Summary
Dupuytrens sykdom (DD) er en fibroproliferative sykdom i håndflaten. Her presenterer vi en protokoll til kultur reseksjonsnivå prøver fra DD i en tredimensjonal (3D) kultur system. Slike korttidskultur systemet tillater preservering av 3D-strukturen og molekylære egenskaper av fibrotisk vev.
Introduction
Dupuytrens sykdom (DD), en godartet fibroproliferative sykdommen forårsaker permanent strekking av fingrene på grunn av dannelse av knuter og snorer i håndflaten. Selv om sykdommen spredningen er særlig høy blant kaukasiere i Nord-Europa, den underliggende genetisk etiologi av sykdommen er fortsatt ukjent en. De viktigste kjennetegn ved DD er overflødig produksjon av ekstracellulære matrix (ECM) proteiner (f.eks kollagen), som danner en tøff bindevev opptar plassen mellom sener og hud av håndflaten og fingrene, permanent forstyrre den fine bevegelser av hånden 2, 3. Den tilbakefall av sykdommen antyder liggende genetiske endringer som en årsak til fibrose 1, 4. En effektiv behandling kan være å målrette direkte de ukontrollerbare fibrotiske mekanismer på cellulært og molekylært nivå.
Våre siste arbeidet med fibrose har ført oss til utviklingen av enny 3D-kultur-system som gjør det mulig kortvarig kultur av human fibrotisk vev med potensialet av legemiddeltesting. Dette systemet har bidratt til å overvinne den begrensende tilnærming av 2D fibroblastkulturer og å definere en rolle for den delvise nedregulering, oppnås ved ekson hoppetau for aktivering TGFp banen i å mediere fibrose 5.
Vi har utviklet en metode for å kultur ex vivo human reseksjon prøver fra DD-pasienter for å studere interaksjonen mellom myofibroblasts og den omgivende ECM 5, 6. Studiet av DD bindevev fibrose, så vel som andre fibrotiske sykdommer som er avhengig av histopatologisk analyse av det utskårede kirurgisk prøver, isolering av fibroblaster fra vevet og etablering av primære cellekulturer eller sorteringsprosedyrer. Disse metodene er ganske statisk, siden de ikke tillater eksogene manipulasjon av sykdoms egenskaper eller terapeutisk intervensjon ved eksperimentator. I tillegg primær cell kulturer har en tendens til å tilpasse seg forholdene kultur og deres genuttrykk egenskaper avvike vesentlig fra in vivo situasjon ved hver passering, selv under tidlige passasjer (blant passasje 3 og 6) 7, 8. Vi har klart å opprettholde avfall kirurgisk materiale i ex vivo dyrkningsbetingelser for en tidsperiode som tillater undersøkelse av pasientspesifikke egenskaper og screening av anti-fibrotiske eller anti-inflammatoriske medikament-forbindelser.
Systemet er basert på en nitrocellulosemembran som tillater kontakt av vevet med mediet, men ikke med plast, og dermed hindre endring av vev ved festing, som tidligere observert ved dyrkning DD fibroblaster, så vel som andre celletyper 9. Ingen kollagen-gel eller andre ECM-protein-substrat er nødvendig, siden DD vevet i seg selv produserer store mengder av disse proteiner. Dette er fordelaktig for opprettholdelse av nativt ECM mikromiljøet og omsetning syndce matrikssubstrater er viktig regulator av vev arkitektur og funksjon 10, 11. For eksempel ECM-proteiner som fibronektin, laminin og kollagen, kan påvirke front-bak polaritet av fibroblaster som på samme måte som vises for apikal-basal polaritet i epitelceller 12, 13 . Polarisert celler har asymmetrisk fordeling av ekstracellulære molekyler som bestemmer cellemigrasjon og genuttrykk, f.eks α1β1 inte tilgjengelighet på membranen påvirker celleadhesjonen å skrive kollagen 14. Siden en primære målet med denne 3D-modellen var å bevare den opprinnelige mikromiljøet, ble ingen kunstige ECM matrise underlaget brukes.
