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Developmental Biology

परिधीय रक्त Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52298
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1, 1
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

एक विधि सीधे परिधीय रक्त कोशिकाओं से समृद्ध hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था।

Abstract

मानव रोग विशिष्ट neuronal संस्कृतियों मानव मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए इन विट्रो मॉडल में पैदा करने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव वयस्क तंत्रिका संस्कृतियों के लिए उपयोग की कमी अद्वितीय चुनौतियों को जन्म देती है। प्रेरित स्टेम सेल में हाल के घटनाक्रम (IPSC) रोगी विशिष्ट IPSC के माध्यम से त्वचा fibroblasts से तंत्रिका संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है, लेकिन इस प्रक्रिया श्रम गहन है, विशेष विशेषज्ञता और संसाधनों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, और कई महीने लग सकते हैं। यह मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए इस तकनीक का व्यापक आवेदन को रोकता है। इनमें से कुछ मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम IPSC व्युत्पत्ति प्रक्रिया को दरकिनार सीधे मानव वयस्क परिधीय रक्त से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक विधि विकसित किया है। मानव वयस्क परिधीय रक्त से समृद्ध hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं इन विट्रो में सुसंस्कृत थे और, अक्टूबर ट्रांसक्रिप्शनल कारकों Sox2 युक्त सेंडाइ वायरस वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट3/4, Klf4, और सी-Myc। आगे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) युक्त मानव तंत्रिका पूर्वज माध्यम का उपयोग कर से चुना जाता है, जो कोशिकाओं में morphological परिवर्तन में अभिकर्मक का परिणाम है। जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं ऐसे nestin और Sox2 के रूप में तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर, के लिए अभिव्यक्ति की विशेषता है। इन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को आगे न्यूरॉन्स, अस्थिकणिका और निर्दिष्ट भेदभाव मीडिया में oligodendrocytes के लिए भेदभाव किया जा सकता है। आसानी से सुलभ मानव परिधीय रक्त के नमूनों का उपयोग करना, इस विधि मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए तंत्रिका कोशिकाओं को आगे भेदभाव के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और उन बीमारियों के रोगजनन और उपचार से संबंधित पढ़ाई अग्रिम कर सकते हैं।

Introduction

इन विट्रो में neuronal संस्कृतियों मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए एक बुनियादी उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। प्राथमिक पशु (ज्यादातर कृंतक) तंत्रिका संस्कृतियों 1, 2 और gliomas या अन्य ट्यूमर से निकाली गई मानव तंत्रिका कोशिका लाइनों सबसे अधिक इस्तेमाल इस तरह के अध्ययन में हैं। हालांकि, यह कृंतक और मानव कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं कि मान्यता दी गई है। कृन्तकों के आधार पर कई निष्कर्षों मनुष्य के लिए अनुवाद नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, जन जीनोमिक जानकारी और अपेक्षाकृत आसान जीन संपादन और पूरे जीनोम अनुक्रमण का विश्लेषण करने में तेजी से विकास के साथ, इस रुझान को अधिक से अधिक गियर कुछ मानव न्यूरोनल बनाता है, जो रोग होने का खतरा जीन की खोज और विशिष्ट रोगों में उनके कार्यों और भूमिकाओं का वर्णन करने के लिए है सेल लाइनों केवल उपयोग सीमित है। सैद्धांतिक रूप से, रोगी तंत्रिका तंत्र के नमूनों से व्युत्पन्न मानव प्राथमिक तंत्रिका संस्कृतियों का सबसे अच्छा विकल्प हैं, लेकिन वे प्राप्त करने के लिए असंभव है; इसलिए वैकल्पिक मेथODS जरूरी हैं। हाल के वर्षों में, कुछ दृष्टिकोण दो सबसे अलग पहचाना जा रहा है, के साथ चलाया जा रहा है। पैदा करने के लिए प्रेरित किया स्टेम कोशिकाओं (IPSC) का उपयोग माउस और मानव दैहिक कोशिकाओं की तकनीक के विकास के बाद 3, 4, तंत्रिका कोशिकाओं उन्हें 5-7 से आगे भेदभाव किया जा सकता है। हालांकि, सृजन और IPSC निस्र्पक गहन श्रम, तकनीक, और समय इनपुट की मांग है, कभी कभी भी बेहद। कुछ ही समय बाद, एक और दृष्टिकोण सीधे दैहिक कोशिकाओं 8, 9 से neuronal कोशिकाओं को बदलने के लिए विकसित किया गया था। जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स गैर प्रफलन हो रहे हैं, यह गहन अध्ययन और कोशिकाओं की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है जो दवा स्क्रीनिंग, में अपने आवेदन की सीमा। दोनों तकनीकों, तंत्रिका स्टेम के प्रत्यक्ष व्युत्पत्ति का लाभ लेने के / दैहिक कोशिकाओं से पूर्वज कोशिकाओं को अभी भी IPSC पीढ़ी और लक्षण लेकिन प्रावधानों की थकाऊ प्रक्रिया को नजरअंदाज जो कई समूहों 10-12, द्वारा पता लगाया गया हैदेस बाद में तंत्रिका भेदभाव के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के एक सभ्य संख्या। हम पहले हिमेटोपोयटिक पूर्वज कोशिकाओं में यामानाका प्रतिलेखन कारक की शुरूआत के बाद, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को सीधे मध्यम 13 का चयन एक तंत्रिका पूर्वज सेल का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है कि पता चला है। यहाँ, हम विस्तार से विधि की रिपोर्ट।

