Abstract
Infezione influenzale è associata con circa 36.000 morti e più di 200.000 ricoveri ogni anno negli Stati Uniti. L'emergere continuo di nuovi ceppi di virus influenzale dovute alla mutazione e ri-assortimento complica il controllo del virus e richiede lo sviluppo permanente di nuovi farmaci e vaccini. Lo studio in laboratorio di influenza richiede un metodo affidabile e conveniente per la propagazione del virus. Qui, un protocollo globale è costituita per influenza A propagazione dei virus in uova di gallina fertili, che produce costantemente le scorte virali ad alto titolo. In breve, esenti da organismi patogeni (SPF) uova di gallina fecondate siero sono incubate a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10 - 11 giorni. In questo periodo, lo sviluppo dell'embrione può essere facilmente monitorato mediante un Candler uovo. Virus inoculazione viene effettuata mediante iniezione del virus magazzino nella cavità allantoidea utilizzando un ago. Dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C, le uova sonorefrigerata per almeno 4 ore a 4 ° C. Il guscio d'uovo sopra la sacca d'aria e la membrana corioallantoidea sono poi accuratamente aperto, e il liquido allantoico contenente il virus è raccolto. Il fluido viene cancellato da detriti mediante centrifugazione, aliquotato e trasferito a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. La grande quantità (5-10 ml di virus contenenti liquido per uovo) titolo e precisa di virus che di solito si ottiene con questo protocollo ha reso l'utilizzo di uova per la preparazione virus nostro metodo favorevole, in particolare per gli studi in vitro, che richiedono grandi quantità del virus in cui sono necessari dosaggi elevati di virus stesso magazzino.
Introduction
Influenza A continua ad essere una grave minaccia per la salute umana. Si tratta di una malattia respiratoria potenzialmente devastante con un grande carico globale provocando fino a 500.000 morti nel mondo ogni anno 1. I virus influenzali sono nella famiglia Orthomyxoviridae e portano a 8 negativo-sense singolo filamento di RNA nel loro genoma 1,2. L'elevata mutevolezza (cioè, "drift" antigenico) del genoma virale impedisce immunità a lungo termine. Inoltre, l'influenza è sempre più resistenti ai farmaci anti-virali 3.
Il 2009 H1N1 pandemia influenzale ha evidenziato tutti i problemi difficili associati alla malattia influenzale (ceppo pandemico, la resistenza anti-virale, la produzione di vaccini in ritardo). La formulazione del vaccino è determinato annualmente dalla Organizzazione Mondiale della Sanità per i ceppi influenzali più probabile patogeni (uno ciascuno per H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Poiché questo metodo si basa su ceppo influenzale previstos, i ceppi patogeni sono a volte erroneamente identificati e l'efficacia del vaccino si riduce drasticamente. Inoltre, la comparsa di nuovi ceppi di influenza può aggirare questi programmi di prevenzione che causano pandemie 2.
La creazione di un vaccino influenzale universale è stato sfuggente 5. Pertanto, la ricerca deve continuare nella comprensione della patogenesi del danno polmonare. Per struttura di ricerca di laboratorio, diversi metodi sono stati sviluppati per l'isolamento virale e la propagazione 6. Virus influenzali umani possono essere amplificati in una varietà di substrati cellulari di mammifero. Tuttavia, generando virus ad alto titolo in grandi quantità sono più raggiunti in uova embrionate. Il protocollo che segue descrive una tecnica per l'influenza A la propagazione del virus e lo stoccaggio delle scorte di virus esistenti.
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Protocol
NOTA: Osservazioni generali: eseguire tutte le procedure che comportano la manipolazione delle uova in condizioni sterili, e una tecnica sterile deve essere utilizzato di conseguenza. Pre-pulire tutte le apparecchiature con il 70% di etanolo prima dell'uso. In generale, l'inoculazione di virus influenzale e la raccolta devono essere condotti in un laboratorio BSL-2. Tuttavia, se si utilizza questo protocollo per propagare molto più patogeno virus influenzali (ad esempio, ceppi pandemici e pre-pandemia, i ceppi che rappresentano un pericolo per pollame e bestiame, i ceppi di influenza aviaria ad alta patogenicità, 1918 H1N1 ceppo), i livelli di biosicurezza più alti e in alcuni casi, sono necessarie precauzioni di biosicurezza e le autorizzazioni. Il Comitato Istituzionale Biosicurezza locale dovrebbe approvare tutte le ricerche che coinvolgono il virus dell'influenza.