I korte trekk: reseksjon prøvene er likt delt i et sterilt miljø og plassert på nitrocellular membraner. Ved behandling administreres via injeksjon er nødvendig vevene blir injisert etter at de har blitt plassert på membranen. Hvis behandlingen ikke krever å bli administrert via injection deretter forbindelsen blir tilsatt til kulturmediet (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), med 1% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin (P / S)). Kulturene ble opprettholdt i maksimalt ti dager, hvoretter vevet er fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA), behandlet gjennom 30% sukrose-oppløsning, innebygd i oktober forbindelse og lagret ved -80 ° C, som tidligere beskrevet 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger LUMC og AMC retningslinjer for menneskelig forskningsetisk komité.
1. Kirurgisk prosedyre og vevsoppsamling
Merk: Selv om ulike teknikker for kirurgisk fjerning av Dupuytrens kontraktur eksisterer, er dagens gullstandard delvis fasciectomy 15. De fleste pasienter blir behandlet i dag-kirurgi klinikk.
- Utføre kirurgi under generell eller regional anestesi i henhold til pasientens og anestesilege preferanser og til pasientens komorbiditet. Disse betraktningene er utenfor omfanget av denne artikkelen. Før snitt, berøre huden med en skarp gjenstand for å bekrefte at bedøvelse er tilfredsstillende. Bruk en tourniquet å lette kirurgisk visualisering i et ublodig felt.
- Etter steril prepping og draperi, markere ut den forventede snittet med en penn. Langsgående snitt i huden med en skalpell i henhold lupe forstørrelse enten lengderetningen or bruker sikksakk snitt til å hindre flere kontrakturer og også for å tillate tilstrekkelig eksponering.
- Ved hjelp av sakse disseksjon, frigjøre hud og underhud lag fra de underliggende kontrakt fascia palmaris. Identifisere og beskytte neurovascular bunt av fingeren fordi den syke ledningen kan fortrenge det mot midtlinjen. Når fibrotisk vev (nodule og / eller ledning) er skissert, skjære det kraftig og regionalt (delsum) med en skalpell. Utføre nitid hemostase henhold tourniquet kontroll på slutten av prosedyren for å hindre hematomdannelse.
- Å lukke huden, bruk ekstra Z-plasties å få delvis forlengelse av huden.
- For disse studiene bare bruker den nodul del av fibrotisk ledningen, den mest aktive og cellulær del av sykdommen. Har kirurgen utføre makroskopiske identifikasjon. De isolerte knuter i håndflaten er ofte forløpere eller en ledning, men er nesten aldri resected, som de vanligvis ikke forårsake symptomer.De vi resected var de knuter som var en del av en ledning fra den kontraktsfestede finger. Identifisere disse knuter av hardt tykke delen av ledningene i handpalm (figur 1A).
- Når kirurgen fjerner vevet, umiddelbart overføre den ved hjelp av sterile pinsetter til et 50 ml rør inneholdende DMEM-medium supplert med 10% FCS og 1% (P / S). Hold vev for maksimalt 2 timer i dette mediet på en boks av våt is (4 ° C) (for eksempel transport av vev fra driften rommet til cellekultur anlegget).
- Hold prøvene på våt is (4 ° C) mens du klargjør for neste trinn. Utarbeidelsen av materialer og cellekultur kammer krever 10-20 min.
2. Utarbeidelse av instrumenter, Kultur Medium og kultur Setter
Merk: Alle prosedyrer utføres ved RT med mindre annet er oppgitt.
- Forbered 500 ml DMEM supplert med 10% FCS og 1% (P / S) og filter sterilize. Prewarm mediet ved 37 ° C.
- Autoklav tang, et par buede blad Mayo saks (150-170 mm i lengde) og et par Metzenbaum saks og oppbevar i en steril beholder.
- Under laminær, åpne en steril 12-brønn kultur plate. Plasser en kulturinnsats (0,45 um porestørrelse, 12 mm diameter) i hver brønn av 12-brønns plate (figur 1B, nedre panel).
