطرابات معينة، وخاصة من عينات المرضى الفردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte separation medium Lonza 17-829E 1x
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 ml
Human serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl 2 mM
MACS LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM medium Stemcell Technologies 9650 1x
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1x
TPO Peprotech 300-18 100 ng/ml
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/ml
SCF Peprotech 300-07 100 ng/ml
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/ml
IL-7 Peprotech 200-07 20 ng/ml
IPS Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life Technologies 12400-024 1x
N2 supplement Life Technologies 17502-048 1x
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life Technologies 17504-044 1x
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1x
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-ornithine Sigma P4957 1x
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1x
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1,000 dilution
Anti-SOX2 antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1,000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 μg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 95، الخلايا المكونة للدم السلف، الخلايا الجذعية العصبية، والدم، وفيروس سينداي، الخلايا العصبية، والتمايز
الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C.… More

Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter