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Medicine

मानव Dupuytren की Published: April 18, 2015 doi: 10.3791/52534
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4,5, 1,6
1Department of Molecular Cell Biology, Cancer Genomics Centre and Centre for Biomedical Genetics, Leiden University Medical Center, 2Department of Orthopedic Surgery, Academic Medical Center, 3Department of Plastic, Reconstructive and Hand Surgery, Academic Medical Center, 4Department of Orthopedic Surgery, Mayo Clinic, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 6Department of Dermatology, Leiden University Medical Center

Summary

Dupuytren रोग (डीडी) हाथ की हथेली के एक fibroproliferative बीमारी है। यहाँ, हम एक तीन आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणाली में डीडी से संस्कृति लकीर नमूनों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के अल्पकालिक संस्कृति प्रणाली 3 डी संरचना के संरक्षण और fibrotic ऊतक की आणविक गुणों की अनुमति देता है।

Introduction

Dupuytren रोग (डीडी), एक सौम्य fibroproliferative बीमारी की वजह से हाथ की हथेली में पिंड और रस्सियों के गठन के लिए उंगलियों के स्थायी बल का कारण बनता है। बीमारी फैल उत्तरी यूरोप के कॉकेशियन के बीच विशेष रूप से उच्च है, रोग के अंतर्निहित आनुवंशिक एटियलजि एक अनजान बनी हुई है। डीडी की मुख्य विशेषता, tendons और हाथ और उंगलियों की हथेली की त्वचा के बीच अंतरिक्ष के कब्जे में एक कठिन रेशेदार ऊतक रूप है जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन (जैसे, मज्जा), से अधिक उत्पादन होता है स्थायी रूप से ठीक आंदोलनों में खलल न डालें हाथ दो, के 3। रोग की पुनरावृत्ति फाइब्रोसिस 1, 4 के एक कारण के रूप में अंतर्निहित आनुवंशिक परिवर्तन का पता चलता है। एक प्रभावी उपचार सीधे सेलुलर और आणविक स्तर पर बेकाबू तंतुमय तंत्र को लक्षित करने के लिए हो सकता है।

फाइब्रोसिस पर हमारा हाल ही में काम एक के विकास के लिए हमें प्रेरित किया हैऔषधि परीक्षण की क्षमता के साथ मानव तंतुमय ऊतक के अल्पकालिक संस्कृति की अनुमति देता है कि उपन्यास 3 डी संस्कृति प्रणाली। इस प्रणाली को 2 डी तंतुप्रसू संस्कृतियों के सीमित दृष्टिकोण से उबरने के लिए और फाइब्रोसिस 5 मध्यस्थता में TGFβ मार्ग सक्रियण की एक्सॉन लंघन द्वारा हासिल की आंशिक नीचे विनियमन के लिए एक भूमिका है, को परिभाषित करने में मदद मिली है।

हम डीडी रोगियों से पूर्व vivo मानव लकीर नमूनों myofibroblasts के बीच बातचीत और आसपास के ईसीएम 5, 6 अध्ययन करने के लिए संस्कृति के लिए एक विधि विकसित किया है। डीडी संयोजी ऊतक फाइब्रोसिस के अध्ययन के साथ-साथ अन्य तंतुमय रोगों शल्य excised की histopathological विश्लेषण पर निर्भर करता है नमूनों, ऊतक और प्राथमिक संस्कृतियों या सेल छँटाई प्रक्रियाओं की स्थापना से fibroblasts की अलगाव। वे प्रयोगकर्ता द्वारा रोग गुण या चिकित्सीय हस्तक्षेप के बहिर्जात हेरफेर की अनुमति नहीं देते क्योंकि इन तरीकों काफी स्थिर रहे हैं। इसके अलावा, प्राथमिक सीईडालूँगा संस्कृतियों संस्कृति परिस्थितियों के अनुकूल है और उनके जीन अभिव्यक्ति के गुण भी जल्दी अंश के दौरान, हर बीतने पर अनिवार्य रूप से इन विवो स्थिति से अलग करने के लिए करते हैं (बीतने 3 के बीच में और 6) 7, 8। हम में अपशिष्ट सर्जिकल सामग्री को बनाए रखने में कामयाब रहे हैं रोगी-विशिष्ट विशेषताओं के अध्ययन और विरोधी तंतुमय या विरोधी भड़काऊ दवा यौगिकों की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है कि एक समय अवधि के लिए पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति।

प्रणाली डीडी fibroblasts के साथ ही अन्य प्रकार की कोशिकाओं 9 संवर्धन जब पहले मनाया के रूप में, लगाव पर ऊतक के परिवर्तन को रोकने के लिए, इस प्रकार, मध्यम के साथ नहीं, बल्कि प्लास्टिक के साथ ऊतक के संपर्क परमिट कि एक nitrocellulose झिल्ली पर आधारित है। डीडी ऊतक ही इन प्रोटीनों की बड़ी मात्रा में उत्पादन के बाद से कोई कोलेजन जेल या अन्य ईसीएम प्रोटीन सब्सट्रेट, आवश्यक है। यह देशी ईसीएम microenvironment और कारोबार पाप के रखरखाव के लिए फायदेमंद हैसीई मैट्रिक्स substrates के ऊतक वास्तुकला और समारोह 10, 11 के महत्वपूर्ण नियामक हैं। उदाहरण के लिए, ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin और कोलेजन के रूप में ईसीएम प्रोटीन, के रूप में इसी तरह उपकला कोशिकाओं 12 में शिखर-बेसल polarity के लिए दिखाया fibroblasts की सामने के पीछे ध्रुवता, 13 प्रभावित कर सकते हैं । फूट डालना कोशिकाओं सेल प्रवास और जीन अभिव्यक्ति, जैसे, झिल्ली पर α1β1 Integrin एक्सेसिबिलिटी मैं 14 कोलेजन टाइप करने के लिए कोशिका आसंजन को प्रभावित करता है जो निर्धारित करता है कोशिकी अणुओं की विषम वितरण किया है। इस 3 डी मॉडल के एक प्राथमिक लक्ष्य देशी microenvironment को बनाए रखने के लिए किया गया था के बाद से, कोई कृत्रिम ईसीएम मैट्रिक्स सब्सट्रेट इस्तेमाल किया गया था।

संक्षेप में: लकीर नमूनों समान रूप से एक बाँझ वातावरण में कटौती कर रहे हैं और nitrocellular झिल्ली पर रखा। इंजेक्शन के माध्यम से administrated उपचार की आवश्यकता है, तो वे झिल्ली पर रखा गया है के बाद ऊतकों इंजेक्ट कर रहे हैं। उपचार inj के माध्यम से प्रशासित किया जा करने की आवश्यकता नहीं हैection तो यौगिक (1% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM)) संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाता है। पहले से 5 के रूप में वर्णित संस्कृतियों, 30% sucrose के समाधान के माध्यम से संसाधित ऊतक 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय हो गई है, जिसके बाद दस दिनों की एक अधिकतम, अक्टूबर परिसर में एम्बेडेड और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत के लिए रखा जाता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान नैतिकता समिति की LUMC और एएमसी के दिशा निर्देशों का पालन करती है।

1. सर्जिकल प्रक्रिया तथा ऊतक संग्रह

नोट: Dupuytren की contracture के सर्जिकल छांटना के लिए विभिन्न तकनीकों मौजूद हैं, वर्तमान सोने के मानक आंशिक fasciectomy 15 है। अधिकांश रोगियों को दिन-शल्य चिकित्सा क्लिनिक में इलाज कर रहे हैं।

  1. मरीज की और एनेस्थिसियॉलॉजिस्ट की वरीयताओं को और रोगी के सह-रुग्णता के अनुसार सामान्य या क्षेत्रीय संज्ञाहरण के तहत सर्जरी प्रदर्शन। इन कारणों से इस पत्र के दायरे से बाहर हैं। उसके पहले संज्ञाहरण संतोषजनक है सत्यापित करने के लिए एक तेज वस्तु के साथ त्वचा को छूने, चीरा करने के लिए। एक रक्तहीन क्षेत्र में शल्य दृश्य की सुविधा के लिए एक बंधन का प्रयोग करें।
  2. बाँझ prepping और draping के बाद, एक कलम के साथ प्रत्याशित चीरा बाहर निशान। या तो अनुलंबीय ओ लूप बढ़ाई के तहत एक स्केलपेल के साथ त्वचा काटकर अलग कर देनाआर अतिरिक्त contractures रोकने के लिए वक्र चीरों का उपयोग कर और भी पर्याप्त प्रदर्शन के लिए अनुमति देने के लिए।
  3. कैंची विच्छेदन का उपयोग करना, अंतर्निहित अनुबंधित प्रावरणी palmaris से त्वचा और चमड़े के नीचे की परत को मुक्त। पहचानें और रोगग्रस्त कॉर्ड के midline की ओर विस्थापित कर सकते हैं क्योंकि उंगली की neurovascular बंडल की रक्षा करना। तंतुमय ऊतक (गुत्थी और / या कॉर्ड) उल्लिखित है एक बार, एक स्केलपेल का उपयोग तेजी से और क्षेत्रीय (आधा) यह आबकारी। रक्तगुल्म के गठन को रोकने के लिए प्रक्रिया के अंत में बंधन नियंत्रण में सावधानीपूर्वक रक्तस्तम्भन प्रदर्शन करते हैं।
  4. त्वचा को बंद करने के लिए, त्वचा का आंशिक लंबी प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त जेड plasties का उपयोग करें।
  5. इन अध्ययनों तंतुमय कॉर्ड, रोग के सबसे सक्रिय और सेलुलर भाग का ही गुत्थी भाग का उपयोग करें। सर्जन स्थूल पहचान प्रदर्शन करते हैं। हाथ की हथेली में अलग पिंड अक्सर व्यापारियों या एक रस्सी रहे हैं, लेकिन वे आम तौर पर लक्षण पैदा नहीं करते शायद ही कभी, resected कर रहे हैं।हम resected वाले अनुबंधित उंगली का एक रस्सी का हिस्सा थे कि पिंड थे। Handpalm (चित्रा 1 ए) में तार की कठिन मोटी हिस्सा द्वारा इन पिंड को पहचानें।
  6. सर्जन ऊतकों को हटा लेते हैं, तो तुरंत 10% एफसीएस और 1% (पी / एस) के साथ पूरक DMEM मध्यम युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब बाँझ संदंश का उपयोग यह हस्तांतरण। गीला बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) के एक बॉक्स पर इस माध्यम में 2 घंटे की एक अधिकतम के लिए ऊतक रखें (उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति की सुविधा के लिए ऑपरेशन रूम से ऊतक के परिवहन)।
  7. अगले कदम के लिए तैयारी कर रहा है, जबकि गीला बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर नमूने रखें। माल और सेल संस्कृति कक्ष की तैयारी 10-20 मिनट की आवश्यकता है।

उपकरण, संस्कृति मध्यम और संस्कृति आवेषण के 2. तैयारी

नोट: विशेष रूप से कहा गया है कि जब तक सभी प्रक्रियाओं आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. DMEM के तैयार करें 500 मिलीलीटर 10% एफसीएस और 1% (पी / एस) और फिल्टर के साथ पूरकterilize। 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम Prewarm।
  2. आटोक्लेव संदंश, घुमावदार पंखों मेयो कैंची की एक जोड़ी (लंबाई में 150-170 मिमी) और एक बाँझ कंटेनर में एक Metzenbaum कैंची की जोड़ी और दुकान।
  3. लामिना का प्रवाह के तहत, एक बाँझ 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली खुला। 12 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 1 बी, कम पैनल) के प्रत्येक कुएं में एक संस्कृति डालने (0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार, 12 मिमी व्यास) रखें।
  4. डालने की झिल्ली पर सीधे 600 पर अच्छी तरह से pipetting द्वारा prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति मीडिया के μl और नहीं के साथ 12 अच्छी तरह से थाली भरें। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) (चित्रा 1 बी, ऊपरी पैनल) में प्लेट रखें।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक 24 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें और माध्यम के 300 μl जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से। एक meniscus परत तरल और झिल्ली डालने के निचले हिस्से के बीच का गठन किया गया है, जब अच्छी तरह से प्रति मध्यम की मात्रा इष्टतम है।
      नोट: अच्छी तरह से नीचे मध्यम nitrocellulose membr के माध्यम से diffusesचित्रा 1 बी (कम पैनल) की योजनाओं में दर्शाया के रूप में ane meniscus के परत के गठन।

3. ऊतक तैयारी और पूर्व vivo टिशू कल्चर सेटअप

नोट: विशेष रूप से कहा गया है कि जब तक सभी प्रक्रियाओं आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. एक 100 मिमी पेट्री डिश पर 50 मिलीलीटर ट्यूब से हड्डी के गुत्थी हिस्सा स्थानांतरण और prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। ऊतक पूरी प्रक्रिया के दौरान तरल के साथ संपर्क में है कि सुनिश्चित करें।
    1. Metzenbaum कैंची का उपयोग कर perinodular मोटी परत निकालें। वसा ऊतक त्यागें। संदंश और घुमावदार पंखों कैंची का उपयोग के साथ, transversally छोटे टुकड़ों में ऊतक (200 माइक्रोन की अधिकतम मोटाई) में कटौती।
  2. लामिना हुड में इनक्यूबेटर से 12 अच्छी तरह से थाली स्थानांतरण। डालने की झिल्ली (गीला) पारदर्शी बदल गया है और इसलिए मध्यम के साथ संपर्क में है कि जाँच करें।
  3. संदंश का प्रयोगध्यान से (ऊतक पर तनाव लागू नहीं है) बाहरी परत को छू द्वारा एक ऊतक हिस्सा उठा। ऊतक हवा-मध्यम interphase में रहता है तो यह है कि सेल संस्कृति डालने की झिल्ली पर एक ऊतक हिस्सा रखें। संस्कृति एक ही डालने पर दो ऊतक भागों की एक अधिकतम / अच्छी तरह से।
  4. ऊतक ऐसे ऊतक कि मध्यम के साथ अनुदैर्ध्य संपर्क में, झिल्ली पर फ्लैट रखा न होने की झिल्ली से दूर तैरता है और न ही पूरी तरह से मध्यम से कवर किया जाता है सुनिश्चित करें कि। हवा के बुलबुले से बचें।
    नोट: इस स्तर पर, यह वृद्धि कारकों या मीडिया के हित के अवरोधकों को जोड़ने के लिए संभव है; उदाहरण के लिए, प्रतिकृति में और / या एकाग्रता की अवस्था में परीक्षण यौगिकों (ए, बी, सी, डी, ई)। प्रयोग ठीक से स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सामान्य विकास शर्तों के तहत ऊतक के कम से कम दो नियंत्रण (इलाज) टुकड़े को शामिल करें। एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 3-7 दिनों के लिए ऊतकों को सेते हैं।
  5. Overexpression अगर lentiviral या adenoviral निर्माण के साथ या तो ऊतक संक्रमित या ई नीचे दस्तकएक जीन के हित की जरूरत के xperiments (चित्रा 2) प्रदर्शन किया जाएगा। संदंश का उपयोग कर एक 35 मिमी डिश में 12 अच्छी तरह से थाली से एक ऊतक भाग को हस्तांतरित नहीं।
    1. उच्च अनुमापांक वायरस के 10 μl की अधिकतम मात्रा का प्रयोग करें।
    2. 50 μl पीबीएस चयनित वायरस के 10 μl युक्त के साथ भरी हुई एक इंसुलिन सिरिंज के साथ एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन। ऊतक के केंद्र के लिए सीधा सुई रखें।
    3. धीरे धीरे सिरिंज की सामग्री इंजेक्षन। सीधे सुई वापस लेना मत करो। ऊतक puncturing करते हैं, सुई दूसरे पक्ष के माध्यम से जाना है, लेकिन (ऊतक के केन्द्र के आसपास) ऊतक के भीतर ही सुई बनाए रखने देना नहीं है।
    4. 12 अच्छी तरह से थाली में वापस ऊतक स्थानांतरण संस्कृति की थाली को बंद करने और इनक्यूबेटर में जगह (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।

4. साबुत माउंट immunofluorescence धुंधला और 3 डी पुनर्निर्माण

नोट: सभी समर्थकविशेष रूप से कहा गया है कि जब तक cedures आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं। नीचे वर्णित पूरे माउंट immunostaining और इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों 16-19 के लिए इस्तेमाल किया जैसा कि पहले बताया विधियों से एक रूपांतर है। बफ़र और सामग्री तालिका 1 और सामग्री की सूची में वर्णित हैं।

