Summary
Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.
Introduction
Dupuytren-Krankheit (DD), bewirkt eine gutartige fibroproliferative Krankheit Permanent Beugung der Finger aufgrund der Bildung von Knötchen und Leitungen in der Handfläche der Hand. Obwohl die Krankheit verbreitet ist besonders hoch bei Kaukasiern in Nordeuropa, die zugrunde liegenden genetischen Ursache der Erkrankung ist unbekannt 1. Das Hauptmerkmal der DD ist die Überproduktion von extrazellulärer Matrix (ECM), Proteine (zB Kollagen), die den Raum zwischen den Sehnen und Haut der Handfläche der Hand und der Finger besetzen eine harte Fasergewebe zu bilden, die feinen Bewegungen dauerhaft gestört der Hand 2, 3. Die Wiederauftreten der Krankheit schlägt zugrunde liegenden genetischen Veränderungen als Ursache der Fibrose 1, 4. Eine wirksame Behandlung sein könnte, um direkt zielen auf die unkontrollierbare fibrotische Mechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene.
Unsere jüngsten Arbeiten zur Fibrose hat uns zur Entwicklung einer LED-neuartigen 3D Kultursystem, das Kurzzeitkultur der menschlichen fibrotischen Gewebes, die das Potenzial von Drogentests ermöglicht. Dieses System hat dazu beigetragen, die einschränkender Versuch 2D Fibroblastenkulturen zu überwinden und eine Rolle zum teilweisen Abregulation durch Exon-Skipping erreicht, von TGFß Stoffwechselwegaktivierung der Vermittlung Fibrose 5 definieren.
Wir haben ein Verfahren zur ex vivo-Kultur menschlicher Resektionsproben aus DD-Patienten, die Wechselwirkung zwischen Myofibroblasten und der umgebenden ECM 5, 6 studieren entwickelt. Das Studium der DD Bindegewebe Fibrose sowie anderer fibrotischer Erkrankungen beruht auf histopathologische Analyse des ausgeschnittenen chirurgischen Proben, Isolation von Fibroblasten aus dem Gewebe und Etablierung von Primärkulturen oder Zellsortierverfahren. Diese Ansätze sind ziemlich statisch, da sie exogener Manipulation der Krankheit Eigenschaften oder therapeutischen Intervention vom Experimentator nicht zulassen. Außerdem primären cell Kulturen neigen dazu, zu den Kulturbedingungen anpassen und ihre Genexpression Eigenschaften unterscheiden sich im Wesentlichen aus der in vivo Situation bei jedem Durchgang, auch während der frühen Passagen (unter Durchgang 3 und 6) 7, 8. Es ist uns gelungen, den Abfall chirurgisches Material in zu erhalten Ex-vivo-Kulturbedingungen für eine Zeitdauer, die Studie über die patientenspezifische Eigenschaften und das Screening von anti-fibrotische oder entzündungshemmende Medikament Verbindungen ermöglicht.
Das System wird auf eine Nitrocellulosemembran, die einen Kontakt des Gewebes mit dem Medium, jedoch nicht mit dem Kunststoff ermöglicht somit die Verhinderung der Veränderung des Gewebes bei der Befestigung, wie zuvor beobachtet, wenn die Kultivierung DD Fibroblasten sowie andere Zelltypen 9 basiert. Kein Kollagengel oder andere ECM-Protein Substrat erforderlich, da die DD Gewebe selbst produziert große Mengen dieser Proteine. Dies ist für die Erhaltung der nativen ECM-Mikroumgebung und Umsätze sin vorteilhaftce Matrix Substrate sind wichtiger Regulator der Gewebearchitektur und Funktion 10, 11. Zum Beispiel ECM Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen kann von vorne nach hinten Polarität Fibroblasten ähnlich für apikal-basal Polarität in Epithelzellen 12 gezeigt, 13 beeinflussen . polarisierte Zellen haben asymmetrische Verteilung der extrazellulären Moleküle, die Zellmigration und Genexpression, zB α1β1 Integrin Zugänglichkeit auf die Membran wirkt Zelladhäsion an Kollagen Typ I 14 bestimmt. Da ein Hauptziel dieses 3D-Modell war es, die einheimischen Mikroumgebung zu erhalten, wurde keine künstlichen ECM Matrixsubstrat verwendet.