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Protocol

वयस्क पूरे रक्त से 1. संवर्धन Hematopoietic पूर्वज के प्रकोष्ठों

नोट: Hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं या CD34 + कोशिकाओं घनत्व ढाल centrifugation आधारित तरीकों का उपयोग कर गर्भनाल रक्त, leukapheresis सामग्री और पूरे रक्त सहित विभिन्न स्रोतों से ली गई परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से शुद्ध किया जा सकता है। यहां सूचीबद्ध विधि एक उदाहरण के रूप में पूरे रक्त का उपयोग करता है।

  1. पूरे रक्त से PBMCs का अलगाव:
    1. डालने के मध्य छेद के माध्यम से यह pipetting द्वारा SepMate ट्यूब लिम्फोसाइट जुदाई माध्यम की 4.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 2% मानव सीरम युक्त बाँझ DPBS के एक बराबर मात्रा के साथ खून का नमूना पतला (वी / वी)। उदाहरण के लिए, DPBS के लिए + 2% मानव सीरम के 5 मिलीलीटर के साथ नमूना के 5 मिलीलीटर पतला।
    3. ट्यूब के पक्ष इसे नीचे pipetting द्वारा पतला नमूना जोड़ें। केंद्रीय छेद के माध्यम से सीधे नमूना डालना नहीं ख्याल रखना।
    4. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1200 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. ध्यान से PMBC परत के ऊपर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    6. एक नया ट्यूब में PBMC परत (बादल छाए रहेंगे) ले लीजिए।
    7. ब्रेक के साथ बंद आरटी पर 10 मिनट के लिए 150 XG पर 2% मानव ट्यूब में सीरम और सेंट्रीफ्यूज युक्त है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 2% मानव सीरम युक्त DPBS के 15 मिलीलीटर में गोली resuspend। कोशिकाओं की संख्या की गणना।
    9. आरटी पर 10 मिनट के लिए 690 XG पर अपकेंद्रित्र। ट्यूब से सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    10. 15 1% एंटीबायोटिक दवाओं युक्त Iscove के संशोधित है Dulbecco मध्यम (IMDM) की मिलीलीटर (वी / वी) और 10% मानव सीरम प्रति एक 10 x 7 कोशिकाओं Resuspend कोशिकाओं (वी / वी)।
    11. CD34 + कोशिकाओं को अलग-थलग करने से पहले 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं हे / एन सेते हैं।
  2. CD34 MultiSort किट का उपयोग PBMCs से CD34 + कोशिकाओं की सकारात्मक चयन:
    नोट: तेजी से काम करते हैं और ठंड कोशिकाओं बनाने के लिए पूर्व ठंडा समाधान का उपयोग करें और कैपिंग को रोकने केकिट अनुदेश प्रति कोशिका की सतह और गैर विशिष्ट सेल लेबलिंग पर एंटीबॉडी की।
    1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सभी PMBCs लीजिए और मध्यम में कुल कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    2. 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। पूरी तरह से सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    3. 10 8 मनका बफर में 300 μl प्रति कोशिकाओं (DPBS युक्त 0.5% मानव सीरम (वी / वी) और 2 मिमी EDTA) तक Resuspend।
    4. FCR को अवरूध्द अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें और CD34 MultiSortMicroBeads के 100 μl जोड़ें।
    5. अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 30 मिनट के लिए सेते (2-8 डिग्री सेल्सियस)।
    6. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर मनका 10 8 कोशिकाओं प्रति बफर और अपकेंद्रित्र के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धो लें। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    7. बफर के 500 μl में 10 8 कोशिकाओं के लिए ऊपर Resuspend।
    8. एक एमएसीएस विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एमएसीएस लोकसभा स्तंभ प्लेस और मनका बफर के 3 मिलीलीटर के साथ rinsing द्वारा स्तंभ तैयार करते हैं।
    9. Cente पर सेल निलंबन लागू करेंस्तंभ के आर। Unlabeled कोशिकाओं अगर पसंद है, जिसके माध्यम से एकत्र किया जा सकता बहेगा।
    10. धो स्तंभ मनका बफर के 3 मिलीलीटर के साथ तीन बार।
    11. विभाजक से स्तंभ निकालें और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब पर जगह है।
    12. स्तंभ पर मनका बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत स्तंभ में सवार धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल की कोशिकाओं को बाहर निकलवाने।
    13. सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर प्रति MultiSort रिलीज अभिकर्मक के 20 μl जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और फ्रिज में 10 मिनट के लिए सेते (2-8 डिग्री सेल्सियस)।
    14. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं 10 7 कोशिकाओं प्रति मनका बफर के 2 मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र - 1 जोड़ें। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    15. 10 7 कोशिकाओं प्रति मनका बफर के 50 μl में Resuspend कोशिकाओं।
    16. 10 7 कोशिकाओं प्रति MultiSort बंद करो अभिकर्मक के 30 μl जोड़ें और फ्रिज में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    17. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं मनका बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।

CD34 + कोशिकाओं से प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के 2. व्युत्पत्ति