  1. पीबीएस युक्त 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए संस्कृति की थाली से स्थानांतरण के ऊतकों। एक घूर्णन मंच पर पीबीएस समाधान में 5 मिनट के लिए धो 2x। एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% में बफर पीएफए ​​(2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ऊतक प्रति 1.5 मिलीलीटर समाधान), ओ / एन ऊतकों को ठीक करें।
  2. पीएफए ​​निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में 3x धो लें।
  3. एक घूर्णन मंच पर आरटी पर 2 घंटे के लिए एक 25% मेथनॉल समाधान में विसर्जन के द्वारा ऊतकों निर्जलीकरण। एक घूर्णन मंच पर आरटी पर 2 घंटे के लिए प्रत्येक समाधान में डूबे ऊतकों के साथ धीरे-धीरे मेथनॉल प्रतिशत (50%, 75%, 100%) बढ़ाएँ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर DMSO के 3 सप्ताह के लिए / मेथनॉल समाधान (permeabilization के कदम) में ट्रांसफर ऊतकों,के रूप में पहले 18 में वर्णित है।
    नोट: इस स्तर पर, ऊतकों -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में लंबी अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  5. प्रक्रिया 16, 17 धुंधला के साथ आगे बढ़ना, धीरे-धीरे ऊतकों (75% -50% -25% -0% मेथनॉल श्रृंखला) rehydrate। लगातार आंदोलन के तहत, 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर दो घंटे के लिए प्रत्येक पुनर्जलीकरण कदम प्रदर्शन करते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 20% DMSO के ओ / एन युक्त पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते हैं। विरोधी α चिकनी पेशी actin: पीबीएस में वाणिज्यिक कंपनियों के शेयरों का उपयोग कर निम्नलिखित अनुपात में एंटीबॉडी का उपयोग करें: (1 500, माउस) विरोधी कोलेजन प्रकार मैं (1: 500, बकरी), प्रकार III (1 विरोधी कोलेजन: 500, बकरी)।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस (परिवर्तन पीबीएस समाधान 3 से 4 बार) पर 48 घंटे के लिए पीबीएस में बड़े पैमाने पर धो लें।
  8. एक पर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा 555 विरोधी माउस, एलेक्सा 488 विरोधी बकरी) पतला: पीबीएस 1% (बीएसए) और 20% DMSO युक्त में 250 कमजोर पड़ने। 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  9. 4 में 48 घंटे के लिए पीबीएस में बड़े पैमाने पर धो लें76, सी और, परमाणु counterstain साथ सेते-प्रो-3 एक पतला: अंतिम धोने कदम पर पीबीएस में 500।
    नोट: करने के लिए प्रो-3 (क वह-ने 633 एनएम लेजर लाइन के साथ) एक दूर-लाल उत्सर्जन डीएनए डाई और अन्य चैनलों के साथ साथ इमेजिंग के लिए संयुक्त है; इस मामले कोलेजन प्रकार मैं / कोलेजन प्रकार III (488 एनएम), α चिकनी पेशी actin (555 एनएम) में करने के लिए प्रो-3 (647 एनएम)।
  10. एक मेथनॉल श्रृंखला (25% -50% -75%) धीरे-धीरे ऊतक निर्जलीकरण के लिए ऊतकों स्थानांतरण; लगातार आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर दो घंटे के लिए प्रत्येक निर्जलीकरण कदम प्रदर्शन करते हैं।
    1. Polypropylene ट्यूब में स्थानांतरण के ऊतकों। साफ़ methylsalicylate में ऊतकों (रासायनिक हुड के तहत संभाल) 18 या एक विकल्प का उपयोग Babb समाधान के रूप में 19। ऊतकों पारदर्शी हो जब तक लगातार आंदोलन के तहत आरटी पर सेते हैं। माउंट एक स्लाइड और कड़ी सेट बढ़ते मध्यम (चित्रा 1C, ऊपरी पैनल) के साथ बंद एक coverslip के बीच।
  11. एक औंधा confocal सूक्ष्म पर छवि के नमूनेउच्च एनए 63X और / या 100X तेल विसर्जन उद्देश्यों (चित्रा 1C) के साथ सुसज्जित गुंजाइश।
    1. माइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा प्रदान की सफाई समाधान के साथ लेंस साफ करें।
    2. उद्देश्य लेंस पर तेल की एक बूंद लागू करें। नमूना पर खुर्दबीन मंच और ध्यान पर नमूना के साथ स्लाइड रखें।
  12. लेजर लाइनों 488 एनएम, 514 एनएम और 633 एनएम के साथ तीन-चैनल प्रतिदीप्ति के साथ इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप पर विन्यास निर्धारित करें।
  13. एकल XY छवियों या एकाधिक फोकल हवाई जहाज़ छवियों (जेड हो चुकी है) (चित्रा 3 ए) मोल। 3D पुनर्निर्माण के प्रदर्शन के लिए जेड स्टैक की वृद्धि की चौड़ाई का प्रयोग करें। एक उच्च संकल्प छवि कम स्कैनिंग गति, औसत स्कैन (≥ 3) की संख्या का उपयोग करें और 1024 X 1024 पिक्सल रेजोल्यूशन के 16-बिट छवियों को प्राप्त प्राप्त करने के लिए।
  14. जेड स्टैक अधिग्रहीत छवियों का विश्लेषण: पहला नाम बदलने और छवि फ़ाइल (XYZ) बचाने के लिए। Confocal खुर्दबीन के सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करना, एक अधिकतम तीव्रता proje को विन्यस्तएक 3 डी में जेड ढेर छवियों के ction छवि को खंगाला।
    1. "विजुअलाइजेशन" और "3 डी प्रोजेक्शन 'के तहत क्लिक करें," प्रक्रिया उपकरण "में, XYZ फ़ाइल का चयन करें। प्रक्षेपण (या फ्लोरोसेंट संकेत संतृप्त है अगर "औसत") की पद्धति में "अधिकतम" दर्ज करें। एक एकल प्रक्षेपण एक्स, वाई, जेड और विमानों को बदलने, और प्रक्षेपण उपकरण (चित्रा 3 बी, आर 1) लागू नहीं है के लिए।
  15. उद्देश्यों को देखने के लिए एनीमेशन (confocal सॉफ्टवेयर) के साथ एक 3 डी प्रोजेक्शन बनाने के लिए जेड ढेर छवियों का उपयोग करें। XYZ फ़ाइल का चयन करें, प्रक्रिया उपकरणों में, "विजुअलाइजेशन" और "3 डी प्रोजेक्शन 'के तहत क्लिक करें।
    1. "मूवी बनाएं" पर क्लिक करें। डिग्री में प्रारंभ रोटेशन कोण दर्ज (उदाहरण के लिए, फिल्म, वाई अक्ष के शुरुआती बिंदु के रूप में 0 डिग्री) और "सेट शुरू" पर क्लिक करें। अंत फिल्म के बिंदु (उदाहरण के लिए, 180 डिग्री या 360 डिग्री में समाप्ति रोटेशन कोण (वाई अक्ष) दर्ज करें6; और) एक पूर्ण रोटेशन के लिए "सेट अंत" पर क्लिक करें।
    2. प्रक्षेपण (या फ्लोरोसेंट संकेत संतृप्त है अगर "औसत") के एक तरीके के रूप में "अधिकतम" का चयन करें। 3D पुनर्निर्माण के रोटेशन के लिए "फ्रेम की संख्या" दर्ज करें (उदाहरण के लिए, 20 घुमाव या उच्च रोटेशन की गति को कम करने के लिए)। "लागू करें" पर क्लिक करें। फिल्म निर्यात दृश्य फाइल के रूप में (जैसे, "AVI") प्रत्येक रोटेशन कोण के लिए एक छवि फ़ाइल बनाता है जो "झगड़ा" फ़ाइल के रूप में (अनुपूरक मूवी 1) या निर्यात (3B चित्रा, रोटेशन R4, R10, R18)।

