Summary
מחלת Dupuytren (DD) היא מחלה fibroproliferative של כף היד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדגימות כריתת התרבות מDD במערכת תלת-ממדי (3D) תרבות. מערכת תרבות לטווח קצר כזה מאפשרת שימור של מבנה 3D ותכונות מולקולריות של רקמת fibrotic.
Introduction
מחלת Dupuytren (DD), מחלה fibroproliferative שפירה גורמת כיפוף קבוע של האצבעות עקב היווצרות של גושים וחוטים בכף היד. למרות התפשטות המחלה היא גבוהה במיוחד בקרב לבנים של צפון אירופה, אטיולוגיה הגנטית הבסיסית של המחלה אינה ידועה 1. המאפיין העיקרי של DD הוא הייצור העודף של מטריצה תאית חלבונים (ECM) (למשל, קולגן), המהווים רקמה סיבית קשה כובשת את המרחב בין הגידים והעור של כף היד והאצבעות, באופן קבוע משבש את התנועות העדינות של היד 2, 3. ההישנות של המחלה מצביעה על שינויים גנטיים בסיסי כגורם לסיסטיק 1, 4. טיפול יעיל יכול להיות למקד ישירות מנגנוני fibrotic בלתי נשלט ברמה התאית ומולקולרית.
העבודה האחרונה שלנו על סיסטיק הובילה אותנו לפיתוחמערכת חדשנית 3D תרבות המאפשרת תרבות לטווח הקצר של רקמת fibrotic אדם עם הפוטנציאל של בדיקות סמים. מערכת זו סייעה להתגבר על הגישה המגבילה של תרבויות פיברובלסטים 2D ולהגדיר תפקיד עבור מטה הרגולציה החלקית, שהושג על ידי דילוג על אקסון, של הפעלת מסלול TGFβ בתיווך סיסטיק 5.
אנחנו פיתחנו שיטה לתרבות לשעבר vivo דגימות כריתה אנושית מחולי DD ללמוד את האינטראקציה בין myofibroblasts וECM 5 שמסביב, 6. המחקר של סיסטיק רקמת חיבור DD כמו גם המחלות fibrotic אחרות מסתמכת על ניתוח histopathological של נכרת כירורגית דגימות, בידוד של fibroblasts מהרקמה והקמת תרבויות עיקריות או נהלי מיון תא. גישות אלה הן די סטטית שכן הם אינם מאפשרים מניפולציה אקסוגני של נכסי מחלה או התערבות טיפולית על ידי הנסיין. בנוסף, ce העיקריתרבויות ll נוטות להסתגל לתנאי התרבות ומאפייני ביטוי הגנים שלהם שונים במהותה מהמצב בvivo על כל מעבר, גם בקטעים מוקדמים (בין קטע 3 ו -6) 7, 8. יש לנו הצלחנו לשמור על החומר כירורגית הפסולת ב תנאי vivo לשעבר תרבות לתקופת זמן המאפשרת לימוד של מאפייני המטופל ספציפי והקרנה של תרכובות תרופה אנטי-fibrotic או אנטי-דלקתיות.
המערכת מבוססת על קרום nitrocellulose המאפשר מגע של הרקמות עם המדיום אבל לא עם הפלסטיק, ובכך, מונע את השינוי של הרקמה על קובץ מצורף, כפי שנצפה בעבר כאשר culturing fibroblasts DD כמו גם סוגי תאים אחרים 9. לא ג'ל קולגן או מצע חלבון ECM אחר נדרש, שכן רקמת DD עצמו מייצרת כמויות גדולות של החלבונים האלה. זהו יתרון לשמירה על מייקרו-סביבת ECM ילידים וחטא מחזורמצעי מטריצת ce הם רגולטור חשוב של אדריכלות ותפקוד 10, 11 רקמות. לדוגמא, חלבוני ECM כגון פיברונקטין, laminin וקולגן, עשויים להשפיע על קוטביות קדמית אחורית של fibroblasts כדומה מוצג לקוטביות הפסגה-בסיס בתאי האפיתל 12, 13 . יש לי תאים מקוטב הפצת א-סימטרית של מולקולות תאיים הקובעת נדידת תאים וביטוי גנים, למשל, נגישות integrin α1β1 על הקרום משפיעה הידבקות תא להקליד אני קולגן 14. מאז מטרתו העיקרית של מודל זה 3D הייתה לשמר את המיקרו-הסביבה המקומית, שימש לא מצע מטריצת ECM מלאכותי.
בקצרה: דגימות כריתה נחתכות באותה מידה בסביבת סטרילית והניחו על קרומי nitrocellular. אם נדרש טיפול מנוהל באמצעות הזרקת הרקמות מוזרקות לאחר שהונחו על הקרום. אם טיפול אינו דורש להיות מנוהל באמצעות injection אז המתחם מתווסף לתקשורת והתרבות (בינוני של הנשר (DMEM) השתנה Dulbecco, עם 1% בסרום עגל עוברי (FCS), 1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S)). התרבויות נשמרות לתקופה מקסימלית של עשרה ימים לאחר שהרקמה קבועה בparaformaldehyde 4% (PFA), מעובד באמצעות פתרון סוכרוז 30%, משובץ במתחם OCT ומאוחסן ב -80 ° C, כפי שתוארו בעבר 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות LUMC וAMC של ועדת אתיקה מחקר אנושית.
1. הליך כירורגי ואוסף רקמות
הערה: למרות שטכניקות שונות לכריתה כירורגית של ההתכווצות של Dupuytren קיימות, תקן הזהב הנוכחי הוא fasciectomy החלקי 15. מטופלים רוב המטופלים במרפאת יום הניתוח.
- לבצע ניתוח בהרדמה כללית או אזורית בהתאם להעדפות מטופל והרופא המרדים של והעמיתים הנלווים של המטופל. שיקולים אלה הם מעבר להיקף של מאמר זה. לפני החתך, לגעת בעור עם חפץ חד כדי לוודא ההרדמה שמשביעה. השתמש בחוסם עורק כדי להקל הדמיה כירורגית בשדה ללא שפיכות דמים.
- לאחר prepping וכורך סטרילי, לסמן את החתך הצפוי עם עט. לחתוך את העור עם אזמל בהגדלה זכוכית מגדלת או longitudinally or באמצעות חתכים זיגזג כדי למנוע contractures נוסף וגם כדי לאפשר לחשיפה מספקת.
- באמצעות נתיחת מספריים, לשחרר את העור ושכבה התת עורית מpalmaris fascia נדבק שבבסיס. לזהות ולהגן על צרור העצבים וכלי הדם של האצבע בגלל הכבל החולה יכול לעקור אותו לכיוון קו האמצע. לאחר רקמת fibrotic (גולה ו / או כבל) מתואר, להעיף אותו באופן חד ואזורי (סכום ביניים) באמצעות אזמל. לבצע עצירת דימום תחת שליטה קפדנית חוסם עורקים בסוף ההליך, כדי למנוע היווצרות שטף דם.
- כדי לסגור את העור, להשתמש Z-plasties נוסף לקבלת הארכה חלקית של העור.
- למחקרים אלה להשתמש רק בחלק גולה של חוט fibrotic, החלק הפעיל והסלולרי ביותר של המחלה. יש לי המנתח לבצע זיהוי מקרוסקופית. גושים המבודדים בכף היד הם לעתים קרובות מבשרים או כבל אך כמעט אף פעם לא עברו כריתה, כפי שהם בדרך כלל אינם גורמים לתסמינים.אלה שעברנו כריתה היו גושים שהיו חלק מכבל של האצבע נדבקה. לזהות גושים אלה על ידי החלק הקשה העבה של מיתרים בhandpalm (איור 1 א).
- ברגע שהמנתח מסיר את הרקמה, להעביר אותו באופן מיידי באמצעות מלקחיים סטרילית לצינור 50 מיליליטר מכיל בינוני DMEM בתוספת FCS 10% ו -1% (P / S). לשמור על הרקמה לתקופה מקסימלית של 2 שעות במדיום זה בתיבה של קרח הרטוב (4 מעלות צלזיוס) (למשל, תחבורה של הרקמה מחדר הניתוח למתקן תרבית התאים).
- שמור על דגימות קרח רטוב (4 ° C) בעת ההכנה לצעד הבא. הכנה של חדר חומרים ותרבית תאים דורשת 10-20 דקות.
2. הכנה של מכשירים, תרבות בינונית ותוספות תרבות
הערה: כל ההליכים מתבצעים בRT אלא אם כן נאמר במפורש.
- הכן 500 מיליליטר של DMEM בתוספת FCS 10% ו -1% (P / S) ומסנן שלterilize. Prewarm הבינוני ב 37 מעלות צלזיוס.
- מלקחיים החיטוי, זוג המספריים Mayo מעוקל להב (150-170 מ"מ אורך) וזוג המספריים מצנבאום וחנות במכל סטרילי.
- תחת הזרימה למינרית, לפתוח צלחת תרבות 12 גם סטרילי. הנח להכניס את התרבות אחת (0.45 גודל מיקרומטר נקבובית, בקוטר 12 מ"מ) בכל טוב של צלחת 12-היטב (איור 1, פנל תחתון).
- מלא את צלחת 12 גם עם 600 μl של prewarmed תקשורת (37 ° C) תרבות על ידי pipetting על הבאר ולא באופן ישיר על הממברנה של הכנס. מניחים את הצלחת לתוך החממה (37 ° C, 5% CO 2) (איור 1, פנל עליון).
- לחלופין, השתמש בצלחת 24 גם ולהוסיף 300 μl של מדיום בכל טוב. נפח בינוני לכל גם הוא אופטימלי כאשר שכבת המניסקוס נוצר בין הנוזל ואת החלק התחתון של להכניס את הקרום.
הערה: הבינוני בתחתית הבאר מפזרת באמצעות membr nitrocelluloseAne יוצר שכבת המניסקוס כמתואר בתוכניות של איור 1 (פנל תחתון).
- לחלופין, השתמש בצלחת 24 גם ולהוסיף 300 μl של מדיום בכל טוב. נפח בינוני לכל גם הוא אופטימלי כאשר שכבת המניסקוס נוצר בין הנוזל ואת החלק התחתון של להכניס את הקרום.