Kurz: Resektion Proben sind gleichmäßig in einer sterilen Umgebung abgeschnitten und auf nitrocellular Membranen gelegt. Wenn die Behandlung mittels Injektion verabreicht wird benötigt das Gewebe injiziert werden, nachdem sie auf der Membran platziert. Wenn die Behandlung nicht benötigen, um über inj verwaltet werdenection dann wird die Verbindung zu dem Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)) zugefügt. Die Kulturen werden für höchstens zehn Tage nach dem das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, durch 30% Saccharose-Lösung verarbeitet werden, in OCT-Verbindung eingebettet und bei -80 ° C gelagert gehalten, wie zuvor beschrieben 5.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den LUMC und AMC Richtlinien der menschlichen Forschung Ethik-Kommission.
1. Chirurgisches Verfahren und Gewebeentnahme
Hinweis: Obwohl verschiedene Techniken zur chirurgischen Entfernung der Morbus Dupuytren vorhanden sind, ist der derzeitige Goldstandard die Teil Fasziektomie 15. Die meisten Patienten sind in der Tageschirurgie behandelt.
- Führen Operation unter Vollnarkose nach Präferenzen des Patienten und Anästhesisten und Begleiterkrankungen des Patienten. Diese Überlegungen sind über den Rahmen dieses Dokuments. Vor dem Schnitt, berühren Sie die Haut mit einem scharfen Gegenstand, um zu überprüfen, dass der Anästhesie ist zufriedenstellend. Verwenden Sie ein Tourniquet auf chirurgische Visualisierungs in einem unblutigen Bereich zu erleichtern.
- Nach Steril prepping und Drapierungen, markieren die erwarteten Schnitt mit einem Stift. Inzision der Haut mit einem Skalpell unter Lupenvergrößerung entweder längs or mit Zickzackeinschnitte zusätzliche Kontrakturen zu verhindern und auch um eine ausreichende Belichtung zu ermöglichen.
- Mit Schere Dissektion, befreien die Haut und Unterhaut aus den zugrunde liegenden Vertrag Fascia palmaris. Identifizieren und schützen das Gefäßnervenbündel des Fingers, weil der kranke Kabel kann es in Richtung der Mittellinie zu verschieben. Sobald der fibrotischen Gewebes (Knötchen und / oder Kabel) wird dargelegt, auszuschneiden es scharf und regional (Wert) mit einem Skalpell. Führen Sie sorgfältige Blutstillung unter Blutsperre am Ende des Verfahrens zur Hämatombildung zu verhindern.
- Um die Haut zu schließen, verwenden Sie zusätzliche Z-Plastiken zu Teil Verlängerung der Haut zu erhalten.
- Für diese Studien nur das Knötchen Teil des fibrotischen Kabel, die aktivsten und zellulären Teil der Krankheit. Haben der Chirurg durchführen makroskopischen Identifizierung. Die isolierten Knötchen in der Handfläche der Hand sind oft Vorläufer oder eine Schnur dabei jedoch kaum reseziert, wie sie in der Regel keine Symptome verursachen.Die, die wir herausgeschnitten waren die Knötchen, die Teil einer Schnur der vertraglich Finger waren. Identifizieren Sie diese Knötchen von der harten dicken Teil der Kabel in der handpalm (1A).
- Sobald der Chirurg entfernt das Gewebe unmittelbar Übertragung mit Hilfe einer sterilen Pinzette in ein 50 ml Röhrchen, das DMEM-Medium mit 10% FCS und 1% (P / S) ergänzt. Halten Sie das Gewebe für maximal 2 Stunden in diesem Medium auf eine Schachtel mit nassem Eis (4 ° C) (zB Transport der Gewebe aus dem Operationssaal in die Zellkultur-Anlage).
- Bewahren Sie die Proben auf nassem Eis (4 ° C), während der Vorbereitung für den nächsten Schritt. Herstellung der Materialien und Zellkulturkammer erfordert 10-20 min.
2. Vorbereitung des Instruments, Kulturmedium und Kultureinsätze
Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.
- Bereiten 500 ml DMEM mit 10% FCS und 1% (P / S) und Filter s ergänztterilize. Vorwärmen des Mediums bei 37 ° C.
- Autoklav Pinzette, ein Paar von gebogenen Blatt Mayo Schere (150 bis 170 mm Länge) und ein Paar von Metzenbaumschere und an einem sterilen Behälter.
- Unter laminaren Strömung, öffnen Sie eine sterile 12-Well-Kulturplatte. Setzen Sie einen Kultureinsatzes (0,45 um Porengröße, Durchmesser 12 mm) in jede Vertiefung der 12-Well-Platte (1B, unteres Bild).
- Füllen der Platte mit 12 Vertiefungen mit 600 & mgr; l vorgewärmtes (37ºC) Kulturmedium durch Pipettieren auf dem gut und nicht direkt auf die Membran des Einsatzes. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) (Abbildung 1B, oberes Bild).