5. संयुक्त दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (कोलेजन) और संस्कृति के दौरान पूर्व vivo ऊतक पर दो photon उत्साहित प्रतिदीप्ति (elastin) इमेजिंग

नोट: विशेष रूप से कहा गया है कि जब तक सभी प्रक्रियाओं आरटी पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

  1. इनक्यूबेटर से transwell प्लेटें निकालें और तिवारी (unfixed) एक ही स्थानमध्यम के 500 μl युक्त एक 35 मिमी सेल संस्कृति की थाली में ssue हिस्सा है।
  2. लंबे अक्ष प्लेट पर फ्लैट इतना है कि ऊतक स्थिति। , हालांकि सभी समय पर गीला नहीं तैर ऊतक रखें।
  3. सीधे ऊतक (चित्रा 1C) के साथ संपर्क में multiphoton खुर्दबीन के पानी डूबे उद्देश्य रखें।
  4. 800 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ छवियों को प्राप्त करें और 371-425 एनएम (एसएचजी, मज्जा) और 474-532 एनएम (autofluorescence, इलास्टिन) (चित्रा -3 सी) के बीच प्रकाश उत्सर्जित इकट्ठा। एक 20X / 1.0 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग एक femtosecond लेजर के साथ सुसज्जित एक ईमानदार confocal खुर्दबीन में दो photon माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन। प्रक्रिया confocal निर्माता के सॉफ्टवेयर के साथ ढेर।
    नोट: कोलेजन अणुओं के एक निकट अवरक्त लेजर के साथ उत्तेजना विभिन्न गहराई में देशी कोलेजन संरचनाओं के उच्च विपरीत इमेजिंग बनाता है।

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Representative Results

पूर्व vivo की विधि, संयोजी ऊतक के 3 डी संस्कृति के रूप में अच्छी तरह से फाइब्रोसिस के ईसीएम और डीडी ऊतक गठन अन्य सेल घटकों और संभावित रूप से अन्य प्रकार के बीच संबंध को समझने के लिए एक आसान और मजबूत सेट अप प्रणाली है। इसके अलावा इस प्रणाली के लिए एक विश्वसनीय विधि विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और fibrotic भार 20 पर उनके प्रभाव पर यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है।

Dupuytren के फाइब्रोसिस से निकाली गई शल्य चिकित्सा अपशिष्ट पदार्थ के संग्रह से कदम, संस्कृति कक्ष और विश्लेषण उपकरणों के उदाहरण के विधानसभा चित्रा 1 में प्रस्तुत कर रहे हैं। चित्रा 1 में सचित्र के रूप में, इस विधि जैसे, बड़ी स्क्रीन दवा स्क्रीन के लिए एक प्रायोगिक उपकरण प्रदान करता है, antifibrotic दवा यौगिकों के रूप में अच्छी तरह से एक वास्तविक समय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से ईसीएम मॉडलिंग का अध्ययन। तंतुमय की हड्डी के गांठदार भागों में समान रूप से कटा हुआ है और transwell प्लेटों में रखा जाता है; प्रत्येक ऊतक भाग (100-200 माइक्रोन) एक संस्कृति डालने (0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार, 12 मिमी व्यास) की झिल्ली के शीर्ष पर सुसंस्कृत है। संस्कृति के माध्यम झिल्ली के माध्यम से ऊतक के साथ संपर्क की इजाजत दी, नीचे चैंबर में जोड़ा जाता है। औसत पर 30-40 ऊतक भागों दवाओं की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग की अनुमति देता है जो एक भी लकीर नमूना, से प्राप्त किया जा सकता है; यौगिकों, छोटे अणुओं या वृद्धि कारकों। एकाग्रता और / या दवाओं के समय पर निर्भर प्रभाव को संबोधित कर रहे प्रयोगों से संभव है।

