Summary
Enfermedad de Dupuytren (DD) es una enfermedad fibroproliferativa de la palma de la mano. A continuación, presentamos un protocolo para muestras de resección cultura de DD en un sistema de cultivo en tres dimensiones (3D). Tal sistema de cultivo a corto plazo permite la preservación de la estructura 3D y propiedades moleculares del tejido fibrótico.
Introduction
Enfermedad de Dupuytren (DD), una enfermedad benigna fibroproliferativa provoca la flexión permanente de los dedos debido a la formación de nódulos y cordones en la palma de la mano. Aunque la propagación de la enfermedad es particularmente alto entre los caucásicos del norte de Europa, la etiología genética subyacente de la enfermedad sigue siendo desconocida 1. La principal característica de DD es el exceso de producción de (ECM) proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno), que forman un tejido fibroso duro que ocupa el espacio entre los tendones y la piel de la palma de la mano y los dedos, lo que altera permanentemente los movimientos finos de la mano 2, 3. La recurrencia de la enfermedad sugiere alteraciones genéticas subyacentes como una causa de la fibrosis 1, 4. Un tratamiento eficaz podría ser para apuntar directamente los mecanismos fibróticas incontrolables a nivel celular y molecular.
Nuestro trabajo reciente sobre la fibrosis nos ha llevado al desarrollo de unnovedoso sistema de cultivo 3D que permite cultivo a corto plazo de tejido fibrótico humano con el potencial de pruebas de drogas. Este sistema ha ayudado a superar el enfoque limitante de cultivos de fibroblastos 2D y definir el papel de la regulación a la baja parcial, logrado por la omisión de exón, de activación de la vía TGF en la mediación de la fibrosis 5.
Hemos desarrollado un método para el cultivo ex vivo especímenes de resección humana de pacientes con DD para estudiar la interacción entre los miofibroblastos y la ECM circundante 5, 6. El estudio de DD fibrosis del tejido conectivo, así como otras enfermedades fibróticas se basa en el análisis histopatológico de la extirpado quirúrgica especímenes, el aislamiento de los fibroblastos del tejido y el establecimiento de cultivos primarios o procedimientos de clasificación de células. Estos enfoques son bastante estática, ya que no permiten la manipulación exógena de las propiedades de la enfermedad o intervención terapéutica por el experimentador. Además, ce primariall culturas tienden a adaptarse a las condiciones de cultivo y sus propiedades de expresión de genes difieren esencialmente de la situación in vivo después de cada paso, incluso durante los primeros pasajes (entre el paso 3 y 6) 7, 8. Hemos logrado mantener el material quirúrgico de residuos en ex vivo condiciones de cultivo para un periodo de tiempo que permite el estudio de las características específicas del paciente y el cribado de compuestos de fármacos anti-fibróticos o anti-inflamatorios.
El sistema se basa en una membrana de nitrocelulosa que permite el contacto del tejido con el medio, pero no con el plástico, por lo tanto, la prevención de la alteración del tejido tras la unión, como ya se observó cuando el cultivo de fibroblastos DD, así como otros tipos de células 9. No se requiere gel de colágeno u otro sustrato de proteínas ECM, ya que el propio tejido DD produce grandes cantidades de estas proteínas. Esto es ventajoso para el mantenimiento de la microambiente ECM nativa y sin rotaciónsustratos de matriz ce son importantes regulador de la arquitectura y la función 10, 11 tejidos. Por ejemplo, las proteínas ECM como la fibronectina, laminina y colágeno, pueden influir en la polaridad delantero-trasero del fibroblastos mostradas como igualmente para la polaridad apical-basal en las células epiteliales de 12, 13 . células polarizadas tienen una distribución asimétrica de moléculas extracelulares que determina la migración celular y la expresión génica, por ejemplo, la accesibilidad de la integrina α1β1 en la membrana afecta a la adhesión celular a colágeno de tipo I 14. Puesto que un objetivo principal de este modelo 3D era preservar el microambiente nativo, no se utilizó sustrato matriz ECM artificial.