- Alternativ können Sie einen 24-Well-Platte und 300 ul Medium pro Vertiefung. Das Volumen des Mediums pro Vertiefung ist optimal, wenn ein Meniskus Schicht zwischen der Flüssigkeit und dem unteren Teil der Membraneinsatz gebildet.
Anmerkung: das Medium an der Unterseite des Bohrlochs diffundiert durch die Nitrocellulose membrane Bildung des Meniskus Schicht, wie in Systemen von 1B (unten) dargestellt.
- Alternativ können Sie einen 24-Well-Platte und 300 ul Medium pro Vertiefung. Das Volumen des Mediums pro Vertiefung ist optimal, wenn ein Meniskus Schicht zwischen der Flüssigkeit und dem unteren Teil der Membraneinsatz gebildet.
3. Gewebepräparation und Ex-vivo-Gewebekultur-Setup
Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.
- Übertragen Sie die Knoten Teil des Netzkabels aus der 50 ml Tube auf einer 100 mm Petrischale und 10 ml der vorgewärmten (37 ° C) Medium. Sicherzustellen, dass das Gewebe in während des gesamten Verfahrens mit der Flüssigkeit.
- Entfernen Sie die perinodular Fettschicht über die Metzenbaumschere. Entsorgen Sie das Fettgewebe. Mit der Verwendung von Pinzetten und die gebogenen Blatt Schere, geschnitten quer das Gewebe in kleinere Stücke (maximale Dicke von 200 um).
- Übertragung der 12-Well-Platte aus dem Inkubator in das laminare Haube. Überprüfen Sie, dass die Membran der Beilage transparent (nass) gedreht und ist daher in Kontakt mit dem Medium.
- Mit einer Pinzetteheben ein Gewebeteil durch Berühren der Außenschicht (nicht die Spannung auf das Gewebe Aufpreis). Platzieren einer Gewebeteil auf der Membran des Zellkultureinsatzes, so daß das Gewebe in der Luft-Medium Interphase verbleibt. Kultur maximal zwei Gewebeteile auf dem gleichen Einsatz / gut.
- Sicherzustellen, dass das Gewebe flach auf der Membran mit dem Medium angeordnet ist, in Längskontakt, so daß das Gewebe nicht schwimmt von der Membran noch vollständig vom Füllgut bedeckt. Vermeiden Sie Luftblasen.
Anmerkung: In diesem Stadium ist es möglich, Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren von Interesse dem Medium hinzuzufügen; beispielsweise Testverbindungen (A, B, C, D, E) in Wiederholungen und / oder im Konzentrationskurve. Mindestens 2 Steuer (unbehandelt) Gewebestücke unter normalen Wachstumsbedingungen, um sicherzustellen, dass das Experiment wurde richtig eingerichtet. Gewebe für 3-7 Tage Inkubieren in einem Gewebekultur-Inkubator. - Infizieren das Gewebe entweder mit lentiviralen oder adenoviralen Konstrukt, wenn die Überexpression oder knock down eXperimente eines Gens von Interesse müssen (Figur 2) durchgeführt werden. Übertragen einer Gewebeteil aus der 12-Well-Platte in eine 35 mm-Schale mit einer Pinzette.
- Verwenden ein maximales Volumen von 10 ul Virus mit hohem Titer.
- Führen Sie die Injektion unter einem Präpariermikroskop mit einer Insulinspritze mit 50 ul PBS, enthaltend 10 ul des ausgewählten Virus belastet. Die Nadel senkrecht zu der Mitte des Gewebes.
- Langsam spritzen den Inhalt der Spritze. Sie nicht die Nadel direkt zurückzuziehen. Beim Durchstechen des Gewebes, lassen Sie die Nadel durch die andere Seite zu gehen, aber halten Sie die Nadel im Gewebe selbst (um die Mitte des Gewebes).
- Übertragen Sie das Gewebe wieder in die 12-Well-Platte, schließen Sie die Kulturplatte und legen Sie sie in den Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2).
4. Whole-mount Immunfluoreszenzfärbungen und 3D-Rekonstruktion
Hinweis: Alle Pro-verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben. Das Protokoll für die ganze Berg Immunfärbung und Imaging unten beschrieben ist eine Adaption von für andere Gewebe 16-19 verwendet die zuvor beschriebenen Verfahren. Puffer und Materialien sind in Tabelle 1 und Materialliste beschrieben.
