Summary
En metode ble utviklet for å direkte utlede humane nevrale stamceller fra hematopoetiske progenitorceller anriket fra perifere blodceller.
Abstract
Menneskelig sykdom spesifikke nevronale kulturer er avgjørende for å generere in vitro modeller for menneskelige nevrologiske sykdommer. Reiser imidlertid mangel på tilgang til primære menneskelige voksen nevrale kulturer unike utfordringer. Den siste utviklingen i induserte pluripotente stamceller (IPSC) gir en alternativ tilnærming til å utlede nevrale kulturer fra hudfibroblaster gjennom pasientspesifikk IPSC, men denne prosessen er arbeidskrevende, krever spesiell kompetanse og store mengder ressurser, og kan ta flere måneder. Dette forhindrer den brede anvendelsen av denne teknologien til studiet av nevrologiske sykdommer. Å overvinne noen av disse problemene, har vi utviklet en metode for å utlede nevrale stamceller direkte fra voksent menneske perifert blod, utenom IPSC avledning prosessen. Hematopoetiske progenitorceller anriket fra et voksent menneske perifert blod ble dyrket in vitro og transfektert med Sendai-virus-vektorer inneholdende transkripsjonsfaktorer Sox2, oktober3/4, Klf4, og c-Myc. Transfeksjon resulterer i morfologiske forandringer i cellene som er videre valgt ved hjelp av human neurale stamcellemedium inneholdende basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). De resulterende celler som er kjennetegnet ved ekspresjon for neural stamcelle markører, slik som nestin og SOX2. Disse nevrale stamceller kan bli ytterligere differensiert til nevroner, astroglia og oligodendrocytter i spesifisert differensiering media. Ved hjelp av lett tilgjengelige humane perifere blodprøver, kan denne fremgangsmåte benyttes til å utlede neurale stamceller for ytterligere differensiering til nerveceller in vitro for modellering av nevrologiske sykdommer og kan videre studier relatert til patogenesen og behandling av disse sykdommer.
Introduction
In vitro neuronale kulturer har blitt brukt som et viktig verktøy for studier av nevrologiske sykdommer. Primær dyr (for det meste gnager) nevrale kulturer 1, 2 og menneske nevrale cellelinjer som stammer fra hjernesvulst eller andre svulster er den mest brukte i slike studier. Imidlertid har det blitt erkjent at det er betydelige forskjeller mellom gnagere og humane celler. Mange funn basert på gnagere kan ikke oversettes til mennesker. Videre, med den raske utviklingen innen analysere masse genomisk informasjon og relativt enkelt gen redigering og hele genomsekvensering, er mer og mer rettet til å oppdage sykdomsutsatte gener og opptegning sine funksjoner og roller i spesifikke sykdommer, noe som gjør de få menneske nevronale trenden cellelinjer har bare begrenset bruk. Teoretisk humane primære nevrale kulturer som stammer fra prøver av pasienten nervesystemet er det beste valget, men de er umulig å oppnå; dermed alternativ methODS er nødvendig. De siste årene har enkelte tilnærminger blitt forfulgt, med to blir det mest synlig. Etter utviklingen av teknikken med å generere induserte pluripotente stamceller (IPSC) ved hjelp av mus og humane somatiske celler 3, 4, kan nevrale celler bli ytterligere differensiert fra dem 5-7. Men å generere og karakter IPSC krever intensiv arbeidskraft, teknikker og tid innspill, noen ganger også uoverkommelig. Kort tid etter ble en annen tilnærming utviklet til direkte forvandle nevronale celler fra somatiske celler 8, 9. Som de resulterende neuroner er ikke-proliferativ, begrenser det dens anvendelse i intensive studier og medikamentscreening, noe som krever en stor mengde celler. For å ta fordelene av både teknikker, direkte avledning av nevrale stilk / stamceller fra somatiske celler har blitt utforsket av flere grupper 10-12, som omgår den kjedelige prosessen med IPSC generasjon og karakterisering men fortsatt provides et anstendig antall nevrale stamceller for senere nevrale differensiering. Vi har tidligere vist at etter innføring av Yamanaka transkripsjonsfaktorer i hematopoetiske progenitorceller, neurale stamceller kan bli direkte dannet ved anvendelse av en neural stamceller velge medium 13. Her rapporterer vi metoden i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. berikelse av blodkreft stamceller fra voksne Whole Blood
NOTE: Hematopoetiske progenitorceller eller CD34 + celler kan bli renset fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) avledet fra en rekke kilder inkludert ledningen blod, leukaferese materiale og helt blod ved hjelp av densitetgradientsentrifugering baserte metoder. Metoden oppført her bruker fullblod som et eksempel.