- Fyll 12-brønns plate med 600 ul av forvarmet (37 ° C) kulturmedium ved pipettering på brønnen og ikke direkte på membranen av innsatsen. Sett platen inn i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) (figur 1B, øvre panel).
- Alternativt kan du bruke en 24-brønns plate og legge til 300 mL av medium per brønn. Volumet av medium per brønn er optimal når en menisk lag er dannet mellom den flytende og den nedre del av membraninnsats.
Merk: mediet ved bunnen av brønnen diffunderer gjennom nitrocellulose Membrane danner menisken lag som avbildet i skjema på figur 1B (nedre panel).
- Alternativt kan du bruke en 24-brønns plate og legge til 300 mL av medium per brønn. Volumet av medium per brønn er optimal når en menisk lag er dannet mellom den flytende og den nedre del av membraninnsats.
3. Vevspreoarerlng og Ex Vivo Tissue Culture Setup
Merk: Alle prosedyrer utføres ved RT med mindre annet er oppgitt.
- Overfør nodule del av ledningen fra 50 ml tube på en 100 mm petriskål og tilsett 10 ml forvarmet (37 ° C) medium. Sørge for at vevet er i kontakt med væsken under hele prosedyren.
- Fjern den perinodular fett laget ved hjelp av Metzenbaum saks. Kast fettvev. Med bruk av pinsett og de buede blad saks, skåret på tvers vevet i mindre biter (maksimal tykkelse på 200 um).
- Overfør 12-brønns plate fra inkubatoren inn i laminær hette. Kontroller at membranen på innsatsdelen har slått gjennomsiktig (våt), og derfor er i kontakt med mediet.
- Bruk pinsettløft en vev del ved å berøre det ytterste laget (gjelder ikke spenning på vevet). Plasser en vevet del på membranen på innsatscellekultur, slik at vevet forblir i luft medium interfase. Kultur maksimalt to vevsdeler på samme innsatsen / brønn.
- Sørge for at vevet er plassert flatt på membranen, i langsgående kontakt med mediet, slik at vevet hverken flyter utenfor membranen heller ikke er fullstendig dekket av medium. Unngå luftbobler.
Merk: På dette stadiet, er det mulig å legge til vekstfaktorer eller hemmere av interesse i media; for eksempel testforbindelsene (A, B, C, D, E) i replikater og / eller i konsentrasjonskurven. Ta med minst to kontroll (ubehandlet) biter av vev under normale vekstforhold for å sikre at forsøket er satt opp riktig. Inkuber vev for 3-7 dager i en vevskulturinkubator. - Infisere vev med enten lentiviral eller adenoviral konstruere hvis overekspresjon eller slå ned experiments av et gen interesse behov som skal utføres (figur 2). Overføre en vev del fra 12-brønns plate inn i en 35 mm rett med tang.
- Bruke et maksimalt volum på 10 pl av høy titer virus.
- Utføre injeksjonen under et disseksjon mikroskop med en insulinsprøyte fylt med 50 ul PBS inneholdende 10 ul av det valgte virus. Plassere nålen vinkelrett på midten av vev.
- Sakte injisere innholdet av sprøyten. Ikke trekke nålen direkte. Når punktering av vevet, ikke la nålen går gjennom den andre siden, men opprettholder nålen i vevet selv (rundt sentrum av vevet).
- Overfør vevet tilbake inn i 12-brønn plate, lukker kulturplate og plassere den i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2).
4. Hel-mount Immunfluorescens Farging og 3D Rekonstruksjon
Merk: All proprosedyrer blir utført ved RT med mindre annet er oppgitt. Protokollen for hele mount farging og bildebehandling beskrevet nedenfor er en tilpasning fra tidligere rapporterte metoder som brukes for andre vev 16-19. Buffere og materialer er beskrevet i tabell 1 og materialliste.
