Introduction
심장 판막 질환은 서구 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인이다 그 유병률은 연령에 따라 증가하며 75년 인구의 10 % 이상 및 1 이전에 영향을 미친다. 마음의 전신 부분의 밸브는, 대동맥 및 승모판 밸브는 주로 영향을받습니다. 심장 판막 질환 (2)의 기계적 특성 변화를 초래 밸브의 고도로 조직화 구조의 손실을 특징으로한다. 구조적 완전성은 밸브의 기능에 따라서 중요하다.
밸브의 전단지는 판막 간질 세포 (VIC), 판막 내피 세포 (VEC), 고도로 계층화 된 패턴 3,4으로 구성되어 세포 외 매트릭스로 구성되어있다. VIC를은 전자 재료 합성, 분해 및 조직에 대한 책임이 있습니다. 요인은 혈액, 내장 컴퓨터에서 나오는 또는 그 기능을 조율 VIC를에 ECM 행위에 거주. 또한,기계적 힘은 층류 또는 진동형 전단 응력, VIC를도 5의 동작에 영향을주는 압축 또는 인장 응력을 초래 심장주기 동안 전단에 작용.
밸브의 구조를 조절하는 방법을 이해하기 위해서는, 먼저 VIC를가 심장 사이클 동안 경험 한 자극의 다양한 세트에 응답하는 방법을 이해하여야한다. 시험 관내 연구 판막 세포의 특성 및 능력에 대한 매우 유익한왔다. 시험관 내에서 이들 세포의 반응은, 그러나 항상 정확하게 생체 반응 6을 흉내낼 수있다 예를 들면, 자극에 VIC의 반응의 EC의 존재 및 ECM의 조성 5에 따라 달라진다. 더욱이, 자극 판막 세포의 반응은 전단 7에 특정 위치에 달려있다. 생화학 적 자극에 더하여, 판막 셀의 동작은 O 작용 기계적 힘에 의해 결정된다N 밸브 (8). 밸브의 각 지역은 혈역학 적 스트레스의 고유의 세트 실시한다. 현재 생체 모델은 기계적인 힘이 판막의 구조 (5)의 중요한 결정 요인임을 보여 주었다 있지만, 관련 메커니즘은 아직 불분명하다. 생체 내 모델은 판막 개발 9,10의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 있지만, 성인 판막 생물학에 대한 통찰력은 여전히 애매하다.
따라서, 생체 외 유동 모델되는 심장 밸브는 11 시간의 연장 된 기간 동안 심장에 자연스러운 위치에서 배양 될 수 개발되었다. 이는 밸브가 구성 천연 유지와 VIC를 최대한 자연스러운 VIC를 자극에 반응을 생체 내와 같은 환경을 경험할 수있는 장점을 갖는다. 또한, 마음에 그들의 자연적인 위치에있는 밸브의 문화는 각 쓰는 용이관련 혈역학 적 스트레스에 판막 지역. 즉,이 생체 모델에서, 소형 조직 배양 시스템 (MTCS)는, 밸브는 심장 밸브 리모델링에서의 역할의 조사를 허용하는 다른 생화학 적 및 혈역학 적 자극에 노출 될 수있다.
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Protocol
이 프로토콜은 동물 연구 윤리위원회의 LUMC 지침을 따른다.
악기 1. 준비, 문화 매체, 및 MTCS
참고 : 층류 후드에있는 모든 준비를 수행합니다. MTCS 관류 실, 버블 트랩 및 스탠드 리버 등. 2010 년 (11)에 설명되어 있습니다.
- 70 % 에탄올로 포셉 및 마이크로 가위를 소독. 멸균 타이로드의 버퍼 (130 mM의 염화나트륨, 5.4 밀리미터의 KCl, 6.0 mM의 헤 페스, 1.2 mM의 황산, 1.2 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비 mM의 KH 2 PO 4, 20 mM의 포도당, 1.5 mM의 염화칼슘 2 · 2H 2 O, 의 pH = 7.2). 무균의 KCl 용액 (100 mM의)와 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비합니다.
- 65 심장 당 매체 ml의 준비 : (A /; 페니실린의 100 단위, 100 스트렙토 마이신의 μg의, 및 암포 테리 신 B의 0.25 UG / ㎖) DMEM 10 % 태아 송아지 혈청, 안티 곰팡이 / 항생제로 보충을, 인슐린 Transferrin-셀레늄 (ITS / ml의 인슐린 10 μg의 5.5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 6.7 NG / ㎖ 셀렌 산 나트륨) 및 필터 소독.