- Isolering av PBMC fra Whole Blood:
- Legg 4,5 ml lymfocytt separasjonsmedium til SepMate røret ved pipettering av den gjennom det sentrale hull i innsatsen.
- Fortynn blodprøven med et likt volum av sterilt DPBS inneholdende 2% menneske-serum (v / v). Eksempelvis fortynnes 5 ml av prøven med 5 ml DPBS + 2% humant serum.
- Tilsett fortynnet prøve ved å pipettere det ned på siden av røret. Pass på å ikke helle prøven direkte gjennom den sentrale hullet.
- Sentrifuger ved 1200 x g i 10 min ved RT.
- Fjern forsiktig supernatanten over PMBC lag.
- Samle PBMC lag (uklar) inn i et nytt rør.
- Tilsett 15 ml av Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) inneholdende 2% menneske-serum i røret og sentrifuger ved 150 xg i 10 min ved RT med bremsen på.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 15 ml DPBS inneholdende 2% menneske-serum. Telle antall celler.
- Sentrifuger ved 690 xg i 10 min ved RT. Fjern all supernatanten fra røret.
- Resuspender celler ved 1 x 10 7 celler pr 15 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) inneholdende 1% antibiotika (v / v) og 10% humant serum (v / v).
- Inkuber cellene O / N ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator før isolering av CD34 + celler.
- Positiv utvelgelse av CD34 + celler fra PBMC bruker CD34 Multi Kit:
MERK: Arbeid raskt og bruke forhåndskjølte løsninger for å gjøre cellene kaldt og unngå tildekkingav antistoffer på celleoverflaten og ikke-spesifikk cellemerking per settet instruksjon.- Samle alle PMBCs i en 50 ml tube og telle det totale antallet celler i mediet.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min. Fjern alle supernatanten helt.
- Resuspender opp til 10 8 celler pr 300 ul i vulsten (DPBS-buffer inneholdende 0,5% humant serum (v / v) og 2 mM EDTA).
- Tilsett 100 mL av FcR Blokkering Reagens og tilsett 100 mL av CD34 MultiSortMicroBeads.
- Bland godt og inkuber i 30 minutter i kjøleskap (2 - 8 ° C).
- Vask cellene ved tilsetning av 2 ml av perlebuffer per 10 8 celler og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved RT. Fjern supernatanten helt.
- Resuspender opp til 10 8 celler i 500 ul buffer.
- Plasser MACS LS kolonne i det magnetiske felt fra et MACS Separator og forberede kolonne ved skylling med 3 ml av perle buffer.
- Påfør cellesuspensjon på center av kolonnen. Umerkede celler vil strømme gjennom, som kan samles hvis ønskelig.
- Kolonnen vaskes tre ganger med 3 ml av perle buffer.
- Fjerne kolonnen fra separator og plassere den på en 15 ml tube.
- Tilsett 5 ml av perle buffer på kolonnen og umiddelbart spyle ut de magnetisk merkede celler ved å skyve stempelet inn i kolonnen.
- Legg 20fil Multi Slipp Reagens per 1 ml av cellesuspensjonen. Bland godt og inkuber i 10 minutter i kjøleskap (2 - 8 ° C).
- Legg 1 - 2 ml av perlebuffer per 10 7 celler og sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved RT. Fjern supernatanten helt.