הגדרת תרבות רקמות ההכנה וEx Vivo 3. רקמות
הערה: כל ההליכים מתבצעים בRT אלא אם כן נאמר במפורש.
- העבר את החלק גולה של הכבל מצינור 50 מיליליטר על צלחת פטרי 100 מ"מ ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום prewarmed (37 ° C). ודא שהרקמה היא במגע עם הנוזל במהלך ההליך כולו.
- להסיר את שכבת שומן perinodular באמצעות המספריים מצנבאום. מחק את רקמת השומן. עם השימוש במלקחיים והמספריים המעוגלים להב, לחתוך transversally הרקמה לחתיכות קטנות יותר (עובי מרבי של 200 מיקרומטר).
- העבר את צלחת 12 גם מן החממה למכסה המנוע למינרית. בדוק שהקרום של להכניס הפך שקוף (רטוב), ולכן הוא במגע עם המדיום.
- בעזרת מלקחייםלהרים בזהירות חלק רקמה על ידי נגיעה בשכבה החיצונית (אינו חלים מתח ברקמות). מניחים חלק רקמה אחת על הממברנה של להכניס את תרבית תאים כך שהרקמות נותרו בשלבי הביניים האוויר-בינוני. תרבות מרבי של שני חלקי רקמה באותו העלון / טוב.
- ודא שהרקמה ממוקמת שטוחה על הממברנה, במגע עם אורך הבינוני כך שהרקמה לא צף את הקרום ולא מכוסה באופן מלא על ידי מדיום. למנוע בועות אוויר.
הערה: בשלב זה, ניתן להוסיף גורמי גדילה או מעכבים המעניינים את התקשורת; למשל, תרכובות מבחן (A, B, C, D, E) בחזרות ו / או בעקומת ריכוז. כולל לפחות 2 חתיכות שליטה (ללא טיפול) של רקמה תחת תנאי גידול נורמלים כדי להבטיח שהניסוי הוגדר כראוי. דגירה רקמות ל3-7 ימים בתרבית רקמת חממה. - להדביק את הרקמה עם או מבנה lentiviral או adenoviral אם ביטוי יתר או להפיל את הדוארxperiments של צורך הגן-של-עניין שיש לבצע (איור 2). להעביר חלק מרקמת צלחת 12 גם לתוך צלחת 35 מ"מ באמצעות מלקחיים.
- השתמש בנפח מרבי של 10 μl של וירוס כייל גבוה.
- לבצע ההזרקה תחת מיקרוסקופ לנתיחה עם מזרק אינסולין עמוס 50 μl PBS המכיל 10 μl של הנגיף שנבחר. מניחים את המחט בניצב למרכז של הרקמה.
- לאט לאט להזריק את התוכן של המזרק. לא חוזר בי המחט ישירות. כאשר ניקוב הרקמה, לא נותן את המחט לעבור לצד השני, אבל לשמור את המחט בתוך הרקמה עצמו (סביב המרכז של הרקמה).
- העברת הרקמה חזרה לתוך צלחת 12 היטב, לסגור את צלחת התרבות ולמקם אותו לתוך החממה (37 ° C, 5% CO 2).
4. כל הר Immunofluorescence מכתים ושיקום 3D
הערה: כל פרוcedures מבוצע בRT אלא אם כן נאמר במפורש. הפרוטוקול לimmunostaining ההר השלם והדמיה מתוארת להלן הוא עיבוד משיטות שדווחו בעבר שימשו לרקמות אחרות 16-19. מאגרים וחומרים מתוארים בטבלה 1 וחומרי רשימה.
- העברת רקמות מצלחת התרבות 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge המכילים PBS. לשטוף 2x במשך 5 דקות בתמיסת PBS על פלטפורמה מסתובבת. לתקן רקמות בPFA 4% שנאגרו (1.5 מיליליטר פתרון לכל רקמה ב2 מיליליטר צינורות microcentrifuge), O / N ב 4 ° C על פלטפורמה מסתובבת.
- הסר PFA ולשטוף 3x בPBS במשך 5 דקות כל אחד.
- מייבשי רקמות על ידי טבילה בתמיסת 25% מתנול לשעה 2 ב RT על פלטפורמה מסתובבת. להגדיל את אחוז מתנול בהדרגה (50%, 75%, 100%) עם הרקמות שקועים בכל פתרון לשעה 2 ב RT על פלטפורמה מסתובבת.
- העברת רקמות בDMSO / פתרון מתנול (שלב permeabilization) למשך 3 שבועות על 4 מעלות צלזיוס,כפי שתואר לעיל 18.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן רקמות לטווח ארוך במתנול 100% ב -20 ° C. - להמשיך בהליך מכתים 16, 17; רעננותם בהדרגה רקמות (75% -50% -25 סדרות מתנול -0%%). לבצע כל צעד להחזרת נוזלים לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C, תחת תסיסה מתמדת.
- דגירה דגימות עם נוגדנים עיקריים PBS המכילים 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ו -20% DMSO O / N ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש נוגדנים ביחסים הבאים באמצעות המניות מסחריות בPBS: אקטין שריר חלק אנטי-α (1: 500, עכבר), סוג אנטי-קולגן אני (1: 500, עז), אנטי-קולגן סוג III (1: 500, עז).