- Overføring av vev fra kulturplaten til 2 ml mikrosentrifugerør som inneholdt PBS. Vask 2 ganger i 5 minutter i PBS-oppløsning på en roterende plattform. Fiks vev i 4% bufret PFA (1,5 ml oppløsning pr vev i 2 ml mikrosentrifugerør), O / N ved 4 ° C på en roterende plattform.
- Fjern PFA og vaskes 3 ganger i PBS i 5 min hver.
- Dehydrere vev etter neddykking i en 25% metanol-løsning i 2 timer ved RT på en roterende plattform. Øk gradvis metanol prosent (50%, 75%, 100%) med vevet nedsenket i hver oppløsning i 2 timer ved RT på en roterende plattform.
- Overfør vev i DMSO / metanol-oppløsning (permeabilization trinn) i 3 uker ved 4 ° C,som tidligere beskrevet 18.
Merk: På dette stadiet, kan vev lagres langsiktig i 100% metanol ved -20 ° C. - Fortsett med flekker prosedyre 16, 17; gradvis rehydrere vev (75% -50% -25% -0% metanol-serien). Utfør hver rehydrering trinn i 2 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C, under konstant omrøring.
- Inkuber prøver med primære antistoffer i PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) og 20% DMSO O / N ved 4 ° C. Bruke antistoffer ved de følgende forholdstall ved hjelp av de kommersielle bestander i PBS: anti-α glattmuskel aktin (1: 500, mus), anti-kollagen type I (1: 500, geit) anti-kollagen type III (1: 500, geit).
- Vask omfattende i PBS i 48 timer ved 4 ° C (endring PBS-løsning 3 til 4 ganger).
- Fortynn egnede sekundære antistoffer (Alexa 555 anti-mus, Alexa 488 anti-geit) ved 1: 250 fortynning i PBS inneholdende 1% (BSA) og 20% DMSO. Ruge O / N ved 4 ° C.
- Vask omfattende i PBS i 48 timer ved 476 C og inkuberes med atom counterstain, TO-PRO-3 fortynnet 1: 500 i PBS ved den avsluttende vasketrinn.
Merk: TO-PRO-3 er et langt-rød emitting DNA fargestoff (med en He-Ne 633 nm laser linje) og er kombinert for samtidig bildebehandling med andre kanaler; i dette tilfellet kollagen type I / kollagen type III (488 nm), α glatt muskulatur aktin (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Overfør vevet til en metanol-serien (25% -50% -75%) for å sakte tørke vev; utføre hver Dehydratiseringstrinnet i 2 timer ved RT eller O / N ved 4 ° C under konstant omrøring.
- Overføre vev i polypropylen rør. Klare vev i metylsalicylat (håndtak i henhold kjemisk hette) 18 eller som en alternativ bruk Babb løsning 19. Inkuber ved romtemperatur under konstant omrøring inntil vev blir gjennomsiktig. Mount mellom en sklie og et dekkglass forseglet med hardt sett monteringsmedium (figur 1C, øvre panel).
- Bildeeksempler på en omvendt konfokalmikroskoper microomfang utstyrt med høy NA 63X og / eller 100X olje nedsenking mål (figur 1C).
- Rengjøre linsen med renhold løsning levert av mikroskop produsenten.
- Påfør en dråpe olje på objektiv. Plasser lysbilde med prøven på mikroskopet scenen og fokus på prøven.
- Still konfigurasjonene på mikroskopet for samtidig avbildning av tre-kanals fluorescens med laserlinjer 488 nm, 514 nm og 633 nm.
- Erverve enkelt XY bilder eller flere brennpunktetfungsjonerer bilder (Z bunke) (figur 3A). Bruk økt bredde av Z stabelen for å utføre 3D rekonstruksjon. For å få et bilde med høy oppløsning bruker lav skanning hastighet, antall gjennomsnittlig skanninger (≥ 3) og få 16-bits bilder av 1024 x 1024 pikslers oppløsning.
- Analyser Z stabelen ervervede bilder: først endre navn og lagre bildefilen (xyz). Hjelp av programmet av konfokal mikroskop, konfigurere en maksimal intensitet projeDette skjer av Z stabelen bilder til en 3D rekonstruert bilde.