- Resuspender celler i 50 ul perle buffer per 10 7 celler.
- Tilsett 30 pl av Multi Stop reagens per 10 7 celler og inkuberes i 15 minutter i kjøleskap.
- Tilsett 5 ml av perle buffer og sentrifugeres cellene ved 300 x g i 10 min ved RT. Kast supernatanten.
2. Utledning av Induced neuralstamceller fra CD34 + -celler
- CD34 + -celler kultur:
MERK: Nylaget medium bør brukes innen 7 dager når den oppbevares i kjøleskapet. Betydelig tap av CD34-celler kunne observeres etter 24 timer, men den betydelige spredning av celler bør være merkbar, spesielt etter dag 5. Hvis celletallet avtar kontinuerlig eller det er ingen spredning, innebærer det heller dårlig kvalitet av mellom eller CD34-celler og cellene skal ikke benyttes til neste trinn.- Resuspender og kultur CD34 + -celler i CD34 opprettholde medium (StemSpan SFEM medium inneholdende humant trombopoietin (TPO, 100 ng / ml), fms-lignende tyrosinkinase 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) og stamcellefaktor (SCF, 100 ng / ml), interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) og interleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) i en 24-brønners plate (opp til 3 x 10 5 / brønn i 1 ml medium pr brønn) ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- After 24 timer, samle de flytende celler og sentrifuger cellene ved 110 x g ved romtemperatur for å kvitte seg med eventuelle tilknyttede celler og celleavfall. Kast supernatanten og resuspender cellene i 1 ml friskt CD34 opprettholde mediet og frø i en ny 24-brønners plate (opp til 1 x 10 5 / brønn) ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator i ytterligere 5 dager.
- Erstatte halvparten av mediet hver andre dag ved forsiktig å aspirere den øverste halvdel av supernatanten mens CD34 + celler som flyter på bunnen av brønnene (figur 1A).
- Sendai virus transfeksjon:
- På dag 5, samle CD34-celler og sentrifuger cellene ved 170 x g i 10 min ved RT. Kast supernatanten.
- Resuspender cellene i friskt medium ved 1 x 10 5 / brønn i en 24-brønners plate i 1 ml medium.
- Tine en cytotune-iPS Sendai omprogrammering kit ved først å dyppe bunnen av rørene i en 37 ° C vannbad i 10 sek og deretter helt tine ent RT. Kort sentrifuger rørene og sette dem på is. Klargjør Sendai virus blanding ved å blande den anbefalte volumet av hvert virus notert på Certificate of Analysis (COA) for tilsvarende mye. MOI 15 anbefales.
- Legg Sendai-virus blanding til hver brønn av CD34-celler. Bland brønnene ved forsiktig risting. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Observere transfeksjonseffektiviteten etter 24 timer. Legg merke til at celle aggregater og sfære dannelse er indikatorer for vellykket transfeksjon (figur 1B).
- Endre halvparten av mediet ved forsiktig å overføre den øverste halvdelen av medium til et annet godt. Hvis det er celle kuler i den nye brønnen, legge den samme mengde friskt medium.
- Endre medium hver andre dag ved å gjenta trinn 2.2.6.
- Nevrale stamcelle induksjon:
MERK: Avhengig av celleforhold, ca 5 eller 7 dager etter transfeksjon, vil ettlagskulturer heftende celler nå 30 -50% samløpet (figur 1C).- Fjern supernatanten inneholdende flytende celler og kuler, og deretter tilsett 1 ml av neurale stamcellemedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12), inneholdende 1 x N2-supplement, 0,1% (w / v) bovint serumalbumin ( BSA), 1% (v / v) antibiotika, 20 ng / ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), og 20 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF)) i de adherente celler.
- Eventuelt kan dissosiere cellekuler ved forsiktig pipettering, og sentrifugere cellene ved 170 x g i 10 min. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av neurale stamcellemedium i en ny 24-brønners plate belagt med matrigel per instruksjon som sikkerhetskopi.
- Endre medium annenhver dag til cellene nå 60 - 80% sammenflytende, vanligvis etter en uke.