  1. CD34 + कोशिकाओं संस्कृति:
    नोट: जब रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत हौसले से तैयार मध्यम 7 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। उल्लेखनीय CD34 कोशिकाओं नुकसान के 24 घंटे के बाद देखा जा सकता है, लेकिन सेल नंबर लगातार कम हो जाती है या कोई प्रसार अगर वहाँ कोशिकाओं की महत्वपूर्ण प्रसार विशेष रूप से दिन 5. के बाद, ध्यान देने योग्य होना चाहिए, यह बुरा मध्यम या CD34 कोशिकाओं की गुणवत्ता और कोशिकाओं या तो तात्पर्य अगले कदम के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए।
    1. CD34 में Resuspend और संस्कृति CD34 + कोशिकाओं (मानव thrombopoietin युक्त (StemSpan SFEM मध्यम एस सी एफ (टीपीओ, 100 एनजी / एमएल), एफएमएस तरह टाइरोसीन काइनेज 3 (फ्लाइट-3) लिगेंड (100 एनजी / एमएल) और सेल कारक स्टेम मध्यम बनाए रखने, 100 एनजी / एमएल), इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6, 20 एनजी / एमएल) और इंटरल्यूकिन-7 (आईएल 7, 24 अच्छी तरह से थाली में 20 एनजी / एमएल)) (अप करने के लिए 3 एक्स 10 5 / कुएं में 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से प्रति मध्यम) के 1 मिलीलीटर।
    2. वायु सेनाआतंकवाद से 24 घंटा, अस्थायी कोशिकाओं को इकट्ठा करने और किसी भी जुड़ी कोशिकाओं और सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए आरटी पर 110 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 अतिरिक्त दिनों के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नया 24 अच्छी तरह से थाली (अच्छी तरह से करने के लिए 1 एक्स 10 5 /) में ताजा CD34 बनाए रखने के मध्यम और बीज के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    3. CD34 + कोशिकाओं कुओं (चित्रा 1 ए) के तल पर चल रहे हैं, जबकि ध्यान से सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष आधा aspirating द्वारा मध्यम हर दूसरे दिन का आधा बदलें।
  2. सेंडाइ वायरस अभिकर्मक:
    1. 5 दिन पर, CD34 कोशिकाओं को इकट्ठा और आरटी पर 10 मिनट के लिए 170 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    2. अच्छी तरह से मध्यम के 1 मिलीलीटर में 24 अच्छी तरह से थाली में 1 एक्स 10 5 / पर ताजा मध्यम में कोशिकाओं Resuspend।
    3. पहले 10 सेकंड के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों के नीचे से डुबो कर एक cytotune आईपीएस सेंडाइ reprogramming के किट गला लें और फिर पूरी तरह से एक पिघलनाटी आर टी। संक्षेप में ट्यूब अपकेंद्रित्र और बर्फ पर डाल दिया। इसी बहुत कुछ के लिए विश्लेषण का प्रमाण पत्र (सीओए) पर सूचीबद्ध प्रत्येक वायरस की सिफारिश की मात्रा के मिश्रण से सेंडाइ वायरस मिश्रण तैयार करें। MOI के 15 सिफारिश की है।
    4. CD34 कोशिकाओं में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए सेंडाइ वायरस मिश्रण जोड़ें। धीरे झटकों से कुओं से मिलाएं। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. 24 घंटे के बाद अभिकर्मक दक्षता का निरीक्षण करें। सेल समुच्चय और क्षेत्र के गठन के सफल अभिकर्मक (चित्रा 1 बी) के लिए संकेतक हैं नोटिस।
    6. ध्यान से दूसरे करने के लिए माध्यम के शीर्ष आधे के हस्तांतरण में अच्छी तरह से मध्यम के आधे बदलें। नए कुएं में सेल क्षेत्रों कर रहे हैं, ताजा माध्यम का एक ही राशि में जोड़ें।