En resumen: los especímenes de resección son igualmente cortados en un ambiente estéril y se colocaron en membranas nitrocellular. Si se requiere un tratamiento administrado a través de la inyección de los tejidos se inyectan después de que se han colocado en la membrana. Si el tratamiento no requiere ser administrado a través de injección entonces el compuesto se añade al medio de cultivo (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), con 1% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). Los cultivos se mantuvieron durante un máximo de diez días después de que el tejido se fija en 4% de paraformaldehído (PFA), procesado a través de solución de sacarosa al 30%, embebidos en compuesto OCT y se almacenaron a -80 ° C, como se describió previamente 5.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices LUMC y AMC de comité de ética de investigación humana.
1. Procedimiento Quirúrgico y Tejidos Colección
Nota: A pesar de que existen diversas técnicas para la extirpación quirúrgica de la contractura de Dupuytren, el actual estándar de oro es la fasciectomía parcial 15. La mayoría de los pacientes son tratados en el hospital de día de la cirugía.
- Hacer una cirugía con anestesia general o regional de acuerdo con las preferencias del paciente y anestesiólogo de y para las comorbilidades del paciente. Estas consideraciones están más allá del alcance de este documento. Antes de la incisión, toque la piel con un objeto afilado para verificar que la anestesia es satisfactoria. Use un torniquete para facilitar la visualización quirúrgica en un entorno sin sangre.
- Después de preparar de estéril y drapeado, marcar la incisión anticipada con un bolígrafo. Incisión en la piel con un bisturí con una lupa lupa de forma longitudinal or mediante incisiones en zigzag para evitar contracturas adicionales y también para permitir una exposición suficiente.
- El uso de la disección de tijera, liberar a la piel y la capa subcutánea de los subyacentes palmar fascia contratados. Identificar y proteger el paquete neurovascular del dedo porque el cable enfermo puede desplazarlo hacia la línea media. Una vez que el tejido fibrótico (nódulo y / o espinal) se perfila, extirparlo bruscamente y regional (subtotal) utilizando un bisturí. Realice una hemostasia meticulosa bajo control torniquete al final del procedimiento para evitar la formación de hematoma.
- Para cerrar la piel, utilice Z-plastias adicionales para obtener el alargamiento parcial de la piel.
- Para estos estudios utilizan sólo la parte del cable de nódulo fibrótico, la parte más activa y celular de la enfermedad. Haga que el cirujano realice la identificación macroscópica. Los nódulos aislados en la palma de la mano son a menudo precursores o una cuerda, pero casi nunca se resecan, ya que por lo general no causan síntomas.Los que fueron resecados los nódulos que formaban parte de un cordón del dedo contratado. Identificar estos nódulos por la parte gruesa duro de las cuerdas en el handpalm (Figura 1A).
- Una vez que el cirujano extirpa el tejido, inmediatamente transferir utilizando pinzas estériles a un tubo de 50 ml que contenía medio DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S). Mantener el tejido por un máximo de 2 horas en este medio en una caja de hielo húmedo (4 ° C) (por ejemplo, el transporte del tejido desde la sala de operación para las instalaciones de cultivo celular).
- Mantener las muestras en hielo (4 ° C) mientras se prepara para el siguiente paso. Preparación de la cámara de materiales y cultivo celular requiere 10-20 min.
2. Preparación de los instrumentos, medio de cultivo y Cultura Inserciones
Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.
- Preparar 500 ml de DMEM suplementado con 10% de FCS y 1% (P / S) y el filtro sterilize. Calentar inicialmente el medio a 37 ° C.
- Fórceps Autoclave, un par de tijeras de Mayo-curvadas hoja (150-170 mm de longitud) y un par de tijeras Metzenbaum y guardar en un recipiente estéril.
- Bajo flujo laminar, abra una placa de cultivo de 12 pocillos estériles. Coloque un inserto de cultivo (0,45 micras de tamaño de poro, 12 mm de diámetro) en cada pocillo de la placa de 12 pocillos (Figura 1B, panel inferior).
