Summary
Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.
Abstract
Menselijke ziektespecifieke neuronale cultures zijn essentieel voor het opwekken van in vitro modellen voor menselijke neurologische ziekten. Echter, het gebrek aan toegang tot primaire menselijke adulte neurale culturen verhoogt unieke uitdagingen. Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) biedt een alternatieve benadering om neurale culturen uit de huid fibroblasten af te leiden door de patiënt specifieke iPSC, maar dit is een arbeidsintensief proces, vraagt een specifieke deskundigheid en grote hoeveelheden van de middelen, en kan enkele maanden duren. Dit voorkomt de brede toepassing van deze technologie voor de studie van neurologische aandoeningen. Om deze problemen te overwinnen, hebben wij een methode om neurale stamcellen vloeien rechtstreeks voort uit humane volwassen perifeer bloed ontwikkeld en wordt het iPSC afleiding proces. Hematopoietische stamcellen verrijkt humane volwassen perifeer bloed werden in vitro gekweekt en getransfecteerd met Sendai-virus vectoren die transcriptionele factoren Sox2, oktober04/03, Klf4, en c-Myc. De transfectie resultaten morfologische veranderingen in de cellen die verder met humane neurale medium bevattende basische fibroblastgroeifactor (bFGF) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) worden geselecteerd. De resulterende cellen worden gekenmerkt door de expressie van neurale stamcel markers, zoals nestine en SOX2. Deze neurale stamcellen kunnen verder worden gedifferentieerd om neuronen, astroglia en oligodendrocyten in bepaalde differentiatie media. Met gemakkelijk toegankelijke humane perifere bloedmonsters, kan deze werkwijze worden toegepast om neurale stamcellen voor verdere differentiatie neurale cellen in vitro modellen van neurologische aandoeningen afgeleid en kunnen studies met betrekking tot de pathogenese en behandeling van deze ziekten bevorderen.
Introduction
In vitro neuronale culturen gebruikt als een fundamenteel instrument voor studies van neurologische aandoeningen. Primaire dier (meestal knaagdier) neurale cultures 1, 2 en humane neurale cellijnen afgeleid van gliomen of andere tumoren zijn de meest gebruikt in dergelijke studies. Er is echter erkend dat er aanzienlijke verschillen tussen knaagdieren en menselijke cellen. Veel bevindingen op basis van knaagdieren kan niet worden vertaald naar de mens. Bovendien, met de snelle ontwikkelingen in het analyseren van massale genomische informatie en de relatief gemakkelijke gen bewerken en whole genome sequencing, de trend is steeds meer gericht op het ontdekken van de ziekte vatbaar genen en het afbakenen van hun functies en rollen in specifieke ziekten, die de weinige menselijke neuronale maakt cellijnen hebben slechts beperkte gebruik. Theoretisch, humane primaire neurale culturen afkomstig van monsters van de patiënt zenuwstelsel zijn de beste keuze, maar ze zijn onmogelijk te verkrijgen; vandaar alternatief methODS zijn noodzakelijk. De afgelopen jaren zijn enkele benaderingen nagestreefd, met twee het meest onderscheiden. Na de ontwikkeling van de techniek van het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) met muis en humane somatische cellen 3, 4, neurale cellen kunnen verder worden gedifferentieerd van hen 5-7. Echter, het genereren en karakteriseren iPSC eist arbeidsintensief, technieken en tijd invoeren, soms zelfs onbetaalbaar. Kort daarna werd een andere benadering ontwikkeld direct transformeren neuronale cellen van somatische cellen 8, 9. Aangezien de resulterende neuronen niet-proliferatieve, beperkt het de toepassing in de intensieve studies en geneesmiddelscreening, die een grote hoeveelheid cellen vereist. Om de voordelen van beide technieken, directe afleiding van neurale stamcellen te nemen / heeft stamcellen uit somatische cellen onderzocht door verschillende groepen 10-12, waarin het moeizame proces van iPSC generatie en karakterisering, maar nog steeds provi omzeiltdes een fatsoenlijk aantal neurale stamcellen voor later neurale differentiatie. We hebben eerder aangetoond dat na de invoering van de Yamanaka transcriptiefactoren in hematopoietische progenitorcellen, neurale stamcellen kunnen direct gegenereerd met een neurale cel selecteren medium 13. Hier melden wij de methode in detail.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verrijking van hematopoëtische stamcellen uit volwassen volbloed
OPMERKING: Hematopoietische voorlopercellen of CD34 + cellen kunnen worden gezuiverd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit diverse bronnen waaronder navelstrengbloed, leukaferese materiaal en volbloed met dichtheidsgradiënt centrifugatie gebaseerde methoden. De methode die hier wordt vermeld gebruikt volbloed als voorbeeld.