- 70 % 에탄올 및 종이 타월 건조와 함께 분사하여 관류 챔버와 버블 트랩을 소독. 초기 관류 챔버없이 그러나 MTCS (도 1D)을 조립한다. 스탠드에 거품 트랩을 배치합니다. 쉬운로드 펌프 헤드와 연동 롤러 펌프를 사용합니다.
- 실리콘 튜브는 저수지 (50 ML 튜브) 및 펌프, 펌프와 버블 트랩 버블 트랩과 저수지 사이의 연결 (그림 1D 참조)를 만들어 사용. 매체는 가스 투과성 실리콘 호스 (1m)과 가능한 한 짧게 인큐베이터 외부 튜브를 통해 가스 배양기에서 가스와 평형에 도달 할 수 있도록 충분한 시간 동안 인큐베이터 안에 튜브를 만든다.
- (적절한 순환을 허용 / 1 ml의 주위 분의 흐름 속도를) 펌프를 켜, 70 % 에탄올로 50 ML 튜브를 입력하고 에탄올 CIR하자모든 튜브를 살균 30 분 동안 culate. 탱크를 비우고 시스템에서 에탄올을 펌핑하여 에탄올을 제거합니다.
- 멸균 증류수로 50 ML 튜브를 입력 펌프를 켜고 30 분 동안 물 순환 에탄올 나머지 없애 보자. 탱크를 비우고 시스템에서 물을 펌핑하여 물을 제거합니다.
- 매체의 45 mL를 50 ml의 튜브를 작성, 인큐베이터에있는 스탠드를 넣어. 펌프 (1 ml / 분의 주위의 흐름 속도)를 켜고 모든 튜브를 채우기 위해 매체를 순환, 모든 기포를 제거하고 배지는 적어도 1 시간 동안 배양기에서 가스 조성에 적응하도록 허용한다. 표준 조직 배양 조건 (5 % CO 2, 37 ℃로)에서 인큐베이터를 유지한다. 기포가 튜브에 존재하지 않는 것을 확인합니다.
마우스 심장의 2. 분리
- 헤파린 500 단위와 마우스를 주입한다. 이는 응고로부터 혈액을 방지하고 (B)의 제거를 허용 할 것이다마음에서들 (100d). 10 분 후, 정밀 증발기를 이용하여 4 % 이소 플루 란 유도 챔버에 마우스를 마취. 마우스가 발가락 핀치에 응답하지 않는 경우 마취는 충분하다.
- 해부 보드에 마우스를 전송하고, 동축 회로에 접속 보호구 통해 마취를 유지한다. 70 % 알코올로 마우스의 모피를 소독. 가위 복강을 열고 사용하면 대정맥과 다이어프램을 노출.
- 심장을 노출 마지막에서 첫 번째 갈비뼈에 시작 횡 절개를하고 마우스의 머리 흉부 케이지를 반영합니다. 마우스가 더 이상 숨을 쉬지으로 마취를 중지합니다. 심장 박동을 관찰한다.
- (다이아 프램을 통해) 흉강으로 복부에서 하대 정맥에 살균 타이로드의 버퍼를 포함하는 5 ML의 주사기에 부착 된 21G 바늘을 삽입합니다. 혈액이 바늘 삽입의 대정맥에 꼬리를 종료 할 수 있는지 확인합니다. 제 관류전자 타이로드의 버퍼 부드럽게과 대정맥에 일정한 압력으로 심장이 부분적으로 붉은 색을 잃을 때까지. 참고 : 심장은 심장에서 혈액의 제거를 허용 치는 남아있다.
- 무균의 KCl 솔루션을 포함하는 5 ML의 주사기에 부착 된 21G 바늘과 바늘을 교체합니다. 조심스럽게 심장이 박동을 멈출 때까지 대정맥에의 KCl 용액을 관류하고 바늘을 제거합니다. 참고 : KCl을 솔루션은 관상 시스템의 쉽게 관류 바늘의 삽입 및 관류를 허용 편안한 확장기의 마음을 유지합니다.
- 약간 곡선 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 사용하는 가위는 심장 손상과 심장에 부착하는 근위부 동맥과 정맥을 주변 조직에서 무료로 심장을 해부 그러나 둡니다. 얼음처럼 차가운 PBS는 항진균제 / 항생제 (/)로 보충이 포함 된 15 ML 튜브에 마음을 전송합니다. 최대 3 시간 동안 얼음처럼 차가운 PBS의 마음을 보관합니다.
3. Cannulatio관류 상공 회의소에서 마우스 마음의 N
- 층류 후드의 모든 절차를 수행합니다. 10cm 페트리 접시에 15 ML 튜브에서 격리하는 마음을 전송하고 추가 PBS는 A / 보충.