    7. कदम 2.2.6 दोहरा द्वारा दूसरे दिन मध्यम हर बदलें।
  3. तंत्रिका स्टेम सेल प्रेरण:
    नोट: सेल की स्थिति पर निर्भर करता है, के बारे में 5 या 7 दिनों के अभिकर्मक के बाद, monolayer के पक्षपाती कोशिकाओं 30 तक पहुंच जाएगा -50% संगम (चित्रा 1C)।
    1. पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 1x एन 2 पूरक, 0.1% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम albumin युक्त (DMEM / F12), (: (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम अस्थायी कोशिकाओं और क्षेत्रों युक्त supernatants निकालें और फिर तंत्रिका पूर्वज माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ने बीएसए), 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक दवाओं, बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक के 20 एनजी / एमएल (bFGF के), और पक्षपाती कोशिकाओं में epidermal वृद्धि कारक (EGF)) के 20 एनजी / एमएल।
    2. वैकल्पिक रूप से, धीरे pipetting द्वारा सेल क्षेत्रों को अलग कर देना और 10 मिनट के लिए 170 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और के रूप में वापस ऊपर अनुदेश प्रति Matrigel लेपित के साथ एक नया 24 अच्छी तरह से थाली में तंत्रिका पूर्वज माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend।
    3. 80% मिला हुआ आम तौर पर एक सप्ताह के बाद, - कोशिकाओं को 60 तक पहुंचने तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और तंत्रिका स्टेम सेल मध्यम (सीरम मुक्त मध्यम, एनएससी SFM) के 1 मिलीलीटर में जोड़ें। बाद सेल खुरचनी का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग कर देनाबहुत कोमल pipetting द्वारा।
    5. कोशिकाओं को हटाने और एक 6 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में उन सभी को बीज। तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम से एक और 1 मिलीलीटर प्रत्येक के लिए अच्छी तरह 2 मिलीलीटर मीडिया बनाने के लिए जोड़ें। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    6. दूसरे दिन मध्यम हर बदलें।
    7. कोशिकाओं 60% संगम पहुंचे तो अलग कर देना और एक में कोशिकाओं replate: 2.3.4 और 2.3.6 में चरणों का पालन 3 अनुपात।
  4. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की ठंड:
    1. तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम में 20% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) जोड़कर मध्यम ठंड तंत्रिका स्टेम सेल तैयार करें। बर्फ पर ठंड मध्यम रखें।
    2. धीरे pipetting द्वारा पीछा सेल खुरचनी का उपयोग करते हुए, एक 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को अलग कर देना। कोशिकाओं की गणना। आरटी पर 10 मिनट के लिए 170 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. 1 एक्स 10 6 / एमएल में तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम में कोशिकाओं Resuspend। कोशिकाओं को मध्यम ठंड का एक ही मात्रा में जोड़ें।
    4. 1 मिलीलीटर (5 एक्स 1 में जोड़ेंएक cryovial में कोशिकाओं के 0 से 5 कुल कोशिकाओं)। निर्देश के बाद एक श्री Froster ठंड कंटेनर का उपयोग कोशिकाओं रुक।

