Introduction
Maladie de la valvule cardiaque est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde occidental; sa prévalence augmente avec l'âge et elle affecte plus de 10% de la population de 75 ans et plus 1. Les vannes de la partie systémique du cœur, les valves aortique et mitrale, sont principalement touchés. Coeur maladie de soupape est caractérisé par la perte de la structure hautement organisée des soupapes, ce qui entraîne la modification des propriétés mécaniques 2. L'intégrité de la structure est donc essentiel pour le fonctionnement de la soupape.
Les feuillets de la valvule sont constitués de cellules interstitielles valvulaires (CIV), les cellules endothéliales valvulaires (CVE), et la matrice extracellulaire, qui est hautement organisée selon un motif en couches 3,4. Les CIV sont responsables de la synthèse de l'ECM, de la dégradation et de l'organisation. Facteurs émanant de la circulation sanguine, ECS ou résidant dans l'acte d'ECM sur les CIV orchestrant sa fonction. De plus,forces mécaniques agissent sur la valve pendant le cycle cardiaque en résultant ou laminaire oscillatoire contrainte de cisaillement, contraintes de compression ou de traction qui influent sur le comportement des 5 CIE.
Afin de comprendre comment la structure de la vanne est réglée, il faut d'abord comprendre comment CIV répondent à l'ensemble diversifié de stimuli vécus pendant le cycle cardiaque. Des études in vitro ont été très instructif sur les caractéristiques et les capacités des cellules valvulaires. La réponse de ces cellules in vitro, cependant, peut ne pas toujours reproduire avec précision la réponse in vivo 6; par exemple, la réponse à des stimuli de VIC est dépendante de la présence d'EC et la composition 5 de l'ECM. En outre, la réponse des cellules à des stimuli valvulaires dépend de leur emplacement spécifique dans la notice 7. En plus des stimuli biochimiques, le comportement des cellules valvulaires est déterminée par des forces mécaniques agissant on la vanne 8. Chaque région de la soupape est soumis à son propre ensemble spécifique de contraintes hémodynamiques. Bien que les modèles actuels ex vivo ont montré que les forces mécaniques sont des déterminants importants de la structure valvulaire 5, les mécanismes associés sont encore peu claires. Alors que les modèles in vivo ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents développement valvulaire 9,10, un aperçu de la biologie valvulaire adulte est toujours insaisissable.
Par conséquent, un modèle ex vivo de l'écoulement est développé, dans lequel les valves cardiaques peuvent être cultivées dans leur position naturelle dans le coeur pendant une période de temps prolongée 11. Cela présente l'avantage que les vannes restent dans leur configuration naturelle et les CIV éprouvent le même environnement que in vivo, ce qui rend les réponses des CIV à des stimuli aussi naturel que possible. En outre, la culture des soupapes dans leur position naturelle au coeur facilite la soumission de chaquerégion valvulaire aux contraintes hémodynamiques pertinents. Dans ce modèle ex vivo, à savoir, le système de culture de tissu miniature (MTCS), les soupapes peut être soumis à différents stimuli biochimiques et hémodynamiques permettant l'investigation de leur rôle dans le remodelage cardiaque de la vanne.
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Protocol
Ce protocole suit les directives LUMC de comité d'éthique de la recherche de l'animal.
1. Préparation des instruments, milieu de culture, et MTCS
Remarque: Effectuez toutes les préparations dans la hotte à flux laminaire. La chambre de perfusion MTCS, piège à bulles et un support sont décrits dans Lieber et al., 2010 11.
- Désinfecter les pinces et ciseaux micro avec 70% d'éthanol. Préparer une seringue de 5 ml avec une aiguille 21G avec du tampon (130 mM de NaCl stérile de Tyrode mM, KCl 5,4 mM, Hepes 6,0, 1,2 mM de MgSO 4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de glucose, 1,5 mM de CaCl 2, 2H 2 O, pH = 7,2). Préparer une seringue de 5 ml avec une aiguille 21G avec une solution stérile de KCl (100 mM).
- Préparer 65 ml de milieu par du DMEM supplémenté cœur: avec 10% de sérum de veau foetal, des antibiotiques / antimycosiques (A / A, 100 unités de pénicilline, 100 ug de streptomycine, et 0,25 pg d'amphotéricine B / ml), Insuline-transferrineLe sélénium (STI; 10 pg / ml d'insuline, 5,5 pg / ml de transferrine, 6,7 ng / ml de sélénite de sodium) et stériliser par filtration.
- Stériliser la chambre de perfusion et de piège à bulles par pulvérisation avec 70% d'éthanol et sécher avec une serviette de papier. Assemblez le MTCS (figure 1D), cependant, d'abord sans la chambre de perfusion. Placer le piège à bulles sur le stand. Utilisez une pompe péristaltique à rouleaux avec Easy-charge têtes de pompe.
- En utilisant un tube de silicium faire des liens entre le réservoir (de tube de 50 ml) et de la pompe, la pompe et le piège à bulles, le piège à bulles et le réservoir (voir figure 1D). Ajouter le tube intérieur de l'incubateur suffisamment longue pour permettre d'atteindre l'équilibre moyen de gaz avec le gaz dans l'incubateur à travers le tube perméable aux gaz de silicium (1 m) et le tube extérieur de l'incubateur le plus court possible.
- Remplir le tube de 50 ml avec 70% d'éthanol, tourner sur la pompe (vitesse d'écoulement d'environ 1 ml / min pour permettre une bonne circulation) et de laisser le CIR de l'éthanolculer pendant 30 min à stériliser tous les tubes. Éliminer l'éthanol en vidant le réservoir et le pompage de l'éthanol à partir du système.
- Remplir le tube de 50 ml avec de l'eau distillée stérile, tourner sur la pompe et laissez circuler l'eau pendant 30 min pour se débarrasser de l'éthanol restant. Éliminer l'eau en vidant le réservoir et le pompage de l'eau du système.
- Remplir le tube de 50 ml avec 45 ml de milieu, mettre le pied dans l'incubateur. Allumez le (la vitesse d'écoulement autour de 1 ml / min) de la pompe et faire circuler le moyen de remplir tous les tuyaux, enlever toutes les bulles d'air et laisser le moyen d'adapter la composition du gaz dans l'incubateur pendant au moins 1 h. Maintenir l'incubateur dans des conditions de culture de tissus standard (5% de CO 2 et 37 ° C). Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes dans le tube.
2. Isolement de coeur de souris
- Injecter la souris avec 500 unités d'héparine. Cela permettra d'éviter la coagulation du sang et permet la suppression de blood du cœur. Après 10 min, anesthésier les souris dans une chambre d'induction avec 4% d'isoflurane l'aide d'un vaporisateur de précision. L'anesthésie est suffisante lorsque la souris ne répond pas au pincement de l'orteil.
- Transférer la souris pour un conseil de dissection et maintenir une anesthésie au moyen d'un masque relié à un circuit coaxial. Désinfectez la fourrure de la souris avec 70% d'alcool. Utilisation de ciseaux ouvrir la cavité abdominale pour exposer la veine cave et le diaphragme.
- Pour exposer le coeur, faire des incisions latérales à partir de la dernière à la première côtes et refléter la cage thoracique sur la tête de la