- Velg xyz fil, i "Prosessverktøy", klikk under "Visualisering" og "3D Projection". Tast "Maksimal" i fremgangsmåten fremspring (eller "Average" dersom det fluorescente signalet er mettet). For en enkelt projeksjon ikke endrer X, Y og Z flyene, og bruke projeksjonsverktøy (Figur 3B, r1).
- Bruk Z stack bilder for å lage en 3D-projeksjon med animasjon (konfokalmikroskoper programvare) for visning. Velg xyz fil, i prosessen du Verktøy-menyen under "Visualisering" og "3D Projection".
- Klikk på "Create Movie". Tast Start Rotasjon vinkel i grader (f.eks, 0 ° som utgangspunkt for filmen, Y-aksen) og klikk på "Set Start". Legg inn slutt Rotasjon vinkel i grader (Y-aksen) som sluttpunkt av filmen (f.eks 180 ° eller 3606; for en komplett rotasjon) og klikk på "Set End".
- Velg "Maximum" som en fremgangsmåte for å fremspring (eller "Average" dersom det fluorescente signalet er mettet). Skriv inn "Antall Frames" for rotasjon av 3D rekonstruksjon (f.eks 20 rotasjoner eller høyere for å redusere rotasjonshastigheten). Klikk på "Apply". Eksportere filmen som visuell fil (for eksempel "avi") (Supplerende Movie 1) eller eksport som "tiff" fil som skaper en bildefil for hver rotasjon vinkel (figur 3B, rotasjon R4, R10, R18).
5. Kombinert Second Harmonic Generation (kollagen) og to-foton Spent fluorescens (elastin) Imaging på Ex Vivo Tissue under Kultur
Merk: Alle prosedyrer utføres ved RT med mindre annet er oppgitt.
- Fjern Transwell plater fra inkubator og legg en enkelt (unfixed) tissue del i en 35 mm cellekulturplate inneholdende 500 ul medium.
- Plasser vev, slik at den lange akse er flatt på platen. Hold vev våt hele tiden imidlertid ikke flytende.
- Plasser vann-nedsenket Formålet med multiphoton mikroskop direkte i kontakt med vevet (figur 1C).
- Få bilder med en eksitasjon bølgelengde på 800 nm og samle lyset mellom 371-425 nm (SHG, kollagen) og 474-532 nm (autofluorescence, elastin) (Figur 3C). Utføre to-foton mikroskopi i oppreist konfokal mikroskop utstyrt med en femtosecond laser bruker en 20X / 1.0 NA vann-nedsenking objektiv. Prosess confocal stabler med produsentens programvare.
Merk: Eksitasjon med en nær infrarød laser av kollagen molekyler skaper høy kontrast avbildning av innfødte kollagen strukturer i forskjellige dybder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremgangsmåte for ex vivo, er 3D-kultur av bindevev en enkel og robust sett opp systemet til å forstå forholdet mellom ECM og andre cellebestanddeler som utgjør DD vev og muligens andre typer av fibrose i tillegg. Videre har dette systemet gir en pålitelig metode for å teste effekten av forbindelsene på forskjellige celletyper og deres effekt på fibrotiske lasten 20.
Trinnene fra samlingen av kirurgisk avfallsmateriale avledet fra Dupuytren fibrose, blir sammenstillingen av dyrkningskammeret, og eksempler på analyseverktøy presentert i figur 1. Som illustrert i figur 1, er denne metoden gir en eksperimentell verktøy for store skjermer narkotika-skjermer, f.eks antifibrotic narkotika forbindelser samt studiet av ECM modellering i en real-time og reproduserbar måte. Nodulær deler av fibrotisk ledningen er like skiver og plassert i Transwell plater; hvert vev delen (100-200 um) er dyrket på toppen av membranen fra et kulturinnsats (0,45 um porestørrelse, 12 mm diameter). Kulturmedium tilsettes ved bunnen kammeret, slik at kontakt med vevet gjennom membranen. I gjennomsnitt 30-40 vevsdeler kan utledes fra en enkelt reseksjon eksemplar, noe som tillater storskala screening av narkotika; forbindelser, små molekyler eller vekstfaktorer. Eksperimenter adressering konsentrasjonen og / eller tidsavhengig effekt av legemidler er gjennomførbart.