- Übertragungsgewebe von der Kulturplatte zu 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS. 2 x Waschen für 5 min in PBS-Lösung auf einer rotierenden Plattform. Fix Gewebe in 4% PFA gepuffert (1,5 ml Lösung pro Gewebe in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen), O / N bei 4 ° C auf einer rotierenden Plattform.
- PFA entfernen und waschen 3x in PBS für jeweils 5 min.
- Dehydratisieren Gewebe durch Eintauchen in eine 25% ige Methanollösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform. Erhöhen des Methanolprozent allmählich (50%, 75%, 100%) mit den in jeder Lösung 2 h lang bei RT auf einer rotierenden Plattform eingetaucht Geweben.
- Übertragungsgewebe in DMSO / Methanol-Lösung (Permeabilisierung Schritt) für 3 Wochen bei 4 ° C,wie zuvor 18 beschrieben.
Anmerkung: In diesem Stadium können Gewebe langfristig in 100% Methanol bei -20 ° C gelagert werden. - Fahren Sie mit dem Färbeverfahren 16, 17; allmählich rehydrieren Gewebe (75% -50% -25% -0% Methanol-Serie). Führen Sie jede Rehydratisierungsschritt für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C, unter ständigem Rühren.
- Proben mit primären Antikörpern in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 20% DMSO O / N bei 4 ° C inkubieren. Verwenden Antikörper in den folgenden Verhältnissen über die kommerziellen Vorräte in PBS: anti-α Glattmuskelaktin (1: 500, Maus), Anti-Kollagen Typ I (1: 500, Ziege), anti-Kollagen Typ III (1: 500, Ziege).
- Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 4 ° C (Änderung PBS-Lösung 3 bis 4 mal).
- Verdünne geeigneten sekundären Antikörper (Alexa 555-Anti-Maus, Alexa 488-Anti-Ziegen) bei 1: 250 Verdünnung in PBS, enthaltend 1% (BSA) und 20% DMSO. Inkubieren Sie O / N bei 4 ° C.
- Umfassend Waschen in PBS für 48 Stunden bei 476; C und Inkubation mit Kerngegenfärbung, TO-PRO-3, verdünnt 1: 500 in PBS bei dem letzten Waschschritt.
Anmerkung: TO-PRO-3 ist eine weit rotemittierende DNA-Farbstoff (mit einem He-Ne-Laser mit 633 nm-Linie) und ist für die gleichzeitige Abbildung mit anderen Kanälen kombiniert; in diesem Fall von Kollagen Typ I / Kollagen Typ III (488 nm), α Glattmuskelaktin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Übertragen die Gewebe auf ein Methanol-Reihe (25% -50% -75%), langsam in das Gewebe zu entwässern; Ausführen der einzelnen Entwässerungsschritt für 2 h bei RT und O / N bei 4 ° C unter konstantem Rühren.
- Übertragungsgewebe in Polypropylenröhrchen. Klar Gewebe in Methylsalicylat (Griff unter chemischen Abzugshaube) 18 oder eine alternative Nutzung BABB Lösung 19. Inkubation bei RT unter ständigem Rühren, bis die Gewebe transparent. Berg zwischen einer Rutsche und einem Deckglas mit harten Satz Eindeckmedium (1C, oberes Bild) abgedichtet.
- Bild Proben auf einem invertierten konfokalen MikroRahmen mit hoher NA 63X und / oder 100X Ölimmersionsobjektiven (1C) ausgestattet.
- Reinigen Sie das Objektiv mit der Mikroskopherstellers Reinigungslösung.
- Einen Tropfen des Öls auf die Objektivlinse. Den Objektträger mit der Probe auf dem Mikroskoptisch und Fokus auf der Probe.
- Eingestellt, die Konfigurationen am Mikroskop für die gleichzeitige Abbildung von Dreikanal-Fluoreszenz mit Laserlinien bei 488 nm, 514 nm und 633 nm.
- Erfassung Einzel XY Bilder oder mehrere Fokalebene Bilder (Z stack) (3A). Verwenden Sie erhöhte Breite der Z-Stack zur Ausführung 3D-Rekonstruktion. Zu erhalten, ein hochauflösendes Bild zu verwenden niedrige Scangeschwindigkeit, Anzahl der durchschnittlichen Scans (≥ 3) und zu erwerben 16-Bit-Bildern von 1024 x 1024 Pixel Auflösung.
- Analysieren Sie die Z-Stack aufgenommenen Bilder: zuerst benennen und speichern Bilddatei (xyz). Mit dem Software-Programm des konfokalen Mikroskops, konfigurieren Sie eine maximale Intensität projection der Z-Stapel-Bildern in ein 3D-Bild rekonstruiert.
