Introduction
Doença valvar cardíaca é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental; sua prevalência aumenta com a idade e afeta mais de 10% da população de 75 anos ou mais 1. As válvulas da parte sistêmica do coração, as valvas aórtica e mitral, são os mais afetados. Válvula cardíaca doença é caracterizada pela perda da estrutura altamente organizada das válvulas, o que resulta na alteração das propriedades mecânicas 2. A integridade estrutural é, portanto, crucial para a função da válvula.
Os folhetos da válvula são constituídos por células intersticiais valvulares (VIC), células endoteliais valvulares (VEC), e matriz extracelular, o que é altamente organizado num padrão em camadas 3,4. Os VICs são responsáveis pela síntese de ECM, degradação e organização. Fatores que emana da corrente sanguínea, ECs ou residentes no ato ECM nas VICs orquestrando sua função. Além,forças mecânicas agir sobre o folheto durante o ciclo cardíaco, resultando em laminar ou tensão de cisalhamento oscilatório, tensões de compressão ou de tracção que influenciam o comportamento de VICs 5.
A fim de compreender como a estrutura da válvula é regulado, ele deve primeiro ser compreendida como VICs responder ao conjunto diversificado de estímulos experimentadas durante o ciclo cardíaco. Estudos in vitro têm sido muito informativo sobre as características e capacidades das células valvulares. A resposta destas células, in vitro, no entanto, nem sempre podem mimetizar com exactidão a resposta in vivo 6; Por exemplo, a resposta a estímulos de VIC é dependente da presença de células endoteliais e a composição 5 ECM. Além disso, a resposta das células a estímulos valvulares depende da sua localização específica no folheto 7. Além disso a estímulos bioquímicos, o comportamento das células valvulares é determinada por forças mecânicas que actuam ón a válvula 8. Cada região da válvula é submetida a seu próprio conjunto específico de tensões hemodinâmicas. Embora atuais modelos ex vivo têm mostrado que as forças mecânicas são importantes determinantes da estrutura valvular 5, os mecanismos associados ainda não estão claros. Enquanto os modelos in vivo têm fornecido insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento valvular 9,10, insights sobre biologia valvular adulto ainda é indescritível.
Por conseguinte, um modelo ex vivo de fluxo foi desenvolvido em que as válvulas cardíacas podem ser cultivadas na sua posição natural no coração por um período prolongado de tempo 11. Isto tem a vantagem de que as válvulas permanecem na sua configuração natural e os VICs experimentar o mesmo ambiente como in vivo, fazendo com que as respostas a estímulos VICs tão natural quanto possível. Além disso, a cultura das válvulas na sua posição natural no coração facilita a sujeição de cada umregião valvular às tensões hemodinâmicas relevantes. Neste modelo ex vivo, isto é, o sistema de cultura de tecidos em miniatura (MTCS), as válvulas podem ser submetidos a diferentes estímulos bioquímicos e hemodinâmicas, permitindo o estudo do seu papel na remodelação da válvula cardíaca.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes LUMC do animal comitê de ética em pesquisa.
1. Preparação de Instrumentos, Meio de Cultura, e MTCS
Nota: Execute todos os preparativos na capela de fluxo laminar. O MTCS câmara de perfusão, borbulhador e suporte são descritos na Lieber et al., 2010 11.
- Desinfectar os fórceps e micro tesoura com etanol 70%. Prepara-se uma seringa de 5 mL com uma agulha 21G com NaCl estéril de Tyrode Buffer (130 mM, KCl 5,4 mM, HEPES 6,0 mM, 1,2 MgSO 4 mM, 1,2 mM de KH 2 PO 4, glicose 20 mM, 1,5 mM de CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7,2). Prepara-se uma seringa de 5 mL com uma agulha de 21G estéril com solução de KCl (100 mM).
- Preparar 65 ml de meio por coração: DMEM suplementados com 10% de Soro Fetal de Vitela, antibiótico / antimicótico (A / A; 100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina, e 0,25 ug de anfotericina B / ml), insulina-Transferrin-O selénio (STI; 10 ug / ml de insulina, 5,5 ng / ml de transferrina, 6,7 ng / ml de selenito de sódio) e esterilizar filtro.