- Isolatie van PBMC uit volbloed:
- Voeg 4,5 ml van lymfocyt scheiding medium om de SepMate buis door pipetteren het door de centrale opening van het inzetstuk.
- Verdun het bloedmonster met een gelijk volume steriele DPBS met 2% humaan serum (v / v). Bijvoorbeeld, verdun 5 ml monster met 5 ml van DPBS + 2% humaan serum.
- Voeg het verdunde monster door pipetteren beneden de zijkant van de buis. Zorg ervoor dat u het monster direct giet door het centrale gat.
- Centrifugeer bij 1200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof boven de PMBC laag zorgvuldig.
- Verzamel de PBMC laag (troebel) in een nieuwe buis.
- Voeg 15 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met 2% humaan serum in de buis en centrifugeer bij 150 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur met de rem uitgeschakeld.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 ml van DPBS met 2% humaan serum. Tel het aantal cellen.
- Centrifugeer bij 690 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder al de bovenstaande vloeistof uit de tube.
- Resuspendeer cellen bij 1 x 10 7 cellen per 15 ml van Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) met 1% antibiotica (v / v) en 10% humaan serum (v / v).
- Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C in 5% CO2 incubator voor het isoleren van CD34 + cellen.
- Positieve selectie van CD34 + cellen uit PBMC met CD34 Multisort Kit:
OPMERKING: Werk snel en gebruik voorgekoeld oplossingen aan cellen koud te maken en het afdekken voorkomenvan antilichamen aan het celoppervlak en niet-specifieke cellen per labeling kit instructie.- Verzamel alle PMBC's in een 50 ml buis en tel het totaal aantal cellen in het medium.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 min. Verwijder al het bovenstaande volledig.
- Resuspendeer tot 10 8 cellen per 300 pl in bead buffer (DPBS met 0,5% humaan serum (v / v) en 2 mM EDTA).
- Voeg 100 ul van FcR Blocking reagens en voeg 100 ul van CD34 MultiSortMicroBeads.
- Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten in de koelkast (2 - 8 ° C).
- Was de cellen door toevoeging van 2 ml buffer per kraal 10 8 cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant volledig.
- Resuspendeer tot 10 8 cellen in 500 pi buffer.
- Plaats MACS LS kolom in het magnetisch veld van een MACS Separator en kolom bereiden door spoelen met 3 ml buffer kraal.
- Solliciteer celsuspensie op de center van de kolom. Ongelabelde cellen zullen stromen door die kan worden verzameld indien gewenst.
- Waskolom driemaal met 3 ml buffer kraal.
- Verwijder de kolom uit de afscheider en plaats het op een buis van 15 ml.
- Voeg 5 ml van de kraal buffer op de kolom en onmiddellijk spoelen van de magnetisch gelabelde cellen door het indrukken van de zuiger in de kolom.
- Voeg 20 ul van Multisort release Reagens per 1 ml celsuspensie. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten in de koelkast (2 - 8 ° C).
- Voeg 1-2 ml buffer per kraal 10 7 cellen en de cellen gecentrifugeerd bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant volledig.
- Resuspendeer cellen in 50 ui buffer per kraal 10 7 cellen.
- Voeg 30 ul van Multisort stopreagens per 10 7 cellen en incubeer gedurende 15 minuten in de koelkast.