- לשטוף בהרחבה בPBS במשך 48 שעות ב 4 ° C (פתרון PBS שינוי של 3 עד 4 פעמים).
- לדלל נוגדנים משני מתאימים (Alexa 555 אנטי עכבר, Alexa 488 אנטי-עז) בשעה 1: 250 דילול ב PBS המכיל 1% (BSA) ו- 20% DMSO. דגירה O / N ב 4 ° C.
- לשטוף בהרחבה בPBS במשך 48 שעות ב 476; C ו דגירה עם counterstain הגרעיני,-3-PRO בדילול 1: 500 ב PBS בשלב הכביסה האחרון.
הערה: 3 TO-PRO הוא צבע מרחיק אדום פולט DNA (עם קו לייזר 633 ננומטר הוא Ne-) ומשולב בו-זמנית להדמיה עם ערוצים אחרים; בסוג זה אני סוג המקרה קולגן / קולגן III (488 ננומטר), α אקטין שריר חלק (555 ננומטר), TO-PRO-3 (647 ננומטר). - העבר את הרקמות לסדרת מתנול (25% -50% -75%) למייבש את הרקמה לאט; בצע כל שלב התייבשות לשעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C תחת תסיסה מתמדת.
- העברת רקמות בצינורות פוליפרופילן. רקמות ברורות בmethylsalicylate (ידית מתחת למכסת מנוע כימי) 18 או כחלופת שימוש פתרון באב 19. לדגור על RT תחת תסיסה מתמדת עד הרקמות נעשות שקופות. הר בין שקופיות וcoverslip חתומים עם הרכבה בינוני סט קשה (איור 1 ג, פנל עליון).
- דגימות תמונה במייקרו confocal הפוכהההיקף מצויד בNA 63X גבוה ו / או מטרות 100X טבילת שמן (איור 1 ג).
- נקה את העדשה עם תמיסת ניקוי המסופקת על ידי יצרן מיקרוסקופ.
- החל טיפת השמן אחד על העדשה האובייקטיבית. מניחים את השקף עם הדגימה על הבמה מיקרוסקופ והתמקדות במדגם.
- הגדר את התצורות על המיקרוסקופ הדמיה בו זמנית של הקרינה שלושה ערוצים עם קווי לייזר 488 ננומטר, 514 ננומטר 633 ננומטר ו.
- לרכוש תמונות XY בודדות או מספר רב של תמונות מוקד מטוס (ערימת Z) (איור 3 א). השתמש ברוחב מוגבר של ערימת Z לביצוע שחזור 3D. כדי לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה להשתמש במהירות סריקה נמוכה, מספר הסריקות הממוצעת (≥ 3) ולרכוש תמונות 16-ביט של רזולוציה 1,024 x 1,024 פיקסלים.
- לנתח את תמונות ערימת Z נרכשו: הראשון לשנות את שם ולשמור את קובץ תמונה (xyz). שימוש בתוכנה של המיקרוסקופ confocal, להגדיר proje עוצמה מקסימליתction של תמונות ערימת Z ל3D משוחזר תמונה.
- בחר את קובץ xyz, ב" כלים התהליך ", לחץ תחת" ויזואליזציה "ו-" הקרנת 3D ". הזן "מקסימום" בשיטה של הקרנה (או "ממוצעת" אם אות הניאון רוויה). להקרנה אינה משנה את X, Y, Z ומטוסים, ולהחיל את כלי ההקרנה (איור 3, R1).
- השתמש בתמונות ערימת Z ליצור הקרנת 3D עם אנימציה (תוכנת confocal) לצפייה מטרות. בחר את קובץ xyz, בתהליך כלים, לחץ תחת "ויזואליזציה" ו- "הקרנת 3D".
- לחץ על "צור סרט". הזן את זווית סיבוב התחל במעלות (למשל, 0 ° כנקודה של הסרט, ציר Y התחלה) ולחץ על "התחל הגדר". הזן את זווית סיבוב בסוף מעלות (ציר Y) כנקודת סיום של הסרט (למשל, 180 מעלות או 3606; לסיבוב מלא) ולחץ על "סוף הגדר".
- בחר "מרבי" כשיטת הקרנה (או "ממוצעת" אם אות הניאון רוויה). הזן את "מספר מסגרות" לסיבוב של שחזור 3D (למשל, 20 סיבובים ומעלה כדי להפחית את מהירות סיבוב). לחץ על "החל". לייצא את הסרט כקובץ חזותי (למשל, "avi") (סרט משלים 1) או לייצא כקובץ "ריב" אשר יוצר קובץ תמונה לכל זווית סיבוב (איור 3; r4 סיבוב, R10, R18).
5. משולב שני הרמוני דור (קולגן) ודימות פלואורסצנטי מתרגש שני פוטונים (אלסטין) ברקמות Ex Vivo בתרבות
הערה: כל ההליכים מתבצעים בRT אלא אם כן נאמר במפורש.
- הסר צלחות transwell מהחממה ולמקם את יחיד (לא קבוע) tiחלק ssue בצלחת תרבית תאי 35 מ"מ המכילה 500 μl של מדיום.