3. तंत्रिका सेल भेदभाव

  1. Neuronal कोशिकाओं भेदभाव:
    1. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को 80% संगम तक पहुँचते हैं, एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग कर तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग और फिर धीरे pipetting द्वारा अलग कर देना।
    2. कोशिकाओं की गणना और तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम में एक एक्स 10 5 / मिलीलीटर एकाग्रता समायोजित करें।
    3. न्यूरोनल भेदभाव के लिए, पाली-डी-लाइसिन / laminin लेपित कवर पर कोशिकाओं थाली में अच्छी तरह से 1 एक्स 10 5/24 अच्छी तरह से प्लेट में निकल जाता है। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. तंत्रिका भेदभाव मध्यम के साथ मध्यम बदलें (DMEM 1x एन 2 पूरक, 1x B27 पूरक, 300 एनजी / एमएल शिविर, 0.2 मिमी विटामिन सी, neurotrophic कारक (BDNF व्युत्पन्न 10 एनजी / एमएल मस्तिष्क) और 10 एनजी / एमएल glial सेल युक्त / F12 के व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF)) वायुसेनाआतंकवाद से 24 घंटा। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    5. दो हफ्तों के लिए एक सप्ताह में दो बार तंत्रिका भेदभाव मध्यम बदलें।
  2. Astroglial भेदभाव:
    1. Pipetting द्वारा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग कर देना।
    2. कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें। 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर कोशिकाओं बीज। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM / F12 के साथ मध्यम बदलें और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
    4. दो हफ्तों के लिए एक सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें। कोशिकाओं 2 सप्ताह पहले संगम तक पहुँच जाते हैं, कदम 3.2.1 और 3.2.2 निम्नलिखित कोशिकाओं replate।
  3. Oligodendrocyte भेदभाव:
    1. Pipetting द्वारा तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग कर देना।
    2. Oligodendrocyte differenti के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं और बीज पाली एल ओर्निथिन लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं की गणना, एन 2 पूरक युक्त DMEM / F12 के प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक-एए (PDGF-एए) के 10 एनजी / एमएल, neurotrophin-3 (एनटी-3) के 2 एनजी / एमएल, ध्वनि हाथी के 2 एनजी / एमएल मिलकर समझना मध्यम ( श्श्श), और ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3 की 3 एनएम)। सीओ 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं को सेते हैं।
    3. दो हफ्तों के लिए एक सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें।
    4. DMEM / 1xN2 पूरक के साथ F12 के और T3 के 3 एनएम और संस्कृति माइलिन बुनियादी प्रोटीन (MBP) के उत्पादन के लिए एक अतिरिक्त सप्ताह के लिए कोशिकाओं के साथ मध्यम बदलें।