- Voeg 5 ml kralen buffer en centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
2. Afleiding van geïnduceerde neurale stamcellen uit CD34 + cellen
- CD34 + cellen cultuur:
OPMERKING: Vers bereide medium dient binnen 7 dagen te worden gebruikt wanneer ze worden bewaard in de koelkast. Significant CD34 cellen schade kan worden waargenomen na 24 uur maar significante proliferatie van cellen worden gevoeld, vooral na dag 5. Indien het aantal cellen continu afneemt of geen proliferatie, het impliceert ook slechte kwaliteit drager of CD34 cellen en de cellen mag niet worden gebruikt voor de volgende stap.- Resuspendeer en cultuur CD34 + cellen in CD34 handhaven medium (StemSpan SFEM medium met humaan trombopoietine (TPO, 100 ng / ml), fms-achtige tyrosine kinase 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) en stamcelfactor (SCF, 100 ng / ml), interleukine-6 (IL-6, 20 ng / ml) en interleukine-7 (IL-7, 20 ng / ml)) in een 24-well plaat (maximaal 3 x 10 5 / putje in 1 ml medium per putje) bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- After 24 uur, het verzamelen van de drijvende cellen en centrifuge de cellen op 110 xg bij RT om zich te ontdoen van alle aangesloten cellen en celresten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml vers medium en CD34 handhaven zaad in een nieuwe plaat met 24 putjes (1 x 10 5 / putje) bij 37 ° C in 5% CO2 incubator gedurende 5 dagen.
- Vervang de helft van het medium elke andere dag door voorzichtig opzuigen de bovenste helft van supernatant terwijl de CD34 + cellen drijven op de bodem van de putjes (figuur 1A).
- Sendaivirus transfectie:
- Op dag 5, verzamel CD34 cellen en centrifugeer de cellen bij 170 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in vers medium met 1 x 10 5 / putje in een 24 putjes plaat in 1 ml medium.
- Ontdooi een cytotune-iPS Sendai herprogrammering kit door eerst onderdompelen van de bodem van de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 10 seconden en vervolgens volledig ontdooien eent RT. Kort centrifuge de buizen en leg ze op ijs. Bereid de Sendai virus mengsel door het mengen van de aanbevolen hoeveelheid van elk genoteerd op het Certificate of Analysis (COA) voor de overeenkomstige veel virus. MOI 15 wordt aanbevolen.
- Voeg Sendai virus mix aan elk putje van CD34-cellen. Meng de putten door zachtjes te schudden. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Let op de transfectie-efficiëntie na 24 uur. Merk op dat celaggregaten en bol vorming, zijn indicatoren voor een succesvolle transfectie (Figuur 1B).
- Wijzig de helft van het medium door voorzichtig overdracht van de bovenste helft van het medium naar het andere goed. Als er cel bollen in de nieuwe well dezelfde hoeveelheid vers medium.
- Veranderen medium elke andere dag, herhaalt u stap 2.2.6.
- Neurale stamcellen inductie:
Opmerking: Afhankelijk van de cel omstandigheden ongeveer 5 of 7 dagen na transfectie, wordt monolaag hechtende cellen te bereiken 30 -50% confluentie (figuur 1C).- Verwijder de supernatanten die drijvende cellen en bollen en voeg 1 ml van neurale medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12), bestaande uit 1x N2 supplement, 0,1% (w / v) runderserumalbumine ( BSA), 1% (v / v) antibiotica, 20 ng / ml basische fibroblast groeifactor (bFGF), en 20 ng / ml epidermale groeifactor (EGF)) in de hechtende cellen.
- Eventueel dissociëren de cel sferen door voorzichtig pipetteren en centrifugeer de cellen bij 170 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml progenitorceltransplanten medium in een nieuwe plaat met 24 putjes bekleed met Matrigel per instructie als back-up.
- Verander het medium om de andere dag tot in de cellen te bereiken 60-80% samenvloeiing, meestal na 1 week.