- מקם את הרקמה, כך שציר הזמן הוא שטוח על הצלחת. שמור רקמות רטובות בכל העת עם זאת, לא צף.
- הנח אובייקטיבי-שקוע במים של המיקרוסקופ multiphoton ישירות במגע עם הרקמה (איור 1 ג).
- להשיג תמונות עם גל עירור של 800 ננומטר ולאסוף את האור הנפלט בין 371-425 ננומטר (SHG, קולגן) ו474-532 ננומטר (autofluorescence, אלסטין) (איור 3 ג). לבצע שני פוטונים במיקרוסקופ במיקרוסקופ confocal זקוף מצוידים בליזר פמטו-שני באמצעות מטרת מים טבילת 20X / 1.0 NA. confocal תהליך ערימות עם התוכנה של היצרן.
הערה: עירור עם לייזר אינפרא אדום קרוב של מולקולות קולגן יוצר הדמיה ניגודיות גבוהה של מבני קולגן ילידים בעומקים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה של vivo לשעבר, תרבות 3D של רקמת חיבור היא מערכת להגדיר קלה וחזקה כדי להבין את הקשר בין ECM ומרכיבי תא אחרים המהווים את רקמת DD וסוגים אחרים של פוטנציאל סיסטיק גם כן. יתר על כן מערכת זו מאפשרת שיטה אמינה כדי לבחון את ההשפעה של תרכובות בסוגי תאים שונים והשפעתם על עומס fibrotic 20.
הצעדים מאוסף של חומרי פסולת כירורגית נגזרים מסיסטיק של Dupuytren, ההרכבה של חדר התרבות ודוגמאות של כלי ניתוח מוצגים באיור 1. כפי שמודגמות באיור 1, שיטה זו מספקת כלי ניסיוני למסכי סמים מסכים גדול, למשל, תרכובות antifibrotic סמים, כמו גם את המחקר של המודלים ECM בזמן אמת ובאופן לשחזור. חלקי קשרי של חוט fibrotic פרוסים באופן שווה והניחו בצלחות transwell; כל חלק רקמה (100-200 מיקרומטר) הוא תרבותי על גבי הקרום של כנס תרבות (0.45 גודל מיקרומטר נקבובית, בקוטר 12 מ"מ). מדיום תרבות מתווסף בתא התחתון, המאפשר מגע עם הרקמה דרך הממברנה. בממוצע ניתן לגזור 30-40 חלקי רקמה מדגימת כריתה יחידה, המאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה של סמים; תרכובות, מולקולות קטנות או גורמי גדילה. ניסויים העוסקים בריכוז ו / או השפעה של תרופות תלויות זמן הם אפשריים.
כפי שניתן לראות באיור 2, ביטוי גנים ניתן להשפיע (ביטוי יתר / להפיל) על ידי השימוש בadeno / lentiviruses מוזרק ישירות לתוך הרקמות. Fluorescently התמרה ויראלית מתויגת מבוצעת בדגימות רקמה עבות טריות בזריקה. רקמה נשארת בתרבות במשך 24-48 שעות לאחר הזרקה וקבועה לאחר מכן, משובץ ומחולקת ב0.7 מיקרומטר cryosections. יתר על כן, כדי לנתח את ההשפעה של תרכובות או תנאי תרבות שונות חלק הרקמהים הם קבועים ונתון לimmunofluorescence ההר השלם, כפי שמוצגים באיור 3. ההדמיה 3D של רקמות עבות נעשה על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 3 א-ב). שיטה נוספת היא ההדמיה 3D בשידור החי ברקמות נשמרו בתרבות; שיפוץ קולגן אנדוגני הוא למד בזמן אמת בטרי גזור חלקי רקמה שאינן קבועים, על ידי דור השני הרמוני (SHG) (איור 3 ג). ההשפעה של תרופות אנטי-fibrotic פוטנציאל גם מיושמת בחלקים של אותה רקמה בנקודות זמן שונה. מבנים של רקמת קולגן עבה הם צילמו באמצעות SHG במיקרוסקופ multiphoton זקוף. במהלך הדמיה, דגימות רקמה ממוקמות בטווח בינוני והם צילמו עם מטרת מים טבילה. לאחר הדמיה, ניתן להעביר בחזרה את הרקמות למערכת התרבות. ניתן ללמוד אפקטים ברמה של סביבה תאית ותאית מתן יתרון על פני מבחני מבוססי תאים במבחנה. ישנן אפשרויות רבות לanaתמוגה של השפעות ביולוגיות כגון היסטולוגיה של סעיפי רקמות קבועים, immunofluorescence ההר שלם והדמיה שחזור 3D על ידי מיקרוסקופ confocal, SHG והדמיה הקרינה נרגשת שני פוטונים של קולגן ואלסטין אנדוגני. חלק מן היתרונות של ההדמיה SHG הוא השימוש ברקמה טרי, שאינה קבועה, שאין הכנת מכתים נוגדן נדרש ושאותה הרקמה ניתן הדמיה מספר פעמים (כמובן זמן בתנאי תרבות). SHG והדמיה הקרינה נרגשת שני פוטונים שתוארו בעבר לשרירים ורקמות חיבור 21-23 וקיר מבנה עורקים בלא כתם 24, לעומת זאת, כאן אנו מדווחים יישום חלופה לחקר סיסטיק של Dupuytren.