- Llene la placa de 12 pocillos con 600 l de precalentado (37 ° C) los medios de cultivo por pipeteo en el pozo y no directamente sobre la membrana de la inserción. Colocar la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) (Figura 1B, panel superior).
- También puede utilizar una placa de 24 pocillos y añadir 300 l de medio por pocillo. El volumen de medio por pocillo es óptima cuando se forma una capa de menisco entre el líquido y la parte inferior de la inserción de la membrana.
Nota: el medio en la parte inferior del pozo se difunde a través de la membr nitrocelulosaane formar la capa de menisco como se representa en los esquemas de la figura 1B (panel inferior).
- También puede utilizar una placa de 24 pocillos y añadir 300 l de medio por pocillo. El volumen de medio por pocillo es óptima cuando se forma una capa de menisco entre el líquido y la parte inferior de la inserción de la membrana.
3. Tejido Preparación Configuración y ex vivo de Cultivo de Tejidos
Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.
- Transferir la parte nódulo del cable desde el tubo de 50 ml en una placa de Petri de 100 mm y añadir 10 ml de precalentado (37 ° C) medio. Asegúrese de que el tejido está en contacto con el líquido durante todo el procedimiento.
- Retire la capa de grasa perinodular con las tijeras Metzenbaum. Deseche el tejido graso. Con el uso de fórceps y las tijeras curvadas hoja, cortar transversalmente el tejido en trozos más pequeños (espesor máximo de 200 micras).
- Transferir la placa de 12 pocillos de la incubadora en la campana laminar. Compruebe que la membrana de la inserción se ha vuelto transparente (húmedo) y por lo tanto está en contacto con el medio.
- Con unas pinzaslevante con cuidado una parte de tejido tocando la capa exterior (no aplicar tensión en el tejido). Colocar una parte de tejido sobre la membrana del inserto de cultivo celular para que el tejido permanece en la interfase aire-medio. Cultura un máximo de dos partes de tejido en el mismo inserto / pocillo.
- Asegúrese de que el tejido se coloca plana sobre la membrana, en contacto con el medio longitudinal de tal manera que el tejido no flota fuera de la membrana ni está totalmente cubierto por medio. Evite las burbujas de aire.
Nota: En esta etapa, es posible añadir factores de crecimiento o inhibidores de interés para los medios de comunicación; por ejemplo, los compuestos de ensayo (A, B, C, D, E) en repeticiones y / o en curva de concentración. Incluya por lo menos 2 de control (sin tratar) trozos de tejido en condiciones normales de crecimiento para asegurar que el experimento se ha establecido correctamente. Incubar los tejidos durante 3-7 días en una incubadora de cultivo de tejidos. - Infectar el tejido, ya sea con constructo lentiviral o si adenoviral sobreexpresión o derribar experimentos de una necesidad de genes de interés a realizar (Figura 2). Transferir una parte del tejido de la placa de 12 pocillos en una placa de 35 mm con pinzas.
- Utilizar un volumen máximo de 10 l de virus de alto título.
- Realice la inyección bajo un microscopio de disección con una jeringa de insulina cargada con 50 l de PBS que contiene 10 l de la virus seleccionado. Coloque la aguja perpendicular al centro del tejido.
- Lentamente inyectar el contenido de la jeringa. No retraiga la aguja directamente. Al pinchar el tejido, no permita que la aguja pase por el otro lado, pero mantener la aguja dentro del propio tejido (alrededor del centro del tejido).
- Transferir el tejido nuevo en la placa de 12 pocillos, cierre la placa de cultivo y colóquelo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
4. Todo el montaje de inmunofluorescencia tinción y Reconstrucción 3D
Nota: Todos los prolos procedimientos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente. El protocolo para toda la inmunotinción de montaje y de formación de imágenes se describe a continuación es una adaptación de los métodos reportados previamente utilizados para otros tejidos 16-19. Tampones y materiales se describen en la Tabla 1 y la Lista de Materiales.