- Kast supernatanten og legge i en ml nevrale stamcelle medium (serum fritt medium, NSC SFM). Dissosiere cellene ved hjelp av en celleskrape fulgtav svært forsiktig pipettering.
- Fjerne celler og frø alle av dem inn i en brønn i en 6-brønns plate. Legge ytterligere 1 ml av neurale stamcelle medium for å lage 2 ml media for hver brønn. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Endre medium hver andre dag.
- Når cellene nådde 60% samløpet, distansere og replate cellene på 1: 3 ratio følge trinnene i 2.3.4 og 2.3.6.
- Frysing av nevrale stamceller:
- Forbered neural stamcelle frysemedium ved tilsetning av 20% dimetylsulfoksyd (DMSO) i den neurale stamcelle medium. Hold frysing medium på is.
- Dissosiere celler i en 6-brønners plate, ved hjelp av celleskrape etterfulgt av forsiktig pipettering. Telle cellene. Sentrifuger cellene ved 170 x g i 10 min ved RT. Kast supernatanten.
- Resuspender cellene i neurale stamcelle medium ved 1 x 10 6 / ml. Tilsett samme volum av frysemedium til cellene.
- Tilsett 1 ml (5 x 10 5 totalt celler) av celler i en kryoampulle. Fryse cellene ved hjelp av en Mr. Froster frysing container etter instruksjon.
3. Neural Cell Differensiering
- Nevronale celler differensiering:
- Når nevrale stamceller nå 80% samløpet, løsne nevrale stamceller ved hjelp av en gummi politimann og deretter distansere ved forsiktig pipettering.
- Tell cellene og justere konsentrasjonen til 1 x 10 5 / ml i neurale stamcelle medium.
- For neuronal differensiering, plate cellene på poly-D-lysin / laminin belagte dekkglass i 24-brønners plater ved 1 x 10 5 / brønn. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Erstatte mediet med nevrale differensiering medium (DMEM / F12 inneholdende 1 x N2 supplement, 1x B27 supplement, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM vitamin C, 10 ng / ml hjerne avledet neurotrofisk faktor (BDNF) og 10 ng / ml gliacelle avledet neurotrop faktor (GDNF)) after 24 hr. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Endre nevrale differensiering medium to ganger i uken i 2 uker.
- Astroglial differensiering:
- Dissosiere de neurale stamceller ved pipettering.
- Tell cellene og justere cellekonsentrasjonen til 5 x 10 4 celler / ml. Seed cellene på 24-brønners plater. Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Erstatte mediet med DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkuberes cellene ved 37 ° C i 5% CO2 inkubator.
- Endre medium to ganger i uken i 2 uker. Hvis cellene nå samløpet før to uker, replate cellene følgende trinn 3.2.1 og 3.2.2.
- Oligodendrocyte differensiering:
- Dissosiere de neurale stamceller ved pipettering.
- Tell celler og frø 1 x 10 5 celler på poly-L-Ornithin belagte 24-brønners plater i 1 ml oligodendrocytt differensiertasjon medium bestående av DMEM / F12 inneholdende N2-supplement, 10 ng / ml blodplate-avledet vekstfaktor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrofin-3 (NT-3), 2 ng / ml av sonisk hedgehog ( shh) og 3 nM trijodtyronin (T3). Inkuber cellene ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator.
- Endre medium to ganger i uken i 2 uker.
- Erstatte mediet med DMEM / F12 med 1xN2 supplement og 3 nM av T3 og kultur cellene for en ekstra uke for myelinbasisprotein (MBP) produksjon.
4. Immunfluorescens Farging
- Erstatte media med 4% Paraformaldehyde (PFA). Inkuber i 10 minutter ved RT.
- Kast PFA og vask med PBS inneholdende 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 ganger, 5 min hver gang.
- Permeabilisere cellene med PBS inneholdende 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved RT.
- Blokkere cellene med PBS-T inneholdende 4% geiteserum i 20 minutter ved RT.