- Esterilizar a câmara de perfusão e de retenção de bolhas por pulverização com 70% de etanol e seco com uma toalha de papel. Montar o MTCS (Figura 1D), no entanto, inicialmente sem a câmara de perfusão. Posicione a armadilha de bolhas no stand. Use uma bomba de roletes com cabeças de bomba peristáltica fácil de carga.
- Usando tubo flexível de silicone fazer ligações entre o reservatório (tubo de 50 ml) e a bomba, a bomba e a armadilha de bolhas, o borbulhador e reservatório (ver Figura 1D). Adicione a tubagem no interior da incubadora o tempo suficiente para permitir que forma a atingir o equilíbrio de gás com o gás na incubadora através da tubagem de gás permeável de silício (1 M) e o tubo exterior da incubadora tão curto quanto possível.
- Encha o tubo de 50 ml com etanol 70%, ligar a bomba (velocidade de fluxo de cerca de 1 ml / min para permitir a circulação adequada) e deixar o cir etanolcular por 30 min para esterilizar toda a tubulação. Remover o etanol por esvaziamento do reservatório e bombeando o etanol a partir do sistema.
- Encha o tubo de 50 ml com água destilada estéril, ligar a bomba e deixe a água circule durante 30 minutos para se livrar do restante etanol. Remover a água por esvaziamento do reservatório e a bombear a água para fora do sistema.
- Encha o tubo de 50 ml com 45 ml de meio, coloque o suporte na incubadora. Ligue o (velocidade de fluxo de cerca de 1 ml / min) e a bomba faz circular o meio para preencher toda a tubagem, remover todas as bolhas de ar e permitir que a forma para se adaptar à composição do gás na incubadora durante pelo menos 1 h. Manter a incubadora a condições-padrão de cultura de tecidos (5% CO 2 e 37 ° C). Assegure-se que não há bolhas de ar na tubagem.
2. Isolamento de rato coração
- Injectar o mouse com 500 unidades de heparina. Isto irá evitar a coagulação do sangue e permite a remoção de bLood a partir do coração. Após 10 min, anestesiar o rato numa câmara de indução com 4% de isoflurano utilizando um vaporizador de precisão. A anestesia é suficiente quando o mouse não responde aos pés pitada.
- Transferir o rato para uma placa de dissecção e manter a anestesia por meio de uma máscara ligada a um circuito coaxial. Desinfectar a pele do rato com 70% de álcool. Com uma tesoura de abrir a cavidade abdominal para expor a veia cava e diafragma.
- Para expor o coração, fazer incisões laterais a partir da última para a primeira costelas e refletem a caixa torácica sobre a cabeça de rato. Pare a anestesia como mouse não está respirando mais. Observe o coração batendo.
- Inserir a agulha 21G ligada a uma seringa de 5 ml estéril contendo tampão de Tyrode para a veia cava inferior do abdominal para dentro da cavidade torácica (através do diafragma). Certifique-se de que o sangue pode sair da veia cava caudal a partir da inserção da agulha. Perfundir thTampão de Tyrode e suavemente e com uma pressão constante para a veia cava até que o coração perde parcialmente a sua cor vermelha. Nota: o coração permanece a bater, permitindo a remoção do sangue a partir do coração.
- Substituir a agulha com a agulha 21G ligada a uma seringa de 5 ml contendo solução de KCl estéril. Suavemente perfundir a solução de KCl para a veia cava até o coração parar de bater e remover a agulha. Nota: A solução de KCl preserva o coração na fase diastólica relaxada, o que vai permitir uma inserção mais fácil das agulhas de perfusão e do sistema de perfusão coronária.
- Levante ligeiramente o coração usando uma pinça curva e usando uma tesoura dissecar o coração livre do tecido circundante, mas deixar artérias e veias proximais ao coração intactos e anexado ao coração. Transferir o coração para um tubo de 15 ml contendo PBS arrefecido em gelo suplementado com antibiótico / antimicótico (A / D). Armazenar o coração em PBS gelado por até 3 horas.
3. Cannulation dos corações mouse na câmara de perfusão
- Efectuar todos os procedimentos em capela de fluxo laminar. Transferir o coração isolado a partir do tubo de 15 ml a um prato de 10 cm de Petri e adicionar PBS suplementado com A / A.