- Tejidos de transferencia de la placa de cultivo a 2 ml tubos de microcentrífuga que contenían PBS. Lavado 2x por 5 min en una solución de PBS en una plataforma giratoria. Fijar los tejidos en 4% PFA tamponada (1,5 ml de solución por el tejido en 2 ml tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C en una plataforma giratoria.
- Retire PFA y lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos cada uno.
- Deshidratar tejidos por inmersión en una solución de metanol 25% durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria. Aumentar el porcentaje de metanol gradualmente (50%, 75%, 100%) con los tejidos sumergidos en cada solución durante 2 h a RT sobre una plataforma giratoria.
- Tejidos de transferencia en DMSO / solución de metanol (paso permeabilización) durante 3 semanas a 4 ° C,como se ha descrito previamente 18.
Nota: En esta etapa, los tejidos se pueden almacenar a largo plazo en 100% de metanol a -20 ° C. - Continúe con el procedimiento de tinción 16, 17; rehidratar gradualmente los tejidos (75% -50% -25% -0% serie metanol). Realizar cada etapa de rehidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C, con agitación constante.
- Incubar las muestras con anticuerpos primarios en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y 20% DMSO O / N a 4 ° C. Utilice anticuerpos en las siguientes proporciones utilizando las reservas comerciales en PBS: actina de músculo liso anti-α (1: 500, ratón), anti-colágeno tipo I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra).
- Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 4 ° C (cambio de solución de PBS de 3 a 4 veces).
- Diluir anticuerpos secundarios apropiados (Alexa 555 anti-ratón, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 dilución en PBS que contenía 1% (BSA) y 20% DMSO. Incubar O / N a 4 ° C.
- Lavar extensivamente en PBS durante 48 horas a 476; C e incubar con contratinción nuclear, TO-PRO-3 diluido 1: 500 en PBS a la etapa de lavado final.
Nota: TO-PRO-3 es un tinte de ADN emisor de rojo lejano (con una línea de láser de 633 nm de He-Ne) y se combina para formación de imágenes simultánea con otros canales; en este tipo de colágeno caso de E / colágeno tipo III (488 nm), α-actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Transferir los tejidos a una serie metanol (25% -50% -75%) para deshidratar lentamente el tejido; realizar cada etapa de deshidratación durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C con agitación constante.
- Tejidos de transferencia en tubos de polipropileno. Tejidos claros en salicilato de metilo (mango bajo el capó química) 18 o como uso alternativo solución BABB 19. Se incuba a RT con agitación constante hasta que los tejidos se vuelven transparentes. Monte entre un portaobjetos y un cubreobjetos sellada con juego duro medio de montaje (Figura 1C, panel superior).
- Muestras de imagen en un micro confocal invertidoalcance equipado con alta NA 63X y / o 100X objetivos de inmersión en aceite (Figura 1C).
- Limpiar la lente con la solución de limpieza proporcionado por el fabricante microscopio.
- Aplicar una gota de aceite sobre la lente del objetivo. Colocar el portaobjetos con la muestra sobre la platina del microscopio y enfoque en la muestra.
- Establezca las configuraciones en el microscopio en busca de imágenes simultáneas de la fluorescencia de tres canales con líneas de láser de 488 nm, 514 nm y 633 nm.
- Adquirir imágenes individuales XY o varias imágenes de plano focal (Z pila) (Figura 3A). Utilice una mayor anchura de Z pila para realizar la reconstrucción 3D. Para obtener una imagen de alta resolución de usar baja velocidad de exploración, número de exploraciones promedio (≥ 3) y adquirir imágenes de 16 bits de resolución 1024 x 1024 píxeles.
- Analizar las imágenes adquiridas Z pila: primero cambiar el nombre y guardar el archivo de imagen (xyz). Utilizando el programa de software del microscopio confocal, configurar proje máxima intensidadcción de las imágenes Z pila en un 3D reconstruido imagen.
- Seleccione el archivo xyz, en las "Herramientas de proceso", haga clic en "Visualización" y "Proyección 3D". Enter "Máximo" en el método de proyección (o "promedio" si la señal fluorescente está saturado). Para una sola proyección no cambian los ejes X, Y y Z aviones, y aplicar la herramienta de proyección (Figura 3B, r1).