1. Preparazione di uova per Inoculation
- Ottenere uova siero (SPF) esenti da organismi patogeni appena fecondato aviaria da un fornitore adatto. Tipicamente, si usano uova di gallina. Le uova devono essere noied immediatamente all'arrivo.
- Al posto All'arrivo uova in una incubatrice dell'uovo umidificato con un tornitore automatico uovo per ruotare le uova regolarmente. Se un tornitore automatica uovo non è disponibile, ruotare manualmente le uova almeno 2-3 volte al giorno (assicuratevi di indossare guanti e tenere tutto il più sterile possibile).
- Incubare le uova a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10-11 giorni.
Speratura 2. Egg
- Utilizzare un candler uovo per esaminare l'uovo contro una luce in una stanza buia per controllare le uova per l'infertilità da speratura dopo circa 7 o 8 giorni di incubazione.
- Pulire la candler uovo con il 70% di etanolo. Cambiare i guanti spesso e disinfettare con il 70% di etanolo per minimizzare il rischio di contaminazione da patogeni.
- Rimuovere le uova dal termostato e metterli in cartoni delle uova vuote.
- Spegnere le luci in sala.
- Tenere l'estremità grande ogni uovo uno alla volta contro l'candler.
- Osservare l'uovo al determine se è fertile o infertile.
NOTA: i vasi sanguigni sottili che portano a un embrione a forma di fagiolo deve essere chiaramente visibile. Uova non fecondate appariranno come una piccola macchia di sangue con un tuorlo d'uovo visibile.
- Eliminare le uova che sono non fecondato, e restituire le uova vitali per l'incubatrice. Non lasciare uova di fuori dell'incubatore per più di 30 min. Se lo stato di un uovo non può essere confermata, segnare, e osservare in seguito.
3. Preparazione di Virus Inoculum
- Diluire virus dell'influenza stock da circa marzo 10 - aprile 10 pfu / ml in PBS sterile contenente HEPES 10 mM (pH 7.4). Passaggio fondamentale: Diluire lo stock di virus immediatamente prima dell'uso e conservare il virus diluito su ghiaccio per tutto il tempo.
4. Influenza Virus inoculazione mediante la Strada Allantoic
- Il giorno di inoculazione del virus (il giorno 10 o 11), candela di nuovo le uova ed eliminare eventuali embrioni morti. Distinguere embrioni vivi percercando movimento all'interno dell'uovo.
- Rimuovere le tre uova dal termostato, e organizzare le uova in un supporto separato con il sacco aria fino.
- Segnare lo spazio aereo delle uova con un pennarello indelebile.
- Lavare il guscio d'uovo sopra lo spazio aereo con il 70% di etanolo.
- Mettere le uova con lo spazio aereo fino in un cartone di uova e in una cappa di biosicurezza (BSL-2).
- Utilizzare un ago 18G sterili per perforare un piccolo foro nel guscio sopra la sacca d'aria di ciascun uovo. Fare attenzione a non inserire l'ago troppo profondamente per evitare di pugnalare l'embrione o il tuorlo.
- Redigere il virus dell'influenza diluita in una siringa sterile da 1 ml e inserire un ago 22G.
- Avanzare con cautela la siringa con l'ago a un angolo nella cavità allantoica 45 °.
- Iniettare 0,2 ml di virus dell'influenza diluito.
- Ripetere l'iniezione con le altre due uova, e poi scarta la siringa e l'ago.
- Sigillare il foro con una goccia di colla da una pistola per colla (o paraffina fusa). Be attenzione che la colla non perde dentro l'uovo.
- Mettere le uova di nuovo nel incubatore uovo con lo spazio aereo puntato verso l'alto.
- Ripetere i passaggi 4,2-4,12 finché non sono stati inoculati tutte le uova.
5. Incubazione
- Incubare le uova infette senza girare a 37 ° C e ~ 60% di umidità.
- Scegliere tempo ottimale di incubazione a seconda del tipo di virus dell'influenza. Incubare influenza A per 48 ore; incubare l'influenza B e C per 72 ore.