- Verwijder het supernatant en voeg in 1 ml van neurale stamcellen medium (serum-vrij medium, NSC SFM). Distantiëren de cellen met een cel schraper gevolgddoor zeer zacht pipetteren.
- Verwijder de cellen en zaden allemaal in één putje van een 6-wells plaat. Voeg nog 1 ml van neurale stamcellen medium tot 2 ml media te maken voor elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Veranderen medium elke andere dag.
- Wanneer cellen bereikte 60% samenvloeiing, distantiëren en replate de cellen op 1: 3 verhouding van de stappen in 2.3.4 en 2.3.6.
- Bevriezing van neurale stamcellen:
- Bereid neurale stamcellen invriesmedium door toevoeging van 20% dimethylsulfoxide (DMSO) in de neurale stamcellen medium. Houd de bevriezing medium op ijs.
- Distantiëren cellen in een 6-well plaat, met celschraper gevolgd door voorzichtig pipetteren. Tel de cellen. Centrifugeer de cellen bij 170 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in neurale stamcellen medium met 1 x 10 6 / ml. Voeg hetzelfde volume ijskoud medium aan de cellen.
- Voeg 1 ml (5 x 10 5 totaal cellen) van cellen in een cryovial. Bevries de cellen met behulp van een Mr. Froster bevriezing container volgens de instructies.
3. neurale celdifferentiatie
- Neuronale cellen differentiatie:
- Wanneer neurale stamcellen oplopen tot 80% samenvloeiing, maak de neurale stamcellen met een rubberen politieman en vervolgens distantiëren door de pipet voorzichtig.
- Tel de cellen en de concentratie tot 1 x 10 5 / ml passen neurale stamcellen medium.
- Voor neuronale differentiatie, plaat de cellen op poly-D-lysine / laminine beklede dekglaasjes in platen met 24 putjes bij 1 x 10 5 / putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Vervang het medium met neurale differentiatie medium (DMEM / F12 met 1x N2 supplement, 1x B27 supplement, 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM vitamine C, 10 ng / ml hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en 10 ng / ml gliale cel afgeleide neurotrofe factor (GDNF)) after 24 uur. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Verander neurale differentiatie medium tweemaal per week gedurende 2 weken.
- Astrogliale differentiatie:
- Distantiëren van de neurale stamcellen door pipetteren.
- Tel de cellen en pas de celconcentratie tot 5 x 10 4 cellen / ml. Zaad de cellen op platen met 24 putjes. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Vervang het medium met DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS) en incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Verander medium tweemaal per week gedurende 2 weken. Als cellen te bereiken samenvloeiing voor 2 weken, replate de cellen volgende stappen 3.2.1 en 3.2.2.
- Oligodendrocyte differentiatie:
- Distantiëren van de neurale stamcellen door pipetteren.
- Tel de cellen en zaad 1 x 10 5 cellen op met poly-L-ornithine beklede platen met 24 putjes in 1 ml oligodendrocyt verscatie medium dat bestaat uit DMEM / F12 met N2 supplement, 10 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml neurotrofine-3 (NT-3), 2 ng / ml sonic hedgehog ( Shh), en 3 nM van triiodothyronine (T3). Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Verander medium tweemaal per week gedurende 2 weken.
- Vervang het medium met DMEM / F12 met 1xN2 supplement en 3 nM van T3 en de cultuur van de cellen voor een extra week voor myelinebasiseiwit (MBP) productie.
4. Immunofluorescentie kleuring
- Vervang medium met 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi PFA en wassen met PBS dat 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3 keer 5 minuten elke keer.
- Permeabilize cellen met PBS dat 0,5% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Blokkeer de cellen met PBS-T bevattende 4% geit serum gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met bijbehorende primaire Antibosterft verdund in PBS-T met 0,1% BSA gedurende 2 uur bij KT of O / N in koude kamer.
- Was de cellen 3 maal met PBS-T, 5 minuten elke keer. Incubeer de cellen met overeenkomstige secundaire antilichamen gekoppeld aan een fluorochroom met 1: 400 verdunning in PBS-T met 0,1% BSA gedurende 1 uur op een schudder in het donker.