- Wählen Sie das xyz-Datei, in der "Process Tools", klicken Sie unter "Visualisierung" und "3D-Projektion". Enter "Maximum" in dem Verfahren der Vorsprung (oder "Normal", wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Für eine einzige Projektion nicht die X, Y, und Z-Ebenen ändern, und wenden Sie das Projektierungstool (3B, r1).
- Verwenden Sie die Z-Stack Bilder, um eine 3D-Projektion mit Animation (konfokalen Software) zur Ansicht erstellen. Wählen Sie das xyz-Datei, in der Prozess Extras auf unter "Visualisierung" und "3D-Projektion".
- Klicken Sie auf "Film erstellen". Geben Sie die Start-Drehwinkel in Grad (zB 0 ° als Ausgangspunkt des Films, Y-Achse) und klicken Sie auf "Set Start". Geben Sie die End-Drehwinkel in Grad (Y-Achse) als Endpunkt des Films (zB 180 ° oder 3606; Eine vollständige Drehung) und klicken Sie auf "Set End".
- Wähle "Maximum" als ein Verfahren zur Projektion (oder "Average", wenn das Fluoreszenzsignal gesättigt ist). Geben Sie den "Number of Frames" für die Drehung des 3D-Rekonstruktion (beispielsweise 20 Umdrehungen oder höher, um die Drehgeschwindigkeit zu verringern). Klicken Sie auf "Übernehmen". Exportieren Sie den Film als visuelle Datei (zB "avi") (Ergänzende Film 1) oder Export als Datei "tiff", die ein Bild-Datei für jeden Drehwinkel erzeugt (3B; Dreh r4, r10, r18).
5. Kombinierte Second Harmonic Generation (Kollagen) und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Excited (Elastin) Imaging auf Ex vivo Tissue während Kultur
Hinweis: Alle Verfahren werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht ausdrücklich angegeben.
- Entfernen Transwell-Platten von Inkubator und legen Sie eine einzelne (nicht fixierte) tiUSGABE an einer 35 mm-Zellkulturplatte mit 500 ul Medium.
- Positionieren Sie das Gewebe, so dass die lange Achse ist flach auf der Platte. Halten Gewebe nass zu allen Zeiten aber nicht schwimmen.
- Zeigen wassereingetaucht Ziel der Multiphotonen-Mikroskop direkt in Kontakt mit dem Gewebe (Abbildung 1C).
- Erhalten Bilder mit einer Anregungswellenlänge von 800 nm und sammeln emittierten Lichts zwischen 371 bis 425 nm (SHG-Kollagen) und 474 bis 532 nm (Autofluoreszenz, Elastin) (3C). Führen Zwei-Photonen-Mikroskopie in aufrechter konfokalen Mikroskop mit einem Femtosekundenlaser mit einer 20X / 1.0 NA Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet. Prozess konfokalen Stacks mit Herstellersoftware.
Hinweis: Die Anregung mit einem Nah-Infrarot-Laser der Kollagen-Moleküle erzeugt kontrastreiche Darstellung von nativem Kollagen-Strukturen in verschiedenen Tiefen.
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Representative Results
Verfahren ex vivo, 3D-Kultur des Bindegewebes ist eine einfache und robuste Aufbau-System, um die Beziehung zwischen ECM und andere Zellbestandteile der DD Gewebe bilden und möglicherweise andere Arten von Fibrose als auch zu verstehen. Außerdem erlaubt dieses System eine zuverlässige Methode, um die Wirkungen der Verbindungen auf die verschiedenen Zelltypen und deren Auswirkungen auf den fibrotischen Last 20 zu testen.
Die Schritte von Gewinnung von Operationsabfälle aus Dupuytren-Fibrose abgeleitet sind, wobei die Anordnung der Kulturkammer und Beispiele von Analysewerkzeugen in Abbildung 1 dargestellt. Wie in Figur 1 dargestellt ist, stellt dieses Verfahren ein experimentelles Werkzeug für große Bildschirme Drogen-Bildschirme, zB antifibrotische Arzneimittelverbindungen sowie die Untersuchung der ECM Modellierung in Echtzeit und reproduzierbaren Weise. Noduläre Teile des fibrotischen Kabel gleichmäßig in Scheiben geschnitten und in Transwell-Platten gelegt; jedes Gewebeteil (100-200 & mgr; m) ist auf der Oberseite der Membran eines Kultureinsatzes (0,45 um Porengrße, Durchmesser 12 mm) kultiviert. Kulturmedium liegt in der unteren Kammer zugegeben, so dass Kontakt mit dem Gewebe durch die Membran. Im Durchschnitt können 30 bis 40 Gewebeteile aus einer Hand Resektion Probe, die groß angelegte Screening von Medikamenten ermöglicht abgeleitet werden; Verbindungen, kleine Moleküle oder Wachstumsfaktoren. Versuche zur Beseitigung der Konzentration und / oder zeitabhängige Wirkung von Medikamenten sind denkbar.