6. Influenza Virus Harvest
- Dopo il periodo di incubazione, le uova raffreddare a 4 ° C per un minimo di 4 ore (o O / N) per uccidere l'embrione e costrizione dei vasi sanguigni per ridurre il rischio di contaminazione del liquido allantoico infetto di sangue. Questa operazione consente di evitare che i globuli rossi di assorbire il virus, che riduce il rendimento. In alternativa, le uova freddo per 30 min a -20 ° C; tuttavia questo aumenta il rischio di contaminazione del sangue.
- Dopo che le uova sono state sufficientemente raffreddata, trasferire le uova di una cappa di biosicurezza. Mettere l'uovo in un supporto stabile con la sac di aria verso l'alto. Pulire la superficie dell'uovo con il 70% di etanolo.
- Usare le forbici sterili per aprire il guscio sopra la sacca d'aria. Togliere il guscio intorno al sacco aereo facendo attenzione a non distruggere la membrana corioallantoidea.
- Aprire la membrana corioallantoidea con una pinza smussato sterili. Spostare delicatamente a parte l'embrione e il sacco vitellino con una piccola spatola o un cucchiaio. Fare attenzione a non rompere il tuorlo.
- Usando una pipetta Eppendorf 1 ml, raccogliere con cura il liquido allantoico. Se necessario, inclinare l'uovo un po 'di lato per raccogliere quanto più fluido possibile.
- Combinare il liquido allantoico da tutte le uova in un tubo di plastica conica 50 ml. Tenere tubi sul ghiaccio in qualsiasi momento durante la vendemmia virus. I rendimenti Un uovo 5-10 ml di un liquido leggermente giallognolo.
- Spin il liquido allantoico contenente il virus a 1.000 xg per 10 min a 46; C a pellet detriti. Trasferire il liquido chiaro in un nuovo tubo da 50 ml tenuta in ghiaccio. Smaltire le uova in un contenitore di rifiuti BSL-2.
7. Conservazione
- Un'aliquota immediatamente il liquido chiarificato allantoico (ad esempio, 50, 100 o 500 aliquote ul) e snap-congelare in azoto liquido. Trasferire le riserve di virus congelati a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
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Representative Results
Più metodi sono stati sviluppati per titolo virale influenzale. Una considerazione quando si sceglie un metodo appropriato è che alcuni determinano particelle totali, indipendentemente della redditività (ad esempio, test emoagglutinina), mentre altri si basano su infettività, che valuterà virioni vitali (ad esempio, test placca) 6. Qui, il titolo virale di liquido allantoico raccolti da uova di pollo inoculate con un virus influenzale mouse adattato (A / PR / 8/34) è stata determinata mediante saggio di placca (Figura 1) e l'emoagglutinazione test (Figura 2).
Infezione da virus influenzale provoca un effetto citopatico che provocano placche (zone circolari di cellule lisate) per formare un monostrato di cellule. Le placche sono state visualizzate mediante colorazione delle cellule con cristalvioletto, e 65 placche sono stati contati nel pozzetto con la diluizione 10 -12 virus (Figura 1). A causa 500 L di diluito magazzino virale wimmessi sulle cellule, il titolo finale è 1,3 x 10 14 PFU / ml.
Il dosaggio di emoagglutinazione è un metodo per poi titolare basi virus dell'influenza sulla capacità del virus per attaccare alla superficie dei globuli rossi. Una sospensione virale agglutinare i globuli rossi, impedendo loro di sedimentazione della sospensione. Utilizzando diluizioni seriali di virus in una piastra a 96 pozzetti (sia V- o fondo rotondo) e aggiungendo una quantità fissa di globuli rossi, il titolo virale può essere determinato. Un risultato chiaramente negativa è stata osservata con il 1: 2 10 diluizione del virus in 50 microlitri (Figura 2). Pertanto, il titolo finale è 2,1 x 10 4 unità di agglutinazione / ml.