4. immunofluorescence धुंधला

  1. 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ मीडिया की जगह। आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. पीएफए ​​त्यागें और पीबीएस 0.1% ट्राइटन X-100 (पीबीएस-टी) 3 बार, 5 मिनट के लिए हर बार युक्त से धो लें।
  3. पीबीएस आरटी पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 को रोकने के साथ कोशिकाओं permeabilize।
  4. पीबीएस टी आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% बकरी सीरम युक्त के साथ कोशिकाओं को अवरुद्ध करें।
  5. इसी प्राथमिक antibo साथ कोशिकाओं को सेतेठंडे कमरे में आर टी या हे / एन में 2 घंटे के लिए 0.1% BSA युक्त पीबीएस टी में पतला मर जाता है।
  6. पीबीएस टी, 5 मिनट प्रत्येक समय के साथ 3 बार के लिए कोशिकाओं को धो लें। अंधेरे में एक प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए 0.1% BSA युक्त पीबीएस टी में 400 कमजोर पड़ने: 1 का उपयोग कर एक fluorochrome के साथ युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी इसी के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  7. आरटी पर 10 मिनट के लिए 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त पीबीएस टी के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  8. आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस टी के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  9. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग लेबल की कोशिकाओं को ध्यान से देखें और ले फोटो (चित्रा 3)।

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Representative Results

CD34 कोशिकाओं की गुणवत्ता तंत्रिका स्टेम सेल पारगमन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। उच्च गुणवत्ता CD34 कोशिकाओं संस्कृति के दिनों की पहली जोड़ी के दौरान पैदा करना है और सिर्फ संस्कृति वाहिकाओं (चित्रा 1 ए) के नीचे से ऊपर चल, गैर पक्षपाती, homogenously दौर कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं। सेल का विस्तार है कि गैर विशिष्ट सेल समुच्चय सेल संस्कृति के दौरान हो सकता है, जबकि समय (चित्रा 1 बी) से अधिक फैलता है जो समुच्चय, और संगठनों में सफल संक्रमण के परिणाम ढीली कर रहे हैं। पक्षपाती कोशिकाओं आमतौर पर अभिकर्मक के बाद तीन से पाँच दिनों चारों ओर दिखाई देते हैं; वे ज्यादातर द्विध्रुवी हैं और monolayers (चित्रा 1C) बनाने के लिए पैदा करना होगा। तंत्रिका पूर्वज सेल के माध्यम से एक चयन के बाद पक्षपाती कोशिकाओं के सबसे nestin और Sox2 सकारात्मक लेकिन OCT4 नकारात्मक (चित्रा 2) हैं। प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं न्यूरॉन्स और glia (चित्रा 3) के लिए आगे भेदभाव किया जा सकता है।

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चित्रा 1. सेंडाइ वायरस अभिकर्मक के बाद CD34 कोशिकाओं के morphological परिवर्तन। (ए) CD34 कोशिकाओं के महत्वपूर्ण संख्या अभिकर्मक के समय पर मनाया जा सकता है। (बी) क्षेत्रः सेल समुच्चय की तरह समय के दौरान फैलता है जो सेंडाइ वायरस अभिकर्मक के बाद 24 घंटा मनाया जा सकता है। (सी) अधिकतर द्विध्रुवी पक्षपाती कोशिकाओं अभिकर्मक के 5 दिनों के बाद दिखाई दिया। (डी और ई) तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की विशिष्ट morphologies तंत्रिका पूर्वज मध्यम और विस्तार के साथ प्रेरण के बाद दिखाए जाते हैं। स्केल बार:। 200 (ए) के लिए माइक्रोन और (बी), दूसरों के लिए 400 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2. प्रेरित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करते हैं। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं नहीं OCT4 nestin और Sox2 लेकिन व्यक्त करते हैं। स्केल बार:। 200 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं neuronal मार्कर (ए), astroglial मार्कर GFAP (बी), और oligodendrocyte मार्कर के साथ कोशिकाओं के लिए भेदभाव किया जा सकता है O4 (सी)। स्केल बार:। 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सीधे परिधीय hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है।