चित्रा 2 में दिखाया गया है, जीन अभिव्यक्ति एडिनो के उपयोग द्वारा (overexpression / नीचे दस्तक) चालाकी से किया जा सकता है / lentiviruses सीधे ऊतक में इंजेक्ट किया। Fluorescently टैग वायरल पारगमन इंजेक्शन द्वारा ताजा मोटी ऊतक नमूनों में किया जाता है। ऊतक 24-48 घंटा के बाद इंजेक्शन के लिए संस्कृति में रहता है और बाद में तय एम्बेडेड और 0.7 माइक्रोन cryosections में sectioned है। इसके अलावा, विभिन्न यौगिकों या संस्कृति की स्थिति ऊतक भाग के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिएconfocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 ए-बी) द्वारा किया जाता है में चित्रा 3। मोटी ऊतकों की 3 डी इमेजिंग के रूप में दिखाया है और तय पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस के अधीन हैं। एक अन्य विधि संस्कृति में बनाए रखा ऊतकों पर लाइव 3 डी इमेजिंग है; अंतर्जात कोलेजन remodeling के दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) (चित्रा -3 सी) द्वारा हौसले से विच्छेदित, गैर निश्चित ऊतक भागों में वास्तविक समय का अध्ययन किया जाता है। संभावित विरोधी तंतुमय दवाओं का असर भी अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही ऊतक के कुछ हिस्सों में पीछा किया जाता है। मोटी ऊतक के कोलेजन संरचनाओं एक ईमानदार multiphoton खुर्दबीन में एसएचजी का उपयोग imaged कर रहे हैं। इमेजिंग के दौरान, ऊतक नमूनों माध्यम में रखा जाता है और एक पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ imaged हैं। इमेजिंग के बाद, ऊतकों संस्कृति प्रणाली वापस स्थानांतरित किया जा सकता है। प्रभाव में इन विट्रो सेल आधारित assays के एक से अधिक लाभ प्रदान करने सेलुलर और बाह्य वातावरण के स्तर पर अध्ययन किया जा सकता है। एना के लिए कई संभावनाएं हैंइस तरह तय ऊतक वर्गों के ऊतक विज्ञान, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3D पुनर्निर्माण इमेजिंग, एसएचजी और अंतर्जात कोलेजन और elastin के दो photon उत्साहित प्रतिदीप्ति इमेजिंग के रूप में जैविक प्रभाव के lysis। एसएचजी इमेजिंग के लाभ में से कुछ कोई एंटीबॉडी धुंधला तैयारी के लिए आवश्यक है कि और एक ही ऊतक (संस्कृति शर्तों के दौरान समय पाठ्यक्रम) कई बार imaged किया जा सकता है कि, ताजा, गैर निश्चित ऊतक का उपयोग कर रहे हैं। एसएचजी और दो ​​photon उत्साहित प्रतिदीप्ति इमेजिंग मांसपेशियों और संयोजी ऊतक 21-23 और बेदाग धमनियों की दीवार संरचना 24 के लिए पहले से वर्णित किया गया है, हालांकि, यहां हम Dupuytren के फाइब्रोसिस के अध्ययन के लिए एक विकल्प के आवेदन की रिपोर्ट।