- Utilice las imágenes de pila Z para crear una proyección en 3D con animación (software confocal) para fines de visualización. Seleccione el archivo xyz, en las herramientas de proceso, haga clic en "Visualización" y "Proyección 3D".
- Haga clic en "Crear Película". Introduzca el ángulo de inicio de rotación en grados (por ejemplo, 0 ° como punto de partida de la película, eje Y) y haga clic en "Start Set". Introduzca el ángulo final de giro en grados (eje Y) como punto final de la película (por ejemplo, 180 ° o 3606; para una rotación completa) y haga clic en "End Set".
- Seleccione "máxima" como método de proyección (o "promedio" si la señal fluorescente está saturado). Introduzca el "Number of Frames" para la rotación de la reconstrucción 3D (por ejemplo, 20 rotaciones o superior para reducir la velocidad de rotación). Haga clic en "Aplicar". Exportar la película como archivo visual (por ejemplo, "avi") (Película 1 complementario) o exportar como archivo "tiff" que crea un archivo de imagen para cada ángulo de rotación (Figura 3B; r4 rotación, r10, r18).
5. Combinado de segunda generación armónica (colágeno) y de dos fotones de fluorescencia Emocionado (elastina) Imaging en ex vivo de tejidos durante la Cultura
Nota: Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente.
- Retire las placas transwell de la incubadora y colocar una sola (sin fijar) tiparte DICIÓN en una placa de cultivo celular de 35 mm que contiene 500 l de medio.
- Coloque el tejido de modo que el eje largo es plana en la placa. Mantenga tejido húmedo en todo momento sin embargo, no flotante.
- Coloque objetivo sumergido en agua del microscopio multifotónica directamente en contacto con el tejido (Figura 1C).
- Obtener imágenes con una longitud de onda de excitación de 800 nm y recoger la luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) y 474-532 nm (autofluorescencia, elastina) (Figura 3C). Realizar microscopía de dos fotones en un microscopio confocal vertical equipado con un láser de femtosegundo usando un objetivo de inmersión en agua 20X / 1,0 NA. Confocal Proceso apila con el software del fabricante.
Nota: la excitación con un láser de infrarrojo cercano de moléculas de colágeno de alta crea imágenes de contraste de las estructuras de colágeno nativo en diferentes profundidades.
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Representative Results
El método de la ex vivo, la cultura 3D de tejido conectivo es un conjunto de hasta sistema fácil y robusto para comprender la relación entre ECM y otros componentes de las células que constituyen el tejido DD y potencialmente otros tipos de fibrosis, así. Además, este sistema permite un método fiable para probar los efectos de los compuestos sobre diferentes tipos de células y sus efectos sobre la carga 20 fibrótica.
Los pasos de la colección de material de desecho quirúrgica derivada de la fibrosis de Dupuytren, el montaje de la cámara de cultivo y ejemplos de herramientas de análisis se presentan en la Figura 1. Como se ilustra en la Figura 1, este método proporciona una herramienta experimental para pruebas de drogas pantallas grandes, por ejemplo, compuestos de fármacos antifibróticos, así como el estudio de modelado de ECM en un tiempo real y de manera reproducible. Partes nodulares del cordón fibrótico están igualmente en rodajas y se colocan en placas transwell; cada parte del tejido (100 a 200 micras) se cultiva en la parte superior de la membrana de un inserto de cultivo (0,45 micras de tamaño de poro, diámetro 12 mm). Se añade medio de cultivo a la cámara inferior, permitiendo el contacto con el tejido a través de la membrana. En promedio, 30-40 partes de tejido se pueden derivar de un solo espécimen de resección, que permite la detección a gran escala de drogas; compuestos, pequeñas moléculas o factores de crecimiento. Los experimentos que abordan la concentración y / o el efecto dependiente del tiempo de drogas son factibles.