Fibroblast कोशिकाओं की तुलना में, मानव परिधीय रक्त अधिक सुलभ है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल, अधिक से अधिक 1 एक्स 10 5 hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, या CD34 सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग करना, पूरे रक्त के 10 एमएल से समृद्ध किया जा सकता है। प्लेटलेट्स के साथ संदूषण आमतौर पर रोके नहीं है, यह आसानी से कम गति centrifugation द्वारा कम किया जा सकता है और यह तंत्रिका स्टेम सेल पीढ़ी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। हालांकि, CD34 कोशिकाओं की गुणवत्ता और संख्या तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के अंतिम उत्पादन का निर्धारण करेगा। CD34 कोशिकाओं की गुणवत्ता में मोटे तौर पर CD34 संस्कृति के माध्यम से उनकी प्रतिक्रिया से आंका जा सकता है। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया, मध्यम में CD34 कोशिकाओं का तेजी से प्रसार, जिसका अर्थ बाद में सफल परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण है। CD34 कोशिकाओं महत्वपूर्ण सेल नुकसान पैदा करना, या भी गुजरना करने में विफल रहा है, तो transformation कम proliferative कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप मुश्किल हो जाएगा। इस प्रकार यह केवल अच्छी गुणवत्ता CD34 कोशिकाओं के साथ परिवर्तन शुरू करने के लिए सुझाव दिया है। 1 एक्स 10 5 CD34 कोशिकाओं को एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए पर्याप्त हैं, 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं शुरुआत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सेंडाइ वायरस का प्रयोग एक गैर एकीकरण को लक्षित कोशिकाओं 14, 15 में ट्रांसक्रिप्शनल कारकों को पेश करने के लिए अत्यधिक कुशल और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। मूलतः IPSC पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया, यामानाका कारकों को भी सफलतापूर्वक fibroblasts के 11 से सीधे तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर पिछले एक रिपोर्ट में, यामानाका कारकों युक्त सेंडाइ वायरस भी गर्भनाल रक्त या वयस्क परिधीय हिमेटोपोयटिक रक्त कोशिकाओं से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Fibroblasts के संवर्धन के लिए त्वचा बायोप्सी उपयोग करने के साथ तुलना में, रक्त और अधिक सुलभ और पाने के लिए सुविधाजनक है। इसके अलावा, यह hematopoietic पूर्वज सूचना दी है किकोशिकाओं को भी यह तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक बेहतर विकल्प है, जिससे कुछ तंत्रिका विशिष्ट मार्करों 16 व्यक्त करते हैं। वास्तव में, सेंडाइ वायरस के संक्रमण के बाद, संलग्न monolayer की कोशिकाओं में से अधिकांश एक बाद में समय बिंदु पर IPSC को जन्म दे सकता है, जिनमें से कुछ अधिक एकत्रित कॉम्पैक्ट कालोनियों को छोड़कर, nestin, एक तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त किया। इस प्रकार की कोशिकाओं के साथ संलग्न monolayer एकत्र कर रहे हैं और आगे व्यापक रूप से कोशिकाओं के तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य की सुविधा के लिए, प्राथमिक तंत्रिका पूर्वज सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया गया है जो तंत्रिका पूर्वज सेल के माध्यम में incubated।

तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने में एक नाजुक संतुलन है। एक ओर, यह कोशिकाओं को बेहतर proliferating क्षमता है और संभव के रूप में कई बार के रूप में passaged किया जाना है कि पसंद है। दूसरी ओर, न्यूरॉन्स के लिए उन्हें फर्क की आसानी भी महत्वपूर्ण है। दो अलग अलग मीडिया इस संतुलन को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। व्यापक रूप से इस्तेमाल तंत्रिका पूर्वज मध्यम N के लिए चुना जाता हैeural पहली जगह में महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जो सेल पहचान प्रेरण / चयन, स्टेम। यह भी neuronal भेदभाव क्षमताओं को सुदृढ़ करने के लिए बाद में मार्ग पर इस्तेमाल किया जा सकता है। तंत्रिका पूर्वज सेल मध्यम करने के लिए लंबे समय तक निवेश बहुत सेल प्रसार रोकना और अत्यधिक भेदभाव में हो सकता है इतना है कि हालांकि, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बहुत नाजुक और संवेदनशील होते हैं। इस प्रकार तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम सेल वसूली में मदद करने के लिए और सेल विस्तार की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है। कोशिकाओं मिला हुआ हो जाते हैं जब तंत्रिका पूर्वज मध्यम, पारित होने के एक में तंत्रिका शामिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सेल प्रसार और विषाक्तता के अत्यधिक निषेध देखा जाता है, यह मध्यम तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के साथ जल्दी मध्यम बदलने के लिए आवश्यक है। हालांकि, तंत्रिका स्टेम सेल के माध्यम तंत्रिका चयन में कम प्रभावी है; इस प्रकार, विशेष रूप से अधिक-मिला हुआ स्टेम कोशिकाओं में देरी या passaging के तंत्रिका, गैर तंत्रिका कोशिकाओं या तंत्रिका भेदभाव की कमी के साथ संदूषण हो सकता है के साथ समय खत्म हो गया। इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए की जरूरतनियमित रूप से passaged किया, जब कम से कम 60% मिला हुआ है और कम से कम सप्ताह में एक बार। बाद में मार्ग तंत्रिका पहचान पैर जमाने में तंत्रिका पूर्वज सेल के माध्यम से तंत्रिका चयन संभव है। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के stemness को प्रभावित करता है कि एक और पहलू है टिशू कल्चर प्लेटों की कोटिंग है। Matrigel या पाली डी lysine के साथ कोटिंग कोशिकाओं replating दौरान संलग्न करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि पहले मामले में कम से सेल लगाव मदद कर सकते हैं। लेकिन कम बीतने संख्या में कोटिंग परिणाम के लिए लंबी अवधि के जोखिम। कोटिंग सेल भेदभाव प्रक्रिया को बढ़ाता है, और पृथक्करण के दौरान कोशिकाओं को और अधिक नुकसान में परिणाम हो सकता है क्योंकि यह है।

सुलभ परिधीय रक्त के नमूनों से प्राप्त वयस्क hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से 4 सप्ताह - एक सारांश के रूप में, इस प्रोटोकॉल सीधे 3 के भीतर मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए यामानाका कारकों युक्त सेंडाइ वायरस का इस्तेमाल किया। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं न्यूरॉन्स और glia को आगे भेदभाव किया जा सकता है। इस विधि को नजरअंदाजलंबी और जटिल IPSC पीढ़ी प्रक्रियाओं वर्तमान में इस्तेमाल किया और बेहतर विशेष रूप से रोगी व्यक्ति के नमूनों से, विशिष्ट विकारों में आनुवंशिक मतभेद प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, जो विभिन्न मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte separation medium Lonza 17-829E 1x
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 ml
Human serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl 2 mM
MACS LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM medium Stemcell Technologies 9650 1x
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1x
TPO Peprotech 300-18 100 ng/ml
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/ml
SCF Peprotech 300-07 100 ng/ml
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/ml
IL-7 Peprotech 200-07 20 ng/ml
IPS Sendai Reprogramming Kit Life Technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life Technologies 12400-024 1x
N2 supplement Life Technologies 17502-048 1x
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life Technologies 17504-044 1x
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1x
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-ornithine Sigma P4957 1x
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1x
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1,000 dilution
Anti-SOX2 antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1,000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 μg/ml

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References

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

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विकास जीवविज्ञान अंक 95 hematopoietic पूर्वज सेल तंत्रिका स्टेम सेल रक्त सेंडाइ वायरस न्यूरॉन भेदभाव
परिधीय रक्त Hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यक्ष प्रेरण
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Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C.… More

Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

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