- 해부 현미경, 모든 비 심장 조직을 제거하는 미세 가위와 집게를 사용하지만 상행 대동맥을 보존 마음에 팔 머리 동맥과 폐동맥 혈관, 2mm의 기부와 최소한 분기에. 좌심실 내강 (일반적으로 2mm)에 대한 액세스를 만드는 마음의 정점의 끝을 잘라. 해부 현미경 흐름 후드에서 재관류 챔버를 놓습니다.
- 실리콘 튜브를 사용하여 삽입 바늘 매체 5 ML의 주사기를 연결합니다. 20 ㎖ 매체와 관류 챔버를 입력하고 관류 챔버에서 2 무딘 바늘 (그림 1) 사이에 회전 무대에서 마음을했습니다. 심장이 앞에 위치하도록 회전 스테이지의 높이를 조절바늘.
승모판을 배양 4. 결찰 (그림 1 참조)
- 봉합사 (실크 7.0)과 대동맥을 결찰. 봉합 좌심방을 결찰. 좌심방에 폐정맥을 통해 (그림 1. 1 NR) 바늘을 삽입하고 좌심방에서 해당 항목에 봉합 근위부와 결찰. 이 승모판 막에 손상을 하듯이 바늘이 좌심방으로 너무 멀리 있지 않은지 확인하십시오.
- 좌심실로 직선 운동으로 바늘 (그림 1 nr.2)를 삽입합니다. 50 ㎖ 튜브에 관류 챔버로부터 전송 매체. 생체 접착제와 심근에 바늘을 밀봉합니다.
- 접착제가 건조 후, 신중하게 nr.1 바늘과 누출이 있는지 확인하기 위해 매체 채워진 주사기를 연결하여 마음에 매체를 주입. 바늘 nr.2 마지막 남은 혈액이 심장에서 관류되어에서 해당 매체 종료를 확인합니다.
5. 리대동맥 판막을 배양 gation (그림 1 참조)
- 대동맥의 바늘 (그림 1 nr.1)를 삽입하고 봉합 결찰. 이 대동맥 판막을 손상하는 것처럼 바늘이 대동맥으로 너무 멀리 있지 않은지 확인하십시오. 좌심실로 직선 운동으로 바늘 (그림 1 nr.2)를 삽입합니다. 50 ㎖ 튜브에 관류 챔버로부터 전송 매체. 생체 접착제와 심근에 바늘을 밀봉합니다.
- 접착제가 건조 후, 신중하게 nr.2 바늘과 누출이 있는지 확인하기 위해 매체 채워진 주사기를 연결하여 마음에 매체를 주입. 바늘 nr.1 마지막 남은 혈액이 심장에서 관류되어에서 해당 매체 종료를 확인합니다.
스탠드에 6. 관류 상공 회의소
- 매체를 옮겨 20 mL를 관류 챔버를 입력합니다. 챔버에 가스켓 및 뚜껑을 놓고 세탁기와 나사로 조입니다.
- incuba에서 조립 MTCS 제거터. 스탠드에 재관류 챔버를 연결합니다. 튜브를 연결합니다 (그림 1D 참조). 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ℃로)에 스탠드를 놓습니다. 펌프에 튜브를 연결합니다. 600 μL / 분 주위에 흐름 속도와 펌프의 전원을 켭니다.
- 저장 및 / 또는 기포 트랩 매질의 레벨이 수신 매체 방울의 하강에 의해 흐름의 존재의 시각화를 허용하는지 확인. 배양 후, 심장, 시스템으로부터 제거 고정 조직 학적 검사를 위해 처리된다.
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Representative Results
대동맥 판막 (그림 2) 또는 승모판 막 (11)은 최소 3 일 동안 배양 할 수있다. (대동맥판과 승모판 대한 확장기의 총수에 대한 수축기 위치를 나타낸다)가 개방 위치에서 배양함으로써, 판막 세포 생존 유지. TUNEL 양성 세포 (도 2H, I) 또는 절단 된 카스파 제 -3 발현의 부재에 의해 결정된 어떠한 세포 사멸이 관찰되지 않는 (도시되지 리버 외., 2010 (11)). (AS의 메이슨 트리 크롬 염색으로 시각화)의 콜라겐 분포는 1 % 혈청 (도 2D, E)에서 배양 기본 조건과 유사하다. 밸브는 배양 조건의 변화에 응답한다. 두꺼운 전단에서 10 %의 결과 (도 2c)에 혈청의 양을 증가시킨다. 또한, 투명한 콜라겐없는 영역이 대동맥 벽에 부착 근처 전단지의 심실 측면에서 관찰된다 (그림 2 층에 화살표
그림 1. 소형 조직 배양 시스템. 마음이 nr.1과 nr.2로 표시 무딘 바늘 회전 무대 결찰에 누워있다 관류 실에서 (A). (B) 관류 챔버 스탠드에 장착된다. (C) 마음의 개략도 승모판 (왼쪽) 또는 대동맥판 (오른쪽). (D) 대동맥판 배양 용 생체 유동 시스템의 셋업의 개략도를 배양 할 때. 이 그림이 부분적으로 선행 연구 (11)에서 수정되었습니다에게. 더 큰 버전 O를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림 F.