Wie in Abbildung 2 dargestellt, kann die Genexpression durch die Verwendung Adeno manipuliert werden (Überexpression / knock down) / Lentiviren direkt in das Gewebe injiziert. Fluoreszenzmarkierten Virusübertragung ist in frischen dicken Gewebeproben durch Injektion durchgeführt. Tissue bleibt in der Kultur für 24-48 Stunden nach der Injektion und anschließend fixiert, eingebettet und in 0,7 um Kryoschnitte geschnitten. Außerdem, um die Wirkung von verschiedenen Verbindungen oder Kulturbedingungen das Gewebeteil zu analysierens fixiert und whole mount Immunofluoreszenz unterzogen, wie in Figur 3. 3D Abbildung dicker Gewebe gezeigt ist, durch Konfokalmikroskopie (3A-B) durchgeführt. Ein weiteres Verfahren ist die 3D Bildern auf Gewebe in Kultur gehalten; endogene Kollagen Umbau wird in Echtzeit in frisch präpariert, nicht-fixierten Gewebeteile Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) (3C) untersucht. Die Wirkung von potentiellen antifibrotische Wirkstoffe auch in Teilen des gleichen Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten verfolgt. Kollagen-Strukturen von dicken Gewebe werden mit SHG in aufrechter Multiphotonenmikroskop abgebildet. Während der Bilderzeugung werden die Gewebeproben in Medium gegeben und mit einer Wasserimmersionsobjektivs abgebildet. Nach der Bilderzeugung können sich die Gewebe zurück zum Kultursystem überführt werden. Effekte können auf der Ebene der zellulären und extrazellulären Umgebung, die einen Vorteil gegenüber in vitro zellbasierten Assays untersucht werden. Es gibt mehrere Möglichkeiten für die anaLyse der biologischen Wirkungen wie Histologie der fixierten Gewebeschnitten, whole mount Immunofluoreszenz und 3D-Rekonstruktion Bildgebung durch Konfokalmikroskopie SHG und Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz-Bildgebung des endogenen Kollagen und Elastin. Einige der Vorteile der SHG Bildgebung sind die Verwendung von frischen, nicht-fixiertem Gewebe, dass keine Antikörperfärbung Herstellung erforderlich ist, und dass das gleiche Gewebe kann mehrfach (Zeitverlauf während der Kulturbedingungen) abgebildet werden. SHG und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung aufgeregt hat zuvor für Muskel- und Bindegewebe 21-23 und ungefärbten arteriellen Wandstruktur 24 beschrieben, aber hier haben wir eine alternative Anwendung für die Untersuchung von Dupuytren-Fibrose zu melden.
Abbildung 1. Schema der Ex-vivo-3D-Gewebekultursystem. (A) DD permanente Beugekontraktur in der Hand eines Patienten vor der chirurgischen Entfernung. Diese Zahl hat sich von früheren Studie 5 angepasst. (B) Beispiel für die Ex-vivo-Kultur aufzubauen. (C) Beispiele für experimentelle Ansätze, die für die Analyse von ECM-Ablagerung verwendet werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Proof-of-Prinzip ex vivo viral-vermittelte Genexpression Modulation ganze Berg Gewebe. (A) Die Zellkerne sind mit TO-PRO-3-Farbstoff (blau) sichtbar gemacht. Bars 75 um. (B) Direkte Visualisierung der LeuchtstoffFarbstoff DsRed (rot), nach der Injektion mit Adenovirus Ausdruck-DsRed. Bars 75 um. (C) zusammengefügte Bild (Kernfärbung in blau, DsRed in rot). Zytoplasmatische Lokalisation von DsRed Angabe adenoviralen Lieferung in den Zellen innerhalb von 24 Stunden. Bars 75 um. (DF) Lentivirale Transduktion. (D) Zellkerne sind mit TO-PRO-3-Farbstoff (blau) sichtbar gemacht. Bars 25 um. (E) Direkte Visualisierung von GFP in Gewebeschnitten (grün), nach der Injektion mit lenti-GFP-Partikel. Bars 25 um. (F) zusammengeführten Bild von D und E, intrazelluläre Lokalisation von lenti-GFP. Stäbe 25 um (GH) Beispiel Lentivirus-vermittelte Zuschlags gegen interessierende Gen (als "A" bezeichnet);. (G) Lentivirus Durchführung verwürfelten shRNA-Sequenzwurde in das Gewebe injiziert ex vivo. Immunfluoreszenzfärbung