- Cellene inkuberes med tilsvarende primære Antibodør fortynnet i PBS-T inneholdende 0,1% BSA i 2 timer ved RT, eller O / N i kjølerommet.
- Vask cellene 3 ganger med PBS-T, 5 min hver gang. Cellene inkuberes med tilsvarende sekundære antistoffer kombinert med et fluorokrom anvendelse av 1: 400 fortynning i PBS-T inneholdende 0,1% BSA i 1 time på en ristemaskin i mørket.
- Vask cellene med PBS-T inneholdende 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 10 minutter ved RT.
- Vask cellene to ganger med PBS-T i 5 minutter hver ved RT.
- Observere de merkede cellene ved hjelp av et mikroskop og ta bilder (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvaliteten på CD34-celler er avgjørende for suksess for neural stamcelle transduksjon. Høy kvalitet CD34 celler sprer løpet av de første par dagene av kultur og vises som ikke tilhenger, homogent runde celler, flyter like over bunnen av kulturskip (figur 1A). De vellykkede infeksjon resulterer i celle aggregater, som vokser over tid (figur 1B), mens ikke-spesifikke celleaggregater kan oppstå under cellekultur, som utvider og foreninger er løs. Heftende celler vises vanligvis rundt tre til fem dager etter transfeksjon; de er stort sett bipolar og vil spre seg til å gjøre monolagene (figur 1C). Etter at et valg med neurale stamcellemedium fleste av de adherente celler er nestin og SOX2 positiv, men negativ OCT4 (figur 2). De induserte neurale stamceller kan videre differensiert til neuroner og glia (figur 3).
ent "fo: keep-together.within-side =" always ">
Figur 1. Morfologiske forandringer av CD34-celler etter transfeksjon. Sendai-virus (A) Signifikant antall CD34-celler kan observeres ved transfeksjon. (B) Sphere som celleaggregater kan observeres 24 timer etter Sendai virus transfeksjon som utvider seg under tiden. (C) Mostly bipolare heftende celler dukket opp etter fem dager med transfeksjon. (D og E) Typiske morfologi av nevrale stamceller vises etter induksjon med nevrale stamfar medium og ekspansjon. Målestokk:. 200 mikrometer for (A) og (B), 400 mikrometer for de andre Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Induced nevrale stamceller uttrykke nevrale stamcellemarkører. Neural stamceller uttrykke nestin og SOX2 men ikke OCT4. Målestokk:. 200 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. neuralstamceller differensiering. De neurale stamceller kan bli differensiert til celler med neuronal markør (A), astroglial markør GFAP (B), og oligodendrocytt markører O4 (C). Målestokk:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En detaljert protokoll for direkte å produsere neurale stamceller fra perifert hematopoetiske stamceller er gitt.
Sammenlignet med fibroblastceller, er humant perifert blod mer tilgjengelige. Ved hjelp av den fremlagte protokoll, mer enn 1 x 10 5 hematopoietiske stamceller, eller CD34-positive celler, kan anrikes fra 10 ml fullblod. Selv om forurensning med blodplater er vanligvis ikke forebygges, kan det være lett reduseres ved lavere hastighet sentrifugering, og det ikke forstyrrer nevrale stamcelle generasjon. Imidlertid vil kvaliteten og antall CD34 celler bestemme den endelige produksjon av nevrale stamceller. Kvaliteten på CD34-celler kan grovt bedømt av deres respons på CD34 kulturmedium. En positiv respons, det vil si hurtig proliferasjon av CD34-celler i mediet, er kritisk for senere vellykket transformasjon. Hvis CD34 cellene ikke klarte å spre seg, eller enda gjennomgå betydelig celle tap, da den omdannedebekreftelse vil bli vanskelig, noe som resulterer i mindre proliferative celler. Dermed er det foreslått å bare starte transformasjon med god kvalitet CD34 celler. Selv om en x 10 5 CD34 celler er nok for en erfaren forsker, kan 3 x 10 5 celler brukes for startere.