Como se muestra en la Figura 2, la expresión génica puede ser manipulado (sobreexpresión / derribar) por el uso de adeno / lentivirus inyectados directamente en el tejido. Fluorescently transducción viral etiquetado se realiza en muestras frescas de tejido grueso mediante inyección. El tejido se mantiene en cultivo durante 24 a 48 horas después de la inyección y, posteriormente, se fija, embebido y se seccionó en 0,7 micras cryosections. Por otra parte, para analizar el efecto de diferentes compuestos o condiciones de cultivo la parte del tejidos se fijan y se sometieron a inmunofluorescencia conjunto de montaje como se muestra en la Figura 3. imágenes en 3D de los tejidos gruesos se realiza por microscopía confocal (Figura 3A-B). Otro método es la formación de imágenes en 3D en vivo en tejidos mantenidas en cultivo; la remodelación del colágeno endógeno se estudia en tiempo real en los recién disecados, piezas de tejido no fijado por generación de segundo armónico (SHG) (Figura 3C). El efecto de fármacos potenciales anti-fibróticas también se sigue en partes del mismo tejido en diferentes puntos temporales. Estructuras de colágeno del tejido grueso son imágenes utilizando SHG en un microscopio multifotónica vertical. Durante estas pruebas, las muestras de tejido se colocan en medio y se crean imágenes con un objetivo de inmersión en agua. Después de las imágenes, los tejidos se pueden transferir de nuevo al sistema de cultivo. Los efectos pueden ser estudiados a nivel de entorno celular y extracelular proporcionar una ventaja sobre los ensayos basados en células in vitro. Existen múltiples posibilidades para analisis de efectos biológicos tales como la histología de las secciones de tejido fijadas, inmunofluorescencia toda montaje y 3D de imágenes reconstrucción por microscopía confocal, SHG y de dos fotones de imágenes de fluorescencia excitada de colágeno endógeno y elastina. Algunas de las ventajas de la formación de imágenes SHG son el uso de tejido fresco, no fijo, que no se requiere la preparación de la tinción de anticuerpos y que el mismo tejido se pueden obtener imágenes múltiples veces (curso de tiempo durante condiciones de cultivo). SHG y de dos fotones de imágenes de fluorescencia excitada se ha descrito previamente para el músculo y el tejido conectivo 21-23 y estructura de la pared arterial sin teñir 24, sin embargo, aquí nos informan de una aplicación alternativa para el estudio de la fibrosis de Dupuytren.
Figura 1. Esquema de ex vivo sistema de cultivo de tejidos en 3D. (A) DD contractura de flexión permanente en la mano de un paciente antes de la extirpación quirúrgica. Esta cifra se ha modificado desde el estudio anterior 5. (B) Ejemplo de cultivo ex vivo de configurar. (C) Ejemplos de enfoques experimentales que pueden ser utilizados para el análisis de la deposición de ECM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 2. modulación de prueba de principio ex vivo mediada por virus de la expresión génica en el tejido de todo el montaje. (A) Los núcleos se visualiza con TO-PRO-3 colorante (azul). Bares 75 micras. (B) La visualización directa de la fluorescentetinte DsRed (rojo), después de la inyección con adenovirus que expresan-DsRed. Bares 75 micras. (C) Fusionada imagen (tinción nuclear en azul, DsRed en rojo). Localización citoplasmática de DsRed que indica una entrega adenoviral en las células dentro de 24 hr. Bares 75 micras. (DF) de Lentiviral transducción. (D) Los núcleos se visualiza con TO-PRO-3 colorante (azul). Bares 25 micras. (E) la visualización directa de las buenas prácticas agrarias en secciones de tejido (verde), de la inyección con partículas lenti-GFP. Bares 25 micras. (F) imagen fusionada de D y E que indican la localización intracelular de lenti-GFP. Bares 25 micras (GH) Ejemplo de caída lentivirus mediada contra gen de interés (designado como "A");. (G) Lentivirus llevar secuencia shRNA revueltosse inyectó ex