für das Protein von Interesse (als "A" bezeichnet) in Rot angezeigt. Stäbe 75 um. (H) Lentivirus-Gen tragenden A-shRNA-Sequenz wurde in das Gewebe injiziert ex vivo. Immunfluoreszenzfärbung für Protein "A". Die Zellkerne sind mit TO-PRO-3-Farbstoff angefärbt. Bars 75 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: 3D-Rekonstruktion Bildgebung, Erzeugung der zweiten Harmonischen und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung aufgeregt. (A) 3D-Bildgebung durch konfokale Mikroskopie. Einzel (xy) Bilder in Fokusebenen entlang verschiedener Gewebetiefen (z = 50 bis 200 um). Whole Mount immunofluorescence Färbung; Myofibroblasten Marker α-smooth muscle actin (αSMA, rot), Kernfärbung (TO-PRO-3, blau). Bars:. 500 & mgr; m (B) 3D-Rekonstruktionsbild (Z-Stack 389 um) der Rohbilder wie in Abbildung A auf verschiedenen 3D-Rotationen als "r1", "R4", "r10", "r18" angezeigt ist. Bars 500 um. (C) Endogene Kollagengehalt Modellierung durch Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bildgebung in der frischen, dicken Gewebeteile (linken Fenster, grün). Zwei-Photonen angeregte Fluoreszenz (TPF) von Elastin Strukturen der ECM wurde durch Multiphotonen-Mikroskopie (Mitteltafel, rot) eingefangen. Zusammengefügte Bild von Kollagen (grün) und Elastin (rot) (rechts). Bars:. 100 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Ergänzende Films 1. Repräsentive 3D-Rekonstruktion Film der Dupuytrenschen ganze Berg Gewebe konfokale Bildgebung von DD Gewebe wurde nach sieben Tagen ex vivo Kultur und Verarbeitung für ganze Berg Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Myofibroblasten Marker α-smooth muscle actin (αSMA, rot), Kernfärbung (TO-PRO-3, blau). Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. Frames = 20 Z = 389 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
| PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) | 8,00 g NaCl (0,137 M) 0,20 g KCl (2,7 mM) 0,20 g KH 2 PO 4 (1,1 mM) 0,10 g MgCl 2 · 6H 2 O (0,5 mM) 2,16 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mM) 0,10 g wasserfreies CaCl 2 (0,9 mM) H 2 O auf 1 l |
| Man löst 4 g Paraformaldehyd in einem Kolben mit 100 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) in der Dunstabzugshaube, decken den Kolben. Der Kolben wird auf einem Heiz- / Rühren Block und vorsichtig rühren Sie die Lösung. Überwachen der Temperatur, so dass es ein Maximum erreicht 65 ° C. Vermeiden Sie Überhitzung. Sobald die Para hat gelöst und die Lösung klar erscheint, schalten Sie die Hitze, aber lassen Sie sich zu rühren. Nicht aus Gründen der Sicherheit zu behandeln. Abkühlen lassen. Beim Abkühlen Aliquot der Lösung und speichern langfristig in -20 ° C Gefrierschrank oder in einem 4 ° C Kühlraum für maximal eine Woche. | |
| BSA (Rinderserumalbumin), 10% (w / v) | Man löst 10 g BSA in 100 ml H 2 O. Filter sterilisieren Verwendung eines Tiefproteinbindung 0,22-um-Filter. Lagerung bei 4 ° C. |
| DMSO / Methanol (20%) Permeabilisierung Lösung | Mischen Sie mit DimethylsulfoxidMethanol (1: 4 Analogien, Gesamtvolumen 100 ml). |
Tabelle 1 Pufferlösungen.
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Discussion
Die kritischsten Schritte der Kultivierung ex vivo menschlichen Bindegewebes sind die sofortige Verwendung des Gewebes nach der operativen Entfernung der Rentabilität zu gewährleisten; Das Gewebe sollte in Medium oder Kochsalzlösung zu jeder Zeit bleiben; Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; Querschnitten von Gewebe sollte maximal 200 & mgr; m Dicke zu haben; Einrichten der Ex-vivo-Kultursystem ist optimal, wenn Gewebe in Kontakt mit dem Medium, aber nicht vollständig untergetaucht. Medium sollte nur auf der Außenkammer des Transwell in einem kleinen Volumen (zB 500-600 ul pro Platte mit 12 Vertiefungen Oberfläche) zugegeben werden.