Ved hjelp av Sendai viruset gir en ikke-integrasjon, svært effektiv og praktisk måte å innføre transkripsjonsfaktorer i målretting cellene 14, 15. Opprinnelig brukt til å generere IPSC, ble Yamanaka faktorer også med hell brukes til å generere nevrale stamceller direkte fra fibroblaster 11. I en tidligere rapport presentert ved hjelp av protokollen, kan Sendai-virus inneholdende Yamanaka faktorer også brukes til å generere nevrale stamceller fra navlestrengsblod eller voksne hematopoetiske perifere blodceller. Sammenlignet med å bruke hudbiopsi for dyrking av fibroblaster, er blodet mer tilgjengelig og enklere å få. Dessuten er det rapportert at blodkreft stamfarceller uttrykker også visse nerve spesifikke markører 16, noe som gjør det til et bedre valg for å generere nevrale stamceller. Faktisk, etter Sendai-virus-infeksjon, har de fleste av de vedlagte monolagcellene uttrykt nestin, en neural stamcelle markør, bortsett fra de mer aggregerte kompakte kolonier, og noen av disse kan gi opphav til IPSC på et senere tidspunkt. Således vedlagte monolag av celler blir oppsamlet og ytterligere inkubert i neurale stamcelle medium, som har blitt mye brukt i primær neurale stamcelle kultur, for å lette den neurale stamcelle skjebnen til cellene.
Det er en hårfin balanse i å opprettholde de nevrale stamceller. På den ene siden, er det foretrukket at cellene skal ha bedre prolifererende evne og for å bli passert så mange ganger som mulig. På den annen side er det lettere å skille dem til neuroner også kritisk. To forskjellige media brukes for å oppnå denne balanse. Den brukte neurale stamcelle medium er valgt for nEURAL stamcelle identitet induksjon / utvalg, som er kritisk prosess i første omgang. Den kan også brukes ved senere passeringer for å forsterke de neuronal differensiering evner. Men de nevrale stamceller er svært skjør og følsom slik at langvarig eksponering for nevrale stamcelle medium kan i stor grad hemme celledeling og resultere i overdreven differensiering. Således neurale stamcellemediet blir brukt til å hjelpe utvinningscelle og for å lette celleutvidelse. Det neurale stamcellemedium brukes for nevral induksjon ved en passasje, når cellene blir sammenflytende. Hvis overdreven inhibering av celleproliferasjon og toksisitet er lagt merke til, er det nødvendig å erstatte mediet med tidlig neuralstamceller medium. Imidlertid er neurale stamcellemedium mindre effektive i neural valg; således over tid, spesielt med over-sammenflytende nevrale stamceller eller forsinket aging, kan forurensning med ikke-nevrale celler eller mangel på nevrale differensiering forekomme. Dermed cellene trenger for åbli passaged regelmessig, når det er mindre enn 60% sammenflytende og minst en gang i uken. Neural utvalg med nevrale stamcelle medium er mulig på senere passasjer å gjenopprette nevrale identitet. En annen faktor som påvirker stemness av nevrale stamceller er belegget av vevskulturplater. Belegg med matrigel eller poly-D-lysin kan hjelpe celleadhesjonen først i tilfelle cellene er vanskelig å feste under replating. Men langvarig eksponering for belegget resulterer i mindre passasje tall. Dette er fordi belegget forbedrer celledifferensieringsprosessen, og kan resultere i mer skade på cellene under dissosiasjon.
Som en oppsummering, denne protokollen som brukes Sendai virus som inneholder Yamanaka faktorer å direkte utlede menneskelige nevrale stamceller innen 3-4 uker fra voksne blodkreft stamceller hentet fra tilgjengelige perifere blodprøver. Nerve stamceller kan være ytterligere differensiert til nerveceller og gliaceller. Denne metoden omgårde lange og kompliserte IPSC genereringsprosesser som nå brukes, og kan anvendes for in vitro cellekultur modellering av ulike nevrologiske lidelser, som kan bedre representerer de genetiske forskjeller i spesifikke lidelser, spesielt fra individuelle pasientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