vivo en el tejido. La tinción de inmunofluorescencia para la proteína de interés (designado como "A") se muestra en rojo. Bares 75 micras llevar gen secuencia A-shRNA (H) Lentivirus se inyectó. Ex vivo en el tejido. La tinción de inmunofluorescencia para la proteína "A". Los núcleos se tiñen con TO-PRO-3 tinte. Bares 75 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Reconstrucción 3D de imágenes, generación de segundo armónico y de dos fotones de imágenes de fluorescencia excitada. (A) de imágenes en 3D mediante microscopía confocal. Imágenes individuales (xy) en planos focales a lo largo de diferentes profundidades de tejido (z = 50 a 200 micras). Todo el montaje immutinción nofluorescence; α-lisas myofibroblast marcadores actina de músculo (αSMA, rojos), la tinción nuclear (TO-PRO-3, azul). Bares:. 500 m (B) de la imagen 3D reconstruidos (Z pila 389 micras) de imágenes en bruto, como se indica en el panel A en diferentes rotaciones 3D indicadas como "R1", "R4", "r10", "r18". Bares 500 micras. (C) el contenido de colágeno endógeno modelado por segunda imagen generación armónica (SHG) en partes de tejido fresco, gruesas (panel de la izquierda, verde). Dos fotones de fluorescencia excitada (TPF) de las estructuras de elastina de la MEC fue capturado por microscopía multifotónica (panel central, rojo). Imagen fusionada de colágeno (verde) y la elastina (rojo) (panel derecho). Bares:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementario 1. Representante película 3D reconstrucción de toda tejido montaje de Dupuytren Confocal de imágenes de tejido DD se realizó después de siete días ex vivo la cultura y el procesamiento para la tinción de inmunofluorescencia todo el montaje.; α-lisas myofibroblast marcadores actina de músculo (αSMA, rojos), la tinción nuclear (TO-PRO-3, azul). Barra de escala = 500 micras. Marcos = 20. Z = 389 micras. Haga clic aquí para ver el vídeo.
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | 8,00 g de NaCl (0,137 M) 0,20 g de KCl (2,7 mM) 0,20 g KH 2 PO 4 (1,1 mM) 0,10 g de MgCl 2 · 6H 2 O (0,5 mM) 2,16 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (8,1 mM) 0,10 g de CaCl 2 anhidro (0,9 mM) H 2 O a 1 L |
| Disolver 4 g de paraformaldehído en un matraz que contenía 100 ml tampón fosfato salino (PBS) en la campana de humos, cubrir el matraz. Colocar el matraz en un sistema de calefacción / bloque de agitación y se agita suavemente la solución. Controlar la temperatura de modo que sea llega a un máximo de 65 ° C. Evitar el exceso de calefacción. Una vez que el paraformaldehido se haya disuelto y la solución parece clara, apague el calor pero dejar de agitar. No maneje por razones de seguridad. Deje enfriar. Cuando se enfría, alícuota de la solución y almacenar a largo plazo en -20 ° C congelador o en un refrigerador a 4ºC para obtener el máximo de una semana. | |
| BSA (albúmina de suero bovino), 10% (w / v) | Disolver 10 g de BSA en 100 ml de H 2 O. Filtro esterilizar utilizando un filtro obligatorio de 0,22 micras baja en proteínas. Almacenar a 4 ° C. |
| DMSO / metanol solución de permeabilización (20%) | Mezclar Dimetil sulfóxido conMetanol (1: 4 analogías, volumen total de 100 ml). |
Tabla 1. Las soluciones tampón.
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Discussion
Los pasos más críticos de cultivo de tejido conectivo ex vivo humano son el uso inmediato del tejido después de la extirpación quirúrgica para asegurar la viabilidad; el tejido debe permanecer en solución del medio o solución salina en todo momento; mantener un cultivo estéril; secciones transversales de tejido deben tener un grosor máximo de 200 micras; configurar el sistema de cultivo ex vivo es óptima cuando el tejido está en contacto con el medio, pero no completamente sumergido. Medio debe añadirse sólo en la cámara exterior de la transwell en un pequeño volumen (por ejemplo, 500-600 l por 12 pocillos área de superficie de la placa).