באיור 1. תכנית של vivo לשעבר מערכת תרבית רקמת 3D. () התכווצות DD קבועה כיפוף ביד של מטופל לפני ניתוח להסרת. נתון זה שונה ממחקר הקודם 5. (ב) דוגמא של תרבות vivo לשעבר הקימה. דוגמאות (C) של גישות ניסיוניות שיכול לשמש לניתוח בתצהיר ECM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 2. אפנון ההוכחה של עיקרון vivo לשעבר בתיווך נגיפי גן הביטוי ברקמת הר שלם. () גרעינים הם דמיינו עם-3-PRO צבע (כחול). ברים 75 מיקרומטר. (ב) להדמיה ישירה של הניאוןצבע DsRed (אדום), לאחר הזרקה עם Adenovirus להביע DsRed. ברים 75 מיקרומטר. תמונה (C) ממוזגת (הכתמה גרעינית בכחול, DsRed באדום). לוקליזציה cytoplasmic של DsRed מצביעה משלוח adenoviral בתאים בתוך 24 שעות. ברים 75 מיקרומטר. (DF) lentiviral התמרה. (ד) גרעינים הם דמיינו עם-3-PRO צבע (כחול). ברים 25 מיקרומטר. (E) להדמיה ישירה של ה- GFP בסעיפי רקמות (ירוקה), שלאחר הזרקה עם חלקיקי lenti-GFP. ברים 25 מיקרומטר. (F) תמונה ממוזגת של D ו- E מציינים לוקליזציה תאית של lenti-GFP. ברים 25 מיקרומטר (GH) דוגמא למציאת lentivirus בתיווך מול הגן של עניין (כאזור ""); רצף shRNA מקושקשת (G) Lentivirus ביצוע.הוזרק vivo לשעבר לתוך הרקמה. מכתים immunofluorescence לחלבון של עניין (כאזור "") מוצג באדום. ברים 75 מיקרומטר. רצף-shRNA גן נשיאה (H) Lentivirus הוזרק vivo לשעבר לתוך הרקמה. מכתים immunofluorescence עבור "" חלבון. גרעיני מגואלות TO-PRO-3 צבע. ברים 75 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הדמיה איור 3. 3D שיקום, דור שני הרמוני והדמיה הקרינה נרגשת שני פוטונים. (א) הדמיה 3D על ידי מיקרוסקופ confocal. תמונות בודדות (XY) במטוסי מוקד לאורך עומקים שונים של רקמות (z = 50-200 מיקרומטר). אימונוגלובולינ הר שלםצביעת nofluorescence; α-חלק myofibroblast סמן אקטין שריר (αSMA, אדום), מכתים גרעיני (TO-PRO-3, כחול). בר:. 500 מיקרומטר (B) 3D משוחזר תמונה (ערימת Z 389 מיקרומטר) של תמונות גולמיים כפי שצוין בלוח בסיבובי 3D השונים המצוינות כ" r1 "," R4 "," R10 "," R18 ". ברים 500 מיקרומטר. (C) דוגמנות תוכן קולגן אנדוגני על ידי הדמיה הדור שנייה הרמוני (SHG) בחלקי רקמה טריים, עבים (פנל שמאלי, ירוקה). שני פוטונים הקרינה נרגשת (TPF) של מבני אלסטין של ECM נתפס על ידי מיקרוסקופ multiphoton (פנל באמצע, אדום). תמונה ממוזגת של קולגן (ירוק) ואלסטין (אדום) (פנל מימין). בר:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט משלים 1. representative 3D סרט שחזור של רקמת ההר השלמה של Dupuytren הדמיה Confocal של רקמת DD בוצעה לאחר תרבות של שבעה ימים vivo לשעבר ועיבוד עבור מכתים immunofluorescence הר שלם.; α-חלק myofibroblast סמן אקטין שריר (αSMA, אדום), מכתים גרעיני (TO-PRO-3, כחול). בר סולם = 500 מיקרומטר. מסגרות = 20. Z = 389 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
| PBS (פוספט שנאגרו מלוח) | 8.00 גרם NaCl (0.137 מ ') 0.20 גרם KCl (2.7 מ"מ) KH 0.20 g 2 PO 4 (1.1 מ"מ) 0.10 g MgCl 2 · 6 שעות 2 O (0.5 מ"מ) 2.16 גרם Na 2 4 HPO · 7H 2 O (8.1 מ"מ) 0.10 g נטול מים CaCl 2 (0.9 מ"מ) H 2 O לL 1 |
| לפזר 4 גרם של paraformaldehyde בבקבוק המכיל 100 מיליליטר בופר פוספט (PBS) במנדף, לכסות את הבקבוק. מניחים את הבקבוק על חימום / לחסום ערבוב והמערבבים בעדינות את הפתרון. לנטר את הטמפרטורה, כך שהוא מגיע לC 65 מעלות מקסימום. הימנע מחימום יתר. ברגע שparaformaldehyde נמס והפתרון נראה ברור, לכבות את החום אך להשאיר לעורר. לא מטפל במסיבות בטיחות. לאפשר קירור. כאשר התקרר, aliquot הפתרון ולאחסן לטווח ארוך ב-20 ° C במקפיא או במקרר 4 ° C במשך שבוע לכל היותר. | |
| ארגון ה- BSA (אלבומין בסרום שור), 10% (w / v) | לפזר BSA 10 גרם ב 100 מיליליטר H 2 O. סנן לעקר באמצעות דל חלבון מחייב מסנן 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. |
| DMSO / מתנול (20%) פתרון permeabilization | מערבבים דימתיל sulfoxide עםמתנול (1: 4 אנלוגיות, הכולל נפח 100 מיליליטר). |
טבלת 1. פתרונות מאגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר של culturing רקמות חיבור אנושיים vivo לשעבר הם השימוש המיידי של הרקמות לאחר ניתוח להסרת על מנת להבטיח יכולת קיום; הרקמה צריכה להישאר בפתרון בינוני או מלוח בכל העת; לשמור על תרבות סטרילי; חלקים רוחביים של רקמה צריכים להיות עובי 200 מיקרומטר מרבי; להגדיר במערכת התרבות vivo לשעבר הוא אופטימלי כאשר רקמה נמצאת במגע עם המדיום אבל לא שקועה באופן מלא. בינוני יש להוסיף רק בחדר מחוץ לtranswell בנפח קטן (למשל, 500-600 μl ל12-היטב פני שטח צלחת).