Figura 1. Quantificazione dei PR8 virus Titer dalla placca Assay. Un monostrato di cellule MDCK è stato infettato con 10 volte serial diluizioni di PR8 (10 -1 - 10 -12) per 1 ora, lavate, e poi ricoperto con una soluzione di agarosio 0,6%. Dopo incubazione a 37 ° C per 72 ore, agar è stato accuratamente rimosso, e le cellule sono state fissate e colorate con cristalvioletto 0,25%. La formazione della placca è paragonabile a un controllo non infetto (CTR). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. emoagglutinazione (HA) Assay al virus dell'influenza PR8 Titer Egg-derivato. PR8 virus è stato diluito serialmente 2 volte in PBS e mescolato con 50 l di globuli rossi 0,5% tacchino. Le diluizioni sono stati preparati in quadruplicates, e le immagini sono state scattate dopo 1 ora di incubazione a RT. Risultati negativi appaiono come puntini nel centro dei pozzi mentre risultati positiviformare un colore rossastro uniforme attraverso il pozzo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Influenza provoca un grande carico globale di malattia, e il lavoro continua nella comprensione della patogenesi del danno polmonare 7. Per la ricerca facilitato in questa malattia mortale, vari metodi sono stati sviluppati per diffondere il virus dell'influenza 6. Qui, descriviamo una tecnica per la produzione di virus dell'influenza in uova di gallina. Il vantaggio di questo metodo è che è altamente riproducibile e si traduce in grandi quantità ad alto titolo di riserve di virus influenzale, che è spesso necessario per gli studi in vitro.
La maggior parte dei laboratori saranno in grado di sviluppare questo protocollo semplice e veloce con il minimo costi di start-up. Anche se si consiglia di investire in un incubatore uovo con turner automatica, questo protocollo può essere completata senza tali apparecchiature, ma sarà più laboriosa. Si consiglia inoltre di utilizzare fornitori di ricerca commerciali per l'acquisto di uova fecondate per garantire la coerenza e la sterilità delle uova. L'Ufficio di Laboratory benessere degli animali (OLAW) interpretazione della politica Public Health Service (PHS) sulla Humane cura e l'uso di animali da laboratorio membri per l'uso di ricerca di uova embrionate di aviaria dal vivo che la politica PHS è applicabile solo dopo la schiusa. Pertanto, la maggior parte delle istituzioni non richiederanno l'approvazione IACUC per questo protocollo. Tuttavia, le politiche variano tra le istituzioni e l'approvazione istituzionale Comitato Biosicurezza saranno necessari prima di iniziare questo protocollo.
Quando si lavora con il virus, è fondamentale per mantenere il virus a 4 ° C dopo la raccolta del liquido allantoico dall'uovo embrionate infetti. Ogni uovo si prevede di produrre tra 5-10 ml di liquido allantoico, e il titolo dipende dal ceppo di virus influenzale. Il nostro laboratorio ha regolarmente usato questo metodo per propagare un ceppo influenzale H1N1 mouse adattato (A / PR / 8/34). Questo protocollo può essere utilizzato anche per campioni clinici, ma in questa situazione, l'inoculazione della cavità amniotica può essere preferibile a causa della pRESENZA di acidi sialici 2,6-collegati necessaria per il legame all'interno del rivestimento amniotico 8,9. Un'altra considerazione è che questo metodo non può essere l'ideale per i virus dell'influenza aviaria di propagazione (ad esempio, ceppi H5N1) a causa della patogenicità per l'embrione.
Vari metodi di titolazione del virus dell'influenza sono stati sviluppati che hanno tutti i loro vantaggi e svantaggi. In effetti, la quantificazione virale può essere a base di proteine (per esempio, emoagglutinina test, ELISA), a base di acido nucleico-(PCR ad esempio, quantitativa), o funzionale (ad esempio, test placca virale) 6. Test non funzionali determinerà titoli virali totale indipendentemente se vivono o particelle virali morti. Pertanto, il test per l'attività infettiva del virus dell'influenza misurerà virus vivere e permettere equivalenza funzionale comparabile da lotto a lotto. Il test-formanti placca è un test comunemente usato in grado di valutare i titoli di vir influenza direttanoi, ma può essere lento e ingombrante per eseguire 10. In confronto, il saggio emoagglutinina è semplice e lineare, ma non valuta la vitalità e determina tutte le particelle influenzali.
Qui, forniamo un metodo relativamente semplice per diffondere virus dell'influenza alto titolo. L'avvio de novo di questo protocollo in un laboratorio è semplice, e le materie prime e le attrezzature sono relativamente poco costoso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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