- Was de cellen met PBS-T met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Was de cellen twee keer met PBS-T gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
- Let op de gelabelde cellen met behulp van een microscoop en foto's nemen (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kwaliteit van CD34 cellen is cruciaal voor het succes van neurale stamcellen transductie. Hoge kwaliteit CD34 cellen woekeren tijdens de eerste paar dagen van de cultuur en verschijnen als niet-klevende, homogeen ronde cellen, zweven net boven de bodem van de cultuur schepen (Figuur 1A). De succesvolle infectie resultaten in cel aggregaten, die zich uitstrekt over de tijd (Figuur 1B), terwijl de niet-specifieke celaggregaten kan optreden tijdens celkweek, die uit te breiden en de verenigingen zijn los. Hechtende cellen blijken meestal ongeveer 3-5 dagen na transfectie; ze zijn meestal bipolaire en zal vermenigvuldigen om monolagen (figuur 1C) te maken. Na selectie met progenitorceltransplanten celmedium meeste hechtende cellen nestine en SOX2 positieve maar OCT4 negatief (figuur 2). De geïnduceerde neurale stamcellen kunnen verder worden gedifferentieerd tot neuronen en glia (figuur 3).
ent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figuur 1. Morfologische veranderingen van CD34 cellen na transfectie Sendaivirus. (A) Aanzienlijk aantal CD34-cellen kunnen worden waargenomen op het moment van transfectie. (B) Gebied zoals celaggregaten kan worden waargenomen 24 uur na Sendaivirusvector transfectie dat zich uitbreidt in de tijd. (C) Meestal bipolaire hechtende cellen zich na 5 dagen na transfectie. (D en E) typische morfologie van neurale stamcellen na inductie met neurale medium en expansie. Schaalbalk:. 200 pm voor (A) en (B), 400 pm voor de anderen Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Induced neurale stamcellen te uiten neurale stamcellen markers. Neurale stamcellen te uiten nestine en SOX2 maar niet OCT4. Schaalbalk:. 200 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Neurale stamcellen differentiatie. De neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd tot cellen met neuronale marker (A), astroglial marker GFAP (B), en oligodendrocyten markers O4 (C). Schaalbalk:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een gedetailleerd protocol direct genereren neurale stamcellen uit perifeer hematopoïetische voorlopercellen voorzien.
Vergeleken met fibroblastcellen, humane perifeer bloed toegankelijker. De gepresenteerde protocol meer dan 1 x 10 5 hematopoïetische progenitorcellen, of CD34 positieve cellen kunnen worden verrijkt 10 ml volbloed. Hoewel verontreiniging met bloedplaatjes gewoonlijk niet voorkomen, kan het gemakkelijk worden verminderd door lagere snelheid te centrifugeren en het niet interfereert met neurale stamcellen generatie. Echter, de kwaliteit en het aantal CD34-cellen de uiteindelijke productie van neurale stamcellen bepalen. De kwaliteit van de CD34 cellen kunnen ruwweg worden beoordeeld op hun reactie op CD34 kweekmedium. Een positieve respons, wat snelle proliferatie van CD34-cellen in het medium, is essentieel voor de latere succesvolle transformatie. Als CD34 cellen niet in geslaagd zich te verspreiden, of zelfs ondergaan significant cel verlies, dan is de transformatie bemoeilijkt worden, waardoor minder proliferatieve cellen. Zo wordt voorgesteld om pas transformatie met goede kwaliteit CD34 cellen. Hoewel 1 x 10 5 CD34 cellen zijn genoeg voor een ervaren onderzoeker, kan 3 x 10 5 cellen worden gebruikt voor starters.