- Sob um microscópio de dissecação, o uso de tesoura e micro fórceps para remover todo o tecido cardíaco, mas não preservar a aorta ascendente, pelo menos, da bifurcação com a artéria inominada e as veias pulmonares, 2 mm proximal ao coração. Cortar a extremidade da ponta do coração para criar um acesso para o lúmen do ventrículo esquerdo (tipicamente 2 mm). Coloque a câmara de perfusão em câmara de fluxo a sob o microscópio de dissecação.
- Anexar uma seringa de 5 ml com meio à agulha de inserção usando o tubo de silicone. Encher a câmara de perfusão com 20 ml de meio e colocar o coração no estágio de rotação entre as agulhas embotadas 2 na câmara de perfusão (Figura 1). Ajustar a altura da fase de rotação de modo que o coração está posicionada em frente doagulhas.
4. A ligadura para a cultura das valva mitral (ver figura 1)
- Ligadura da aorta com sutura (seda 7.0). Ligadura do apêndice atrial esquerdo com sutura. Insira a agulha (nr. 1 na Figura 1) através da veia pulmonar para o átrio esquerdo e ligar com sutura proximal à sua entrada no átrio esquerdo. Certifique-se de que a agulha não é muito longe para o átrio esquerdo, pois isso iria danificar a válvula mitral.
- Inserir a agulha (nr.2 na Figura 1) com um movimento linear para o ventrículo esquerdo. Transferir o meio a partir da câmara de perfusão para um tubo de 50 ml. Selar a agulha para o miocárdio com cola biocompatível.
- Depois que a cola secar, injetar cuidadosamente em meio coração, ligando uma seringa cheia de médio a agulha nr.1 e verifique se há algum vazamento. Assegurar que as saídas médias de nr.2 agulha eo último sangue restante é perfundido para fora do coração.
5. Ligação para a cultura das Válvula Aórtica (veja a Figura 1)
- Inserir a agulha (nr.1 na Figura 1) na aorta e ligar com sutura. Certifique-se de que a agulha não é muito longe para a aorta como isso iria danificar a válvula aórtica. Inserir a agulha (nr.2 na Figura 1) com um movimento linear para o ventrículo esquerdo. Transferir o meio a partir da câmara de perfusão para um tubo de 50 ml. Selar a agulha para o miocárdio com cola biocompatível.
- Depois que a cola secar, injetar cuidadosamente médio para o coração, ligando uma seringa cheia de médio a agulha nr.2 e verifique se há algum vazamento. Assegurar que as saídas médias de nr.1 agulha eo último sangue restante é perfundido para fora do coração.
6. Coloque Perfusão Secção de suporte
- Encha câmara de perfusão com os 20 ml de meio transferidos. Coloque a junta e tampa na câmara e aperte com lavadora e parafusos.
- Remova os MTCS montados a partir do incubator. Fixe a câmara de perfusão no stand. Conecte o tubo (veja a Figura 1D). Colocar o suporte na incubadora (5% de CO 2 e 37 ° C). Conecte a tubulação à bomba. Ligue a bomba com velocidade de fluxo de cerca de 600 mL / min.
- Certifique-se de que no reservatório e / ou o borbulhador o nível do meio permite que as visualizações da presença do fluxo pela queda das gotas médias de entrada. Após a cultura, o coração é removido do sistema, fixadas e processadas para exame histológico.
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Representative Results
A válvula da aorta (Figura 2) da válvula mitral ou 11 podem ser cultivadas por pelo menos 3 dias. Através da cultura na posição aberta (que representa a posição sistólica para a válvula aórtica diastólica e a posição da válvula mitral para a), as células permanecem viáveis valvulares. Não é observada a morte celular como determinado pela ausência de células de TUNEL positivo (Figura 2H, I) ou clivado expressão da caspase-3 (não mostrado e Lieber et al., 2010 11). A distribuição de colagénio (tal como visualizado por coloração com Trichrome de Masson) é semelhante à condição nativo quando cultivadas em 1% de soro (Figura 2D, E). As válvulas são sensíveis às mudanças nas condições de cultura. Aumentando a quantidade de soro a 10% resulta em folhetos mais espessas (Figura 2C). Além disso, uma região livre de colagénio é observada clara no lado ventricular do folheto perto da fixação à parede da aorta (seta na Figura 2F
Figura 1. O sistema de Cultura de Tecidos Miniature. (A) Na câmara de perfusão do coração está colocando na fase de rotação e ligado com as agulhas embotadas indicados com nr.1 e nr.2. (B) Perfusão câmara é montado sobre o suporte. (C) Desenho esquemático do coração quando a cultura da válvula mitral (esquerda) ou válvula aórtica (à direita). (D) Desenho esquemático da configuração do sistema ex vivo fluxo para a cultura da válvula aórtica. Este valor foi parcialmente modificado a partir do estudo anterior 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.