चित्र 1
पूर्व vivo 3 डी टिशू कल्चर प्रणाली के 1. योजना चित्रा। (ए) डीडी स्थायी मोड़ contracture। यह आंकड़ा पिछले अध्ययन 5 से संशोधित किया गया है। सेट अप पूर्व vivo संस्कृति (बी) उदाहरण। ईसीएम बयान के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रयोगात्मक दृष्टिकोण (सी) उदाहरण। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पूरे माउंट ऊतक में चित्रा 2. सबूत के सिद्धांत पूर्व vivo वायरल की मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति मॉडुलन। (ए) के नाभिक-प्रो-तीन डाई (नीला) के साथ कल्पना कर रहे हैं। बार्स 75 माइक्रोन। (बी) फ्लोरोसेंट के प्रत्यक्ष दृश्यडाई DsRed (लाल), adenovirus व्यक्त-DsRed के साथ के बाद इंजेक्शन। बार्स 75 माइक्रोन। (सी) मर्ज किए गए छवि (नीले रंग में परमाणु धुंधला, रेड में DsRed)। 24 घंटा के भीतर कोशिकाओं में adenoviral वितरण का संकेत DsRed की cytoplasmic स्थानीयकरण। बार्स 75 माइक्रोन। (लोमो) Lentiviral पारगमन। (डी) नाभिक-प्रो-तीन डाई (नीला) के साथ कल्पना कर रहे हैं। बार्स 25 माइक्रोन। (ई) ऊतक वर्गों में GFP के प्रत्यक्ष दृश्य (हरा), Lenti-GFP के कणों के साथ के बाद इंजेक्शन। Lenti-GFP के intracellular स्थानीयकरण का संकेत बार्स 25 माइक्रोन। (एफ) डी के मर्ज किए गए छवि और ई। बार्स 25 माइक्रोन (जीएच) उदाहरण ('ए' के रूप में नामित) ब्याज की जीन के खिलाफ Lentivirus की मध्यस्थता पछाड़ना की;। (जी) Lentivirus ले जाने के तले shRNA अनुक्रमऊतक में पूर्व vivo इंजेक्ट किया गया था। ('ए' के ​​रूप में नामित) ब्याज की प्रोटीन के लिए immunofluorescence धुंधला लाल रंग में दिखाया गया है। बार्स 75 माइक्रोन। (एच) Lentivirus ले जाने के जीन एक-shRNA अनुक्रम ऊतक में पूर्व vivo इंजेक्ट किया गया था। प्रोटीन 'ए' के ​​लिए immunofluorescence धुंधला। नाभिक-प्रो-तीन डाई के साथ दाग रहे हैं। बार्स 75 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. 3 डी पुनर्निर्माण इमेजिंग, दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी और दो ​​photon उत्साहित प्रतिदीप्ति इमेजिंग। Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा (ए) 3 डी इमेजिंग। विभिन्न ऊतकों को गहराई (जेड = 50-200 माइक्रोन) के साथ फोकल विमानों में एकल (XY) छवियों। पूरे माउंट immunofluorescence धुंधला; myofibroblast मार्कर α-चिकनी (, αSMA लाल) पेशी actin, परमाणु धुंधला (को-प्रो-3, नीला)। बार्स:। "R1", "R4", "R10", "R18" के रूप में संकेत अलग 3 डी घुमाव पर पैनल में संकेत के रूप में 500 माइक्रोन (बी) 3 डी कच्चे छवियों की (जेड स्टैक 389 माइक्रोन) छवि को खंगाला। बार्स 500 माइक्रोन। ताजा, मोटी ऊतक भागों में दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग (बाएं पैनल, हरा) से (सी) अंतर्जात कोलेजन सामग्री मॉडलिंग। ईसीएम के इलास्टिन संरचनाओं के दो photon उत्साहित प्रतिदीप्ति (TPF) multiphoton माइक्रोस्कोपी (मध्यम पैनल, लाल) द्वारा कब्जा कर लिया गया था। कोलेजन (हरा) और elastin (लाल) (सही पैनल) के मर्ज किए गए छवि। बार्स:। 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 1. प्रतिनिधियोंगुणात्मक 3 डी Dupuytren के पूरे माउंट ऊतक के पुनर्निर्माण फिल्म पूरे माउंट immunofluorescence धुंधला के लिए सात दिन पूर्व vivo संस्कृति और प्रसंस्करण के बाद प्रदर्शन किया था डीडी ऊतक के confocal इमेजिंग।; myofibroblast मार्कर α-चिकनी (, αSMA लाल) पेशी actin, परमाणु धुंधला (को-प्रो-3, नीला)। स्केल बार = 500 माइक्रोन। फ्रेम्स = 20. जेड = 389 माइक्रोन। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4% ​​paraformaldehyde / पीबीएस
पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) 8.00 छ NaCl (0.137 एम)
0.20 छ KCl (2.7 मिमी)
0.20 छ के.एच. 2 पीओ 4 (1.1 मिमी)
0.10 छ 2 MgCl · 6H 2 हे (0.5 मिमी)
2.16 छ दो ना HPO 4 · 7H ओ 2 (8.1 मिमी)
0.10 छ निर्जल 2 CaCl (0.9 मिमी)
एच 2 ओ एक एल
, धूआं हुड में 100 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त एक फ्लास्क में paraformaldehyde के 4 जी भंग कुप्पी को कवर किया। एक हीटिंग / सरगर्मी ब्लॉक पर कुप्पी रखें और धीरे समाधान हलचल। वह अधिकतम 65 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है, ताकि तापमान पर नजर रखने। ओवर-हीटिंग से बचें। Paraformaldehyde भंग है और समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है एक बार, गर्मी बंद स्विच लेकिन हलचल करने के लिए छोड़ दें। सुरक्षा कारणों से संभाल नहीं है। ठंडा करने की अनुमति दें। , विभाज्य समाधान ठंडा और -20 में डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या अधिकतम एक सप्ताह के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में लंबी अवधि की दुकान करते हैं।
बीएसए (गोजातीय सीरम albumin), 10% (डब्ल्यू / वी) 100 मिलीलीटर एच 2 ओ में 10 ग्राम बीएसए भंग फ़िल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर बाध्यकारी एक कम प्रोटीन का उपयोग कर बाँझ। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
DMSO के / मेथनॉल (20%) permeabilization के समाधान साथ डाइमिथाइल sulfoxide मिक्समेथनॉल (1: 4 उपमा, कुल मात्रा 100 मिलीलीटर)।

तालिका 1. बफर समाधान।

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Discussion

पूर्व vivo मानव संयोजी ऊतक संवर्धन के सबसे महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए शल्य हटाने के बाद ऊतक का तत्काल उपयोग कर रहे हैं; ऊतक सभी समय पर मध्यम या नमकीन घोल में रहना चाहिए; एक बाँझ संस्कृति को बनाए रखने; ऊतक की अनुप्रस्थ वर्गों अधिकतम 200 माइक्रोन मोटाई होनी चाहिए; ऊतक माध्यम के साथ संपर्क में है, लेकिन पूरी तरह से जलमग्न नहीं जब पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली की स्थापना की योजना है। मध्यम केवल एक छोटी मात्रा में transwell के बाहर चैम्बर (जैसे, 500-600 μl 12 अच्छी तरह से प्रति प्लेट की सतह क्षेत्र) पर जोड़ा जाना चाहिए।

Dupuytren से व्युत्पन्न संयोजी ऊतक ऐसे कोलेजन, proteoglycans, और elastin के रूप में ईसीएम प्रोटीन की उच्च सामग्री के साथ एक कठिन संरचना में उलझ जाता है; इन गुणों के लिए और साथ ही कारण की वजह से myofibroblast contracture के लिए यह ऊतकों के माध्यम से कटौती करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह उचित शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है; बीएल घुमावदारछोटे ऊतक भागों को काटने के लिए बराबर मोटाई और छोटे शल्य कैंची में बड़े हिस्सों को काटने के लिए मेयो कैंची aded (जैसे, अधिक ऊतक भागों का उपयोग 24 अच्छी तरह प्लेटें आवश्यक हैं)।