2 개월 쥐에서 배양 밸브 그림 2. 조직 학적 분석. (AC) heamatoxylin 실린 및 에오신 (H & E) (DF) 메이슨의 트리 크롬 염색 및 GI) 비 배양 대동맥 판막의 TUNEL 염색 (A, D, G), 1 % 혈청 (B, E의 존재하에 배양 된 대동맥판 , H) 또는 MTCS 3 일 동안 10 % 혈청 (C, F, I). 10 % 혈청 배양 밸브가 두꺼운 (C)이고 변화된 ECM 패턴 (F)이있는 반면, 1 % 혈청 배양 밸브는, 비 배양 밸브 유사한 나타난다. 어떤 세포 사멸은 밸브 (GI)에서 관찰되지 않는다. 스케일 바는 100 음입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심장 마우스 밸브를 배양에서 중요한 단계는 흐름의 적절한 방향을 보장하기 위해 마우스에서 심장 절제 밸브에 수직 바늘의 생존과 라이 게이션을 위해 가능한 한 짧은 관류 챔버에서 결찰 사이의 시간을 포함 . 또한, 매체없이 관류 챔버에서 결찰 후 흐름을 확인하는 것은 적절한 삽입 및 바늘의 결찰을 보장합니다. 그것은 멸균 문화를 유지하고 잠재적으로 흐름을 방해 마음에 갇혀 얻을 수있는 튜브에 공기 방울을 방지하는 것이 중요합니다.
심장의 재관류에 사용되는 매체의 총 부피가 45 ml 인 것을 (심장을 통해 관류 매체 관류 챔버에서 매질의 20 ㎖에 접촉하지 않는다). 예는 작은 볼륨에 대한 바이러스의 추가가 바람직 할 수있다. 일시 저장조 (및 배관의 일부) 회로 (L)로부터 제거 될 수있다시스템 5-7 mL로 eaving 것은 밸브의 감염을 허용한다.
심장의 박동의 부재는 제한이 고려 될 수있다. 그러나, 전단 작업 모든 자극이 일정하게 유지 될 수있는 실험 조건을 만들 수있다. 이것은 하나의 변경의 효과를 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 밸브 이동이 필요한 경우, 맥동 유동이 생성 될 수있다.
판막 생물학 및 밸브, 분자 세포 및 기계적 자극의 역할을 연구하기 위해, 변형을 용이하게 배양 시스템으로 이루어질 수있다. 분자 변형은 관류 매체 유전자 전달 (11)을 매개 성장 인자, 화학적 화합물과 바이러스의 첨가에 의해 달성 될 수있다. 하나 또는 다수의 세포 유형은 판막 생물학 또는 밸브에 대한 기여도에 이들 세포의 영향을 조사하기 위해 관류 매질로 투여 될 수있다. 산화 스트레스 또는 저산소증의 영향이있을 수있다배지 내의 산소 압력을 변화시켜 보았다. 밸브 혈역학 응력 유속, 흐름 방향, 유량 박동 및 점도를 변화시킴으로써 변화 될 수있다. 전체적인 형태는 H & E, 조직 화학적 및 면역 형광 염색 (그림 2B, C)를 검사 할 수 있습니다. 또한 ECM, 표현형, 증식과 생존 판막 세포와 신호 전달 경로의 활성화의 조직과 구성은 이러한 조건을 변화의 영향에 대한 통찰력을 제공합니다. 유전자 변형 마우스는 내피 리포터 생쥐를 사용하여 내피 세포를 추적하는 데 사용 (Tie2의-Cre 호텔을 사용하여 리포터 생쥐 floxed) 내피 투 간엽 변형 또는 손실 또는 특정 신호 전달 경로의 함수의 이득을 갖는 마우스의 존재를 나타내는 일 수있다. 전반적으로, 여기에 제시된 시스템은 심장 판막 생물학 연구를위한 유용한 도구입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