Som vist i figur 2, kan genekspresjon bli manipulert (overekspresjon / knock down) ved bruk av adeno / lentiviruses direkte injisert inn i vevet. Fluorescently merket viral transduksjon er utført i friske tykke vevsprøver ved injeksjon. Vev forblir i kultur for 24-48 timer etter injeksjon, og deretter blir fikset, forankret og seksjonert i 0,7 mikrometer frysesnitt. Dessuten, for å analysere effekten av forskjellige forbindelser eller dyrkningsforhold vevet delers er faste og utsatt for hele mount immunfluorescens, som vist på figur 3. 3D avbildning av tykke vev er gjort av konfokal mikroskopi (figur 3A-B). En annen metode er live 3D avbildning på vev opprettholdes i kultur; endogen kollagen ombygging er studert i sanntid i ferske dissekert, ikke-faste vevsdeler av andre harmonisk generasjon (SHG) (Figur 3C). Virkningen av potensielle anti-fibrotiske medikamenter følges også i deler av det samme vev ved forskjellige tidspunkter. Kollagen strukturer av tykk vev er avbildes med SHG i oppreist multiphoton mikroskop. Under bildebehandling, er vevsprøver plassert i medium og blir avbildet med en vann-nedsenking objektiv. Etter bildebehandling, kan vevet bli overført tilbake til kultur system. Effekter kan studeres på nivået av cellulære og ekstracellulære miljø og gir en fordel i forhold til in vitro celle-baserte analyser. Det er flere muligheter for analysering av biologiske effekter som histologi av faste vevssnitt, hel mount immunfluorescens og rekonstruere 3D avbildning av konfokal mikroskopi, SHG og to-foton spent fluorescens avbildning av endogen kollagen og elastin. Noen av fordelene med SHG-avbildning, er bruk av friske, ikke-fast vev, at ingen antistoffarging preparat er nødvendig, og at det samme vev kan avbildes flere ganger (tidsforløpet under kulturbetingelser). SHG og to-foton utløst fluorescens bildebehandling har blitt beskrevet tidligere for muskler og bindevev 21-23 og unstained arterieveggen struktur 24, men her vi rapportere et alternativt program for studiet av Dupuytrens fibrose.
Figur 1. Scheme av ex vivo 3D vev kultur system. (A) DD permanent fleksjon kontraktur i hånden av en pasient før kirurgisk fjerning. Dette tallet har blitt forandret fra forrige studie fem. (B) Eksempel på ex vivo kultur satt opp. (C) Eksempler på eksperimentelle tilnærminger som kan brukes for analyse av ECM deponering. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 2. Proof-of-prinsippet ex vivo viral-mediert genuttrykk modulasjon i hele mount vev. (A) Nuclei er visualisert med TO-PRO-3 fargestoff (blå). Barer 75 mikrometer. (B) Direkte visualisering av fluorescerendefargestoff DsRed (rød), etter injeksjon med Adenovirus uttrykker-DsRed. Barer 75 mikrometer. (C) sammenslåtte bildet (atom flekker i blått, DsRed i rødt). Cytoplasmatisk lokalisering av DsRed indikerer adenoviral levering i cellene innen 24 timer. Barer 75 um. (DF) Lentiviral transduksjon. (D) Kjerner er visualisert med TO-PRO-3-fargestoff (blå). Barer 25 mikrometer. (E) Direkte visualisering av GFP i vevssnitt (grønn), etter injeksjon med lenti-GFP partikler. Barer 25 mikrometer. (F) Sammenslåtte bilde av D og E indikerer intracellulær lokalisering av lenti-GFP. Barer 25 um (GH) Eksempel på lentivirus-mediert knockdown mot gen av interesse (betegnet som "A");. (G) Lentivirus bærer kryptert shRNA sekvensble injisert ex vivo inn i vevet. Immunfluorescens farging for proteinet av interesse (betegnet som "A") er vist i rødt. Barer 75 um. (H) Lentivirus bærer genet A-shRNA-sekvensen ble injisert ex vivo inn i vevet. Immunfluorescens farging for protein "A". Atomkjerner er farget med TO-PRO-3 fargestoff. Barer 75 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. 