Bindegewebe aus Dupuytren abgeleitet wird in einer harten Struktur mit hohem Gehalt an ECM-Proteine wie Kollagen, Proteoglycanen und Elastin verstrickt; Aufgrund dieser Eigenschaften und zusätzlich durch Myofibroblasten Kontraktur kann es schwierig sein durch das Gewebe zu schneiden. Es ist wichtig, geeignete chirurgische Instrumente zu benutzen; gekrümmte bladed Mayo Schere zum Schneiden von größeren Teilen in gleicher Dicke und kleinere chirurgische Scheren zum Schneiden kleiner Gewebeteile (zB wenn mehrere Gewebeteile sind erforderlich, Einsatz 24-Well-Platten).
Methoden für die Untersuchung der DD histopathologische Analysen der exzidierten fibrotischen Probe oder Ableitung von primären Fibroblasten. Zellgewinnung aus dem Patientenmaterial geschehen ist, ist auf zwei Arten; In einem der Verfahren werden Gewebeteile in Kunststoffkulturplatten für eine Anzahl von Wochen, bis sich das Auswachsen von Fibroblasten kultiviert. Das zweite Verfahren ist die enzymatische Behandlung des Gewebes mit Collagenase und Trypsin. Das erste Verfahren ist zeitaufwendig, Fibroblasten Eigenschaften verändern aufgrund Kulturbedingungen, und es ist Passage abhängige Variabilität unter Passagen derselben Zellinie. Die enzymatische Methode ist schneller und es kann für Zellsortierung Assays verwendet, jedoch in vitro Aufrechterhaltung dieser Zellen aus der angeborenen ECM nicht reflektiert, die in vivo werden 25 (nämlich mechanoregulation und mechanotransduction). Spannungsverlust ergibt Zerlegen αSMA Fasern in MFBs in kurzer Zeit 26. Die Fülle der αSMA in der ex vivo 27, 28. In Bezug auf technische und biologische Variabilität zu profitieren, ist unser Verfahren reproduzierbar (Überlebensfähigkeit, ECM-Netz) und weniger anfällig für Gewebeveränderung aufgrund kurzer Zeit der Kultur. Zum Beispiel kann das Verfahren von Fibroblasten Auswachsen erfordert mehrere Wochen, die biochemischen Veränderungen hervorrufen können (zB Ansammlung von genetischen Mutationen, die replikative Seneszenz). Patientenspezifische genetische Eigenschaften und biologische Variabilität sind aber an sich Herausforderungen in der Forschung DD und kann nicht mit einem der aktuellen Methoden angegangen werden.
Wie in diesem Protokoll nicht sichtbar, fibrotische DD Proben nach der operativen Entfernung der Ex-vivo-3D-System direkt kultiviert und / oder schockgefroren. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung, ist die Modifikation des Gewebes durch Zugabe von Wachstumsfaktoren, chemische Verbindungen, v möglichstirus-vermittelte Genübertragung, Antisense-Oligonukleotide und miRNAs. Verbindungen können in den Medien oder lokalen Mikroinjektionen des Gewebes in der 3D-Kulturkammer geliefert werden. Nach 3 und bis zu 7 Tagen der Kultur das Gewebe kann entweder zur Zellisolierung und FACS-Analyse oder Isolierung von Gesamt-RNA und Proteine, die für die Expression Profilanalyse, als auch für die histologische Analyse bearbeitet homogenisiert werden. Die Expressionsstatus Faserproteinen (αSMA, Kollagen Typ I und II, Fibronektin), Gewebearchitektur der Knöllchen Teil der Schnur und der Konsistenz des Fasernetzwerkes wird vor und nach der Behandlung bewertet. Um die ECM Umlagerungen während der Kultur überwacht kombinierten wir die SHG (Kollagen) und Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz (Elastin) Bildgebung.
Die extrazellulären Umlagerungen kann dann quantifiziert und modelliert mit Bildquantifizierungssoftware werden. Diese Parameter geben einen Hinweis auf die Wirkung von Medikamenten auf Fibrose oder Molecdere Änderungen, die während der Kultur induziert wurden. Außerdem ECM-Arrays können auch auf einzelne Scheiben durchgeführt werden, um einen besseren Überblick über die Auswirkungen zu generieren. Insgesamt haben wir ein robustes System, das Studium der Fibrose ex vivo ermöglicht etabliert.
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Disclosures
3D-Organkultur: Die Autoren haben eine Patentanmeldung für Morbus Dupuytren eingereicht. # GB1307200. Kommerzielle Lizenz und Dienstleistungsverträge zur Verfügung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