डीडी के अध्ययन के लिए तरीके histopathological excised तंतुमय नमूना का विश्लेषण करती है, या प्राथमिक fibroblasts की व्युत्पत्ति हैं। किया जाता है रोगी सामग्री से सेल व्युत्पत्ति दो तरीके है; तरीकों में से एक में, ऊतक भागों fibroblasts की परिणाम है जब तक वहाँ एक सप्ताह के नंबर के लिए प्लास्टिक की संस्कृति प्लेटों में सुसंस्कृत हैं। दूसरी विधि कोलैजिनेज और trypsin के साथ ऊतक के enzymatic उपचार है। पहली विधि के कारण संस्कृति की स्थिति के लिए समय लेने वाली है, तंतुप्रसू गुण बदल रहे हैं और एक ही सेल लाइन के मार्ग के बीच में पारित होने पर निर्भर परिवर्तनशीलता है। एंजाइमी विधि तेज है और यह, हालांकि, जन्मजात ईसीएम के बाहर इन कोशिकाओं की इन विट्रो रखरखाव में विवो को प्रतिबिंबित नहीं करता सेल assays के छँटाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 25 संकेतन (अर्थात् mechanoregulation और mechanotransduction) को प्रभावित करती है। समय 26 की छोटी सी अवधि में MFBS में αSMA तंतुओं के disassembly में तनाव परिणाम का अंत। पूर्व vivo में αSMA की बहुतायत 27, 28। तकनीकी और जैविक परिवर्तनशीलता के संबंध के समावेश से फायदा हो सकता है, हमारे विधि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य (व्यवहार्यता, ईसीएम नेटवर्क) और कारण संस्कृति के कम समय के लिए ऊतक परिवर्तन कम होने का खतरा है। उदाहरण के लिए, तंतुप्रसू परिणाम की विधि जैव रासायनिक परिवर्तन हो सकती है, जो कई हफ्तों की आवश्यकता है (जैसे, आनुवंशिक परिवर्तन, replicative वार्धक्य के संचय)। हालांकि, रोगी विशिष्ट आनुवंशिक विशेषताओं और जैविक परिवर्तनशीलता डीडी अनुसंधान के क्षेत्र में से प्रति चुनौतियां हैं और मौजूदा तरीकों से किसी के साथ घेरने की कोशिश नहीं की जा सकती।

इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया है, शल्य हटाने के बाद तंतुमय डीडी नमूनों सीधे पूर्व vivo 3 डी प्रणाली में सुसंस्कृत और / या फ्रोजन तस्वीर हैं। वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है, ऊतक के संशोधन वृद्धि कारकों, रासायनिक यौगिकों, वी के अलावा द्वारा संभव हैजीन वितरण, antisense oligonucleotides और miRNAs irus की मध्यस्थता। यौगिकों मीडिया में या 3 डी संस्कृति कक्ष में ऊतक के स्थानीय microinjections के साथ दिया जा सकता है। 3 के बाद और ऊतक या तो सेल अलगाव और FACS विश्लेषण या कुल शाही सेना और अभिव्यक्ति की प्रोफाइल के विश्लेषण के लिए प्रोटीन का अलगाव, साथ ही histological विश्लेषण के लिए कार्रवाई के लिए homogenized जा सकता संस्कृति के 7 दिनों के लिए। रेशेदार प्रोटीन (αSMA, कोलेजन प्रकार मैं और द्वितीय, फ़ाइब्रोनेक्टिन), रस्सी और रेशेदार नेटवर्क की निरंतरता की गुत्थी भाग के ऊतक वास्तुकला की अभिव्यक्ति की स्थिति से पहले और उपचार के बाद मूल्यांकन किया है। संस्कृति के दौरान ईसीएम rearrangements की निगरानी करने के लिए हमें स्वयं सहायता समूह (कोलेजन) और दो-फोटान उत्साहित प्रतिदीप्ति (इलास्टिन) इमेजिंग संयुक्त।

कोशिकी rearrangements फिर मात्रा निर्धारित या छवि मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मॉडलिंग की जा सकती है। इन मानकों फाइब्रोसिस या molec पर दवा प्रभाव का संकेत देसंस्कृति के दौरान प्रेरित किया गया है कि ular परिवर्तन। इसके अलावा ईसीएम सरणियों भी प्रभाव का एक बेहतर सिंहावलोकन उत्पन्न करने के लिए एक स्लाइस पर प्रदर्शन किया जा सकता है। कुल मिलाकर हम फाइब्रोसिस पूर्व vivo के अध्ययन की अनुमति देता है कि एक मजबूत प्रणाली की स्थापना की है।

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Disclosures

3 डी अंग संस्कृति: लेखक Dupuytren रोग के लिए एक पेटेंट आवेदन दायर किया है। # GB1307200। वाणिज्यिक लाइसेंस और सेवा अनुबंध उपलब्ध हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 11965-084
fetal calf serum (FCS) Gibco high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
Cell culture inserts Millicell PIHA01250 0.45 μm pore size, 12 mm diameter
anti-collagen type I Southern Biotech 1310-08
anti-α smooth muscle actin Sigma A2547
anti-collagen type III Southern Biotech 1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Invitrogen A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody Invitrogen A-11055
TOPRO-3 Invitrogen T3605
methylsalicylate Sigma M6752
paraformaldehyde Sigma P6148
Tissue Tek OCT Sakura 25608-930
Microsccope glass coverslips Menzel-Glaser BB024060A1 24 x 60 mm
Microscope SuperFrost slides Menzel-Glaser AA00000102E 76 x 26 mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium Vector laboratories H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope Leica Microsystems Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope Jena, Germany Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective.

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References

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Karkampouna, S., Kloen, P., Obdeijn, M. C., Riester, S. M., van Wijnen, A. J., Kruithof-de Julio, M. Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (98), e52534, doi:10.3791/52534 (2015).

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