El tejido conectivo derivado de Dupuytren de se enreda en una estructura resistente con alto contenido de proteínas de la MEC tales como colágeno, proteoglicanos, y elastina; debido a estas propiedades y, además, debido a la contractura myofibroblast puede ser un reto para cortar a través del tejido. Es importante la utilización de instrumentos quirúrgicos apropiados; curvada blADED tijeras Mayo para el corte de las piezas más grandes de igual espesor y tijeras quirúrgicas más pequeñas para cortar partes de tejido más pequeñas (por ejemplo, si hay más partes de tejido se requieren placas de uso de 24 pocillos).
Métodos para el estudio de DD son análisis histopatológico de la pieza fibróticas extirpados, o derivación de los fibroblastos primarios. Derivación Móvil desde el material del paciente que se hace es de dos maneras; en uno de los métodos, partes de tejido se cultivan en placas de cultivo de plástico para un número de semanas hasta que no es consecuencia de fibroblastos. El segundo método es el tratamiento enzimático de tejido con colagenasa y tripsina. El primer método es mucho tiempo, las propiedades de fibroblastos se alteran debido a las condiciones de cultivo y hay variabilidad paso dependiente de entre los pasajes de la misma línea celular. El método enzimático es más rápido y que puede ser utilizado para ensayos de clasificación de células, sin embargo, el mantenimiento in vitro de estas células fuera de la ECM innata no refleja la in vivo de 25 (es decir, mecanoregulación y mecanotransducción). La pérdida de tensión en el desmontaje de fibras αSMA en los MFB en corto período de tiempo 26. La abundancia de αSMA en la ex vivo 27, 28. En cuanto a la variabilidad técnica y biológica, nuestro método es reproducible (viabilidad, la red ECM) y menos propensa a la alteración tisular debido a corto tiempo de cultivo. Por ejemplo, el método del crecimiento de fibroblastos requiere varias semanas que puede causar cambios bioquímicos (por ejemplo, la acumulación de mutaciones genéticas, la senescencia replicativa). Sin embargo, las características genéticas específicas del paciente y la variabilidad biológica son per se desafíos en el campo de la investigación DD y no pueden abordarse con cualquiera de los métodos actuales.
Como se muestra en este protocolo, muestras DD fibróticas después de la extirpación quirúrgica son directamente cultivados en el sistema ex vivo 3D y / o broche de congelados. Dependiendo de la pregunta científica, la modificación del tejido es posible mediante la adición de factores de crecimiento, compuestos químicos, virus mediada por la entrega de genes, oligonucleótidos antisentido y miRNAs. Los compuestos se pueden entregar en los medios de comunicación o con microinyecciones locales del tejido en la cámara de cultivo 3D. Después de 3 y hasta 7 días de cultivo del tejido o bien se puede homogeneizar para el aislamiento de células y análisis FACS o el aislamiento de ARN total y proteínas para el análisis de perfil de expresión, así como procesado para el análisis histológico. El estado de expresión de las proteínas fibrosas (αSMA, colágeno de tipo I y II, fibronectina), arquitectura de los tejidos de la parte nódulo de la cuerda y la consistencia de la red fibrosa se evaluó antes y después de los tratamientos. Con el fin de monitorear los reordenamientos ECM durante el cultivo se combinaron los grupos de autoayuda (colágeno) y la fluorescencia excitada imágenes (elastina) de dos fotones.
Los reordenamientos extracelulares pueden ser cuantificados o modelados usando la imagen del software de cuantificación. Estos parámetros dan una indicación de los efectos del fármaco sobre la fibrosis o la Moleclares alteraciones que han sido inducidos durante el cultivo. Arrays ECM Por otra parte también se pueden realizar en rebanadas individuales para generar una mejor visión de los efectos. En general, hemos establecido un sistema robusto que permite el estudio de la fibrosis ex vivo.
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Disclosures
Los autores han presentado una solicitud de patente para la enfermedad de Dupuytren: cultivo de órganos en 3D. # GB1307200. De licencias y contratos de servicios comerciales están disponibles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45 μm pore size, 12 mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | Equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan-Apochromat 20X/1.0 NA water-immersion objective. |
References
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