3D rekonstruksjon bildebehandling, andre harmonisk generasjon og to-foton utløst fluorescens bildebehandling. (A) 3D avbildning av konfokal mikroskopi. Enkeltrom (xy) bilder i fokalplanene langs ulike vev dybder (z = 50-200 mikrometer). Hele montere immunofluorescensnofluorescence flekker; myofibroblast markør α-glatt muskel aktin (αSMA, rød), nukleær farging (TO-PRO-3, blå). Barer:. 500 mikrometer (B) 3D rekonstruert bilde (Z stabel 389 mikrometer) av RAW-bilder som indikert i panel A på ulike 3D-rotasjoner indikert som "r1", "R4", "R10", "r18". Barer 500 mikrometer. (C) Endogent kollagen innhold modellering av andre harmonisk generasjon (SHG) avbildning i friske, tykke vevsdeler (venstre panel, grønn). To-foton utløst fluorescens (TPF) av elastin strukturer av ECM ble tatt til fange av multiphoton mikroskopi (midtpanelet, rød). Sammenslåtte bildet av kollagen (grønn) og elastin (red) (høyre panel). Barer:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Movie 1. representanteneav kvalitativ 3D rekonstruksjon film av Dupuytrens hele mount vev Confocal avbildning av DD vev ble utført etter syv-dagers ex vivo kultur og behandling for hele mount immunfluorescens farging.; myofibroblast markør α-glatt muskel aktin (αSMA, rød), nukleær farging (TO-PRO-3, blå). Skala bar = 500 mikrometer. Rammer = 20. Z = 389 mikrometer. Klikk her for å se denne videoen.
| PBS (fosfatbufret saltløsning) | 8,00 g NaCl (0,137 M) 0,20 g KCl (2,7 mM) 0.20 g KH 2 PO 4 (1,1 mm) 0,10 g MgCI2 · 6 H 2 O (0,5 mm) 2.16 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mm) 0,10 g vannfri CaCI2 (0,9 mm) H2O til 1 liter |
| Oppløs 4 g paraformaldehyd i en kolbe inneholdende 100 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i avtrekksskap, dekker kolben. Plassere kolben på en varme / røre blokk og forsiktig omrøring av løsningen. Overvåke temperaturen slik at det er nådd et maksimum 65 ° C. Unngå overoppheting. Når paraformaldehydet er oppløst og løsningen synes klart, slå av varmen, men la til røre. Ikke ta av sikkerhetsmessige grunner. Avkjøles. Når avkjølt, alikvot av løsningen, og lagrer langtids i -20 ° C-fryseren eller i et 4 ° C kjøleskap til maksimalt en uke. | |
| BSA (bovint serumalbumin), 10% (w / v) | Oppløse 10 g BSA i 100 ml H 2 O. Filter sterilisere ved hjelp av en lav-protein binding 0.22-mikrometer filter. Oppbevares ved 4 ° C. |
| DMSO / metanol (20%) permeabilization løsning | Bland dimethylsulfoxyd medMetanol (1: 4 analogier, totalt volum 100 ml). |
Tabell 1. Buffer løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinn å dyrke ex vivo human bindevev er den umiddelbare anvendelse av vev etter kirurgisk fjerning for å sikre levedyktighet; vevet bør forbli i medium eller saltoppløsning til enhver tid; opprettholde et sterilt kultur; tverrgående deler av vev skal ha maksimalt 200 mikrometer tykkelse; satt opp av ex vivo kultursystem er optimal når vev er i kontakt med mediet, men ikke helt neddykket. Mediet bør legges bare på utsiden av kammeret transwell i et lite volum (for eksempel 500 til 600 ul pr 12-brønns plate overflateareal).