Met Sendai virus geeft een niet-integratie, zeer efficiënte en gemakkelijke manier om transcriptiefactoren te introduceren in de targeting cellen 14, 15. Oorspronkelijk gebruikt voor het genereren iPSC werden Yamanaka factoren ook met succes gebruikt om neurale stamcellen direct van fibroblasten 11 genereren. In een vorig rapport met de gepresenteerde protocol kan Sendai virus bevat Yamanaka elementen ook worden gebruikt om neurale stamcellen uit navelstrengbloed en volwassen perifeer bloed hematopoietische cellen genereren. Vergeleken met behulp huidbiopsie voor het kweken fibroblasten, bloed meer toegankelijk en gemakkelijk te bereiken. Bovendien is gemeld dat hematopoietische voorlopercellencellen ook tot expressie bepaalde neurale specifieke markers 16, waardoor het een betere keuze voor het genereren van neurale stamcellen. In feite, na Sendai virusinfectie meeste bijgevoegde monolaag cellen brachten nestine, een neurale stamcel marker, behalve de meer geaggregeerde compacte kolonies, waarvan sommige tot iPSC op een later tijdstip te geven. Dus de bijgevoegde monolaag van cellen verzameld en geïncubeerd in neurale voorlopercellen celmedium, die veelvuldig gebruikt in primaire neurale celcultuur, de neurale stamcellen lot van de cellen vergemakkelijken.
Er is een delicaat evenwicht handhaven de neurale stamcellen. Enerzijds heeft het de voorkeur dat de cellen beter proliferatieve capaciteit hebben en worden gepasseerd zo vaak mogelijk. Aan de andere kant, het gemak van onderscheid op neuronen is ook kritisch. Twee verschillende media worden gebruikt om dit evenwicht te bereiken. De gebruikte neurale medium gekozen voor de nEural stamcel identiteit inductie / selectie, dat is de kritische proces in de eerste plaats. Het kan ook worden gebruikt in latere passages op de neuronale differentiatie mogelijkheden versterken. De neurale stamcellen zijn zeer kwetsbaar en gevoelig zodat langdurige blootstelling aan progenitorceltransplanten celmedium sterk kan remmen celproliferatie en leiden tot overmatige differentiatie. Zo neurale stamcellen medium wordt gebruikt om de cel herstel te helpen en naar cel expansie te vergemakkelijken. De neurale voorlopercellen medium wordt gebruikt voor neurale inductie bij passage 1, wanneer de cellen samenvloeiing. Indien overmatige remming van celproliferatie en toxiciteit is opgemerkt, moet het medium vroeg vervangen neurale stamcellen medium. Echter, neurale stamcel medium minder effectief neurale selectie; waardoor tijd, vooral over-confluente neurale stamcellen of vertraagde passage kan verontreiniging met niet-neurale cellen of gebrek aan neurale differentiatie optreden. Dus de cellen moetenworden regelmatig gepasseerd, wanneer minder dan 60% samenvloeiing en minstens een keer per week. Neurale selectie met neurale voorlopercellen cel medium is mogelijk op latere passages aan de neurale identiteit te herstellen. Een andere factor die de stemness van de neurale stamcellen beïnvloedt, is de bekleding van de weefselkweekplaten. Coaten met Matrigel of poly-D-lysine kan celhechting helpen eerst bij de cellen zijn moeilijk te hechten tijdens replating. Maar langdurige blootstelling aan de coating resulteert in minder passage nummers. Dit is omdat de deklaag verbetert de celdifferentiatie proces en kan leiden tot schade aan de cellen tijdens dissociatie.
Als een samenvatting, dit protocol gebruikt Sendai virus bevatten Yamanaka factoren om direct af te leiden menselijke neurale stamcellen binnen 3 - 4 weken van volwassen hematopoietische voorlopercellen verkregen uit toegankelijke perifere bloedmonsters cellen. De neurale stamcellen zouden verder gedifferentieerd tot neuronen en glia. Deze methode omzeiltde lange en ingewikkelde iPSC generatie wordt momenteel gebruik en kunnen worden gebruikt voor in vitro celkweek modellen voor verscheidene neurologische aandoeningen, die beter kunnen vertegenwoordigen de genetische verschillen in specifieke aandoeningen, vooral individuele patiëntenmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte separation medium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Human serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1,000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1,000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μg/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