Figura 2. A análise histológica das válvulas cultivadas a partir de 2 meses de idade ratos. (AC) heamatoxylin e eosina (H & E) tricromo e GI (DF) de Masson) TUNEL coloração de uma válvula aórtica não-cultivadas (A, D, G), uma válvula aórtica cultivadas na presença de 1% de soro (B, E , H) ou 10% de soro (C, F, I), durante 3 dias na MTCS. A válvula cultivadas com 1% de soro parece ser semelhante à válvula de não-cultivadas, ao passo que a válvula de cultura com 10% de soro é mais espessa (C) e tem um padrão alterado de ECM (F). Sem a apoptose é observada nas válvulas (GI). Barra de escala é 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas em cultura das válvulas cardíacas de rato incluem fazer o tempo entre a excisão do coração do rato e a ligação na câmara de perfusão tão curto quanto possível, para assegurar a viabilidade e ligação das agulhas perpendicular às válvulas para assegurar a direcção correcta de fluxo . Além disso, a verificação do fluxo após a ligadura na câmara de perfusão sem forma garante uma inserção correcta e ligadura de agulhas. É essencial para manter uma cultura estéril e evitar bolhas de ar no tubo, o que poderia, potencialmente, ficar preso no coração obstruindo o fluxo.
O volume total de meio utilizado para a perfusão de um coração é de 45 ml (note que a forma que é perfundida através do coração não está em contacto com os 20 mL de meio na câmara de perfusão). Para a adição de vírus, por exemplo um volume mais pequeno pode ser preferível. Temporalmente o reservatório (e parte do tubo) podem ser removidos do circuito leaving 5-7 ml no sistema para permitir a infecção da válvula.
A ausência de batimento do coração poderia ser considerado uma limitação. No entanto, permite a criação de uma condição experimental na qual todos os estímulos que trabalham no folheto pode ser mantida constante. Isto dá a oportunidade única para estudar o efeito de uma única modificação. Quando são necessárias válvulas que se deslocam, um fluxo pulsátil, pode ser criado.
Para estudar a biologia valvular e o papel dos estímulos moleculares, celulares e mecânicas da válvula, as modificações podem ser facilmente feitos para o sistema de cultura. Modificação molecular pode ser conseguido através da adição de factores de crescimento, compostos químicos e vírus medeiam a entrega do gene 11 do meio de perfusão. Um ou vários tipos de células pode ser administrada ao meio de perfusão para examinar a influência destas células de biologia valvular ou a sua contribuição para a válvula. A influência do estresse oxidativo ou hipóxia pode serestudado através da alteração da pressão do oxigénio, no meio de cultura. As tensões hemodinâmicas da válvula pode ser variada, alterando a velocidade do fluxo, direcção do fluxo, o fluxo de pulsatilidade e a viscosidade. A morfologia geral podem ser examinados (Figura 2B, C) por H & E, a coloração histoquímica e imunofluorescência. Além disso, a composição e organização da ECM, o fenótipo, a proliferação e a viabilidade das células valvular e a activação de vias de sinalização fornecer informações sobre os efeitos da variação destas condições. Ratinhos geneticamente modificados podem ser usados para rastrear as células endoteliais, usando ratinhos repórter endoteliais (usando o Tie2-Cre e floxed ratinhos repórter) indicando a presença de células endoteliais-se mesenquimais transformação ou ratinhos com perda ou ganho de função de vias específicas de sinalização. No geral, o sistema aqui apresentado é uma ferramenta útil para o estudo da biologia valvular cardíaca.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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