רקמת חיבור הנגזרת מDupuytren שלו הסתבכה במבנה קשוח עם תכולה גבוהה של חלבוני ECM כגון קולגן, proteoglycans, ואלסטין; בשל תכונות אלה ובנוסף עקב התכווצות myofibroblast זה יכול להיות מאתגר לחתוך את הרקמה. חשוב להשתמש בכלים כירורגיים מתאימים; מעוקל bladed מספריים לחיתוך Mayo חלקים גדולים יותר בעובי שווה ומספריים כירורגיות קטנים לחיתוך חלקי רקמות קטנים יותר (למשל, אם יותר חלקי רקמה נדרשים צלחות שימוש 24 גם).
שיטות ללימוד DD הן ניתוחי histopathological של דגימת fibrotic נכרתה, או גזירה של fibroblasts העיקרי. גזירת Cell מחומר המטופל לעשות היא שתי דרכים; באחת מהשיטות, חלקי רקמה בתרבית תרבות צלחות פלסטיק למספר שבועות עד שיש תולדה של fibroblasts. השיטה השנייה היא טיפול האנזימטית של רקמה עם collagenase וטריפסין. השיטה הראשונה היא זמן רב, תכונות פיברובלסטים משתנות עקב תנאי תרבות ויש שונות מעבר תלוי בין קטעים של אותו קו התא. השיטה אנזימטית היא מהירה יותר וניתן להשתמש בו לתא מיון מבחני, לעומת זאת, תחזוקה במבחנה של תאים אלה מתוך ECM המולדים אינה משקפת את in vivo 25 (כלומר mechanoregulation וmechanotransduction). הפסד של תוצאות מתח בפירוק סיבי αSMA בMFBS בפרק זמן קצר 26. השפע של αSMA בvivo לשעבר 27, 28. לגבי השתנות טכניות וביולוגיות, השיטה שלנו היא לשחזור (כדאיות, רשת ECM) ופחות נוטה לשינוי רקמה בשל זמן קצר של התרבות. לדוגמא, השיטה של תולדת פיברובלסטים דורשת מספר שבועות שעלולים לגרום לשינויים ביוכימיים (למשל, הצטברות של מוטציות גנטיות, הזדקנות replicative). עם זאת, מאפיינים גנטיים מטופל ספציפי ושונה ביולוגי אתגרי se בתחום מחקר DD ולא ניתן להתמודד איתי עם כל אחת מהשיטות הנוכחיות.
כפי שניתן לראות בפרוטוקול זה, דגימות DD fibrotic לאחר ניתוח להסרתם ישירות בתרבית מערכת 3D vivo לשעבר ו / או צמד קפוא. בהתאם לשאלה המדעית, שינוי של הרקמה ניתן על ידי תוספת של גורמי גדילה, תרכובות כימיות, vאירוס בתיווך משלוח גן, oligonucleotides antisense וmiRNAs. תרכובות יכולות להיות מועברות בתקשורת או עם microinjections המקומי של הרקמה בחדר תרבות 3D. אחרי 3 ועד 7 ימים של תרבות הרקמה או יכולה להיות הומוגני לבידוד תא וניתוח FACS או בידוד של RNA וחלבונים לניתוח פרופיל ביטוי הכולל, כמו גם עיבוד לניתוח היסטולוגית. מעמד הביטוי של חלבונים סיביים (αSMA, אני קולגן סוג ושני, פיברונקטין), מבנה רקמה של החלק גולה של החוט והעקביות של הרשת הסיבית מוערך לפני ואחרי הטיפולים. על מנת לפקח על הארגון מחדש ECM בתרבותנו בשילוב SHG (קולגן) וקרינה נרגשת ההדמיה שני פוטונים (אלסטין).
לאחר מכן ניתן לכמת שחלופים תאיים או מודל באמצעות תוכנת כימות תמונה. פרמטרים אלה נותנים אינדיקציה להשפעת התרופה על סיסטיק או Molecשינויי ular כי כבר מושרה במהלך התרבות. ניתן גם לבצע מערכי ECM יתר על כן על פרוסות בודדות כדי ליצור סקירה טובה יותר של ההשפעות. בסך הכל יש לנו הקמנו מערכת חזקה המאפשרת הלימוד של סיסטיק vivo לשעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הגישו בקשה לפטנט לטיפול במחלת Dupuytren: תרבות איבר 3D. # GB1307200. חוזי רישיון והשירות מסחריים זמינים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
- Shih, B., Bayat, A. Scientific understanding and clinical management of Dupuytren disease. Nat Rev Rheumatol. 6 (12), 715-726 (2010).
- Bisson, M. A., McGrouther, D. A., Mudera, V., Grobbelaar, A. O. The different characteristics of Dupuytren's disease fibroblasts derived from either nodule or cord: expression of α-smooth muscle actin and the response to stimulation by TGF-β1. The Journal of Hand Surgery. 28 (4), 351-356 (2003).
- Brickley-Parsons, D., Glimcher, M. J., Smith, R. J., Albin, R., Adams, J. P. Biochemical changes in the collagen of the palmar fascia in patients with Dupuytren's disease. The Journal of Bone & Joint Surgery. 63 (5), 787-797 (1981).
- Berndt, A., Kosmehl, H., Katenkamp, D., Tauchmann, V. Appearance of the myofibroblastic phenotype in Dupuytren's disease is associated with a fibronectin, laminin, collagen type IV and tenascin extracellular matrix. Pathobiology. 62 (2), 55-58 (1994).
- Karkampouna, S., et al. Novel ex vivo culture method for the study of Dupuytren's disease: effects of TGFβ type 1 receptor modulation by antisense oligonucleotides. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e142 (2014).
- Kruithof-de Julio, M., et al. Canonical Wnt signaling regulates Nkx3.1 expression and luminal epithelial differentiation during prostate organogenesis. Developmental Dynamics. 242 (10), 1160-1171 (2013).
- Krause, C., Kloen, P., ten Dijke, P. Elevated transforming growth factor β and mitogen-activated protein kinase pathways mediate fibrotic traits of Dupuytren's disease fibroblasts. Fibrogenesis & Tissue Repair. 4 (1), 14 (2011).
- Gorman, D. B., Wu, Y., Seney, S., Zhu, R. D., Gan, B. S. Wnt expression is not correlated with beta-catenin dysregulation in Dupuytren's Disease. J Negat Results Biomed. 5, 13 (2006).
- Streuli, C. H., Schmidhauser, C., Kobrin, M., Bissell, M. J., Derynck, R. Extracellular matrix regulates expression of the TGF-beta 1 gene. The Journal of Cell Biology. 120 (1), 253-260 (1993).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (4), 265-275 (2006).
- Gottrup, F., Ågren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration. 8 (2), 83-96 (2000).
- Gudjonsson, T., et al. Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition. Journal of Cell Science. 115 (1), 39-50 (2002).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Jokinen, J., et al. Integrin-mediated cell adhesion to type I collagen fibrils. Journal of Biological Chemistry. 279 (30), 31956-31963 (2004).
- Au-Yong, I. T. H., Wildin, C. J., Dias, J. J., Page, R. E. A review of common practice in Dupuytren surgery. Techniques in Hand & Upper Extremity Surgery. 9 (4), 178-187 (2005).
- Deries, M., Collins, J. J. P., Duxson, M. J. The mammalian myotome: a muscle with no innervation. Evolution & Development. 10 (6), 746-755 (2008).
- Deries, M., et al. Extracellular matrix remodeling accompanies axial muscle development and morphogenesis in the mouse. Developmental Dynamics. 241 (2), 350-364 (2012).
- Martins, G. G., et al. Dynamic 3D Cell Rearrangements Guided by a Fibronectin Matrix Underlie Somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), e7429 (2009).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nat. Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Karkampouna, S., de Julio, M. K. ruithof- Fibrosis: a novel approach for an old problem. Receptors & Clinical Investigation. 1 (5), (2014).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20 (8), 931-941 (2009).
- Freund, I., Deutsch, M., Sprecher, A. Connective tissue polarity. Optical second-harmonic microscopy, crossed-beam summation, and small-angle scattering in rat-tail tendon. Biophysical Journal. 50 (4), 693-712 (1986).
- Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
- Boulesteix, T., et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structure. Cytometry Part A. 69A (1), 20-26 (2006).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (5), 349-363 (2002).
- Hinz, B., Mastrangelo, D., Iselin, C. E., Chaponnier, C., Gabbiani, G. Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation. The American Journal of Pathology. 159 (3), 1009-1020 (2001).
- Eastwood, M., McGrouther, D. A., Brown, R. A. A culture force monitor for measurement of contraction forces generated in human dermal fibroblast cultures: evidence for cell-matrix mechanical signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1201 (2), 186-192 (1994).
- Verjee, L. S., Midwood, K., Davidson, D., Eastwood, M., Nanchahal, J. Post-transcriptional regulation of α-smooth muscle actin determines the contractile phenotype of Dupuytren's nodular cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (3), 681-690 (2010).