Bindevev avledet fra Dupuytrens blir viklet inn i en tøff struktur med høyt innhold av ECM proteiner som kollagen, proteoglykaner, og elastin; på grunn av disse egenskaper, og i tillegg på grunn myofibroblast kontraktur kan det være utfordrende å skjære gjennom vevet. Det er viktig å bruke riktige kirurgiske verktøy; buet bladed Mayo saks for å klippe større deler i samme tykkelse og mindre kirurgiske saks for å klippe mindre vevsdeler (for eksempel hvis flere vevsdeler kreves bruk 24-brønners plater).
Fremgangsmåter for undersøkelse av DD er histopatologiske analyser av de utskårende fibrotiske prøven, eller avledning av primære fibroblaster. Celle avledning fra pasientmaterialet er gjort er to måter; i en av de fremgangsmåter, vev deler er dyrket i plastkulturskåler for et antall uker inntil det er utvekst av fibroblaster. Den andre metoden er enzymatisk behandling av vevet med kollagenase og trypsin. Den første metoden er tidkrevende, er fibroblast egenskaper forandres på grunn av dyrkningsbetingelser, og det er passasje avhengig variasjon blant passasjer av den samme cellelinje. Den enzymatiske metoden er raskere, og den kan brukes for cellesorteringsanalyser imidlertid in vitro vedlikehold av disse celler ute av medfødt ECM reflekterer ikke in vivo 25 (nemlig mechanoregulation og mechanotransduction). Tap av strekk resulterer i demontering av αSMA fibre i MFBs i løpet av kort tid 26. Overflod av αSMA i ex vivo 27, 28. Når det gjelder tekniske og biologiske variasjoner, er vår metode reproduserbar (levedyktighet, ECM-nettverk) og mindre utsatt for vev endring på grunn av kort tid av kulturen. For eksempel, metoden for fibroblast utvekst krever flere uker, noe som kan forårsake biokjemiske endringer (f.eks akkumulering av genetiske mutasjoner, replikative senescence). Men pasientspesifikke genetiske egenskaper og biologiske variasjoner er per se utfordringer i DD forskningsfeltet og kan ikke løses med noen av dagens metoder.
Som vist i denne protokollen, fibrotiske DD prøvene etter kirurgisk fjerning er direkte dyrket i ex vivo 3D-system og / eller hurtigfrosset. Avhengig av den vitenskapelige spørsmålet, er det mulig ved tilsetning av vekstfaktorer, kjemiske forbindelser, v modifikasjon av vevirus-genavlevering, antisens-oligonukleotider og mirnas. Forbindelser kan leveres i media eller med lokale microinjections av vevet i 3D kultur kammeret. Etter 3 og opp til 7 dagers dyrking i vevet kan enten være homogenisert for celleisolasjon og FACS-analyse eller isolering av total RNA og proteiner for ekspresjon profilanalyse, samt bearbeidet for histologisk analyse. Uttrykket status av fibrøse proteiner (αSMA, kollagen type I og II, fibronectin), vevsarkitektur av nodul del av ledningen, og konsistensen av det fibrøse nettverket er vurdert før og etter behandlingene. For å overvåke ECM rearrangements under kultur kombinert vi SHG (kollagen) og to-foton utløst fluorescens (elastin) bildebehandling.
Den ekstracellulære rearrangements kan da kvantifiseres eller modellert ved hjelp av bilde kvantifisering programvare. Disse parametrene gi en indikasjon på stoffet effekter på fibrose eller MolecUlar endringer som har oppstått under kultur. Videre ECM arrays kan også utføres på enkelt stykker for å generere en bedre oversikt over hvilken effekt. Samlet har vi etablert et robust system som gjør at studiet av fibrose ex vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har innlevert en patentsøknad for Dupuytrens sykdom: 3D organ kultur. # GB1307200. Kommersielle lisens og servicekontrakter er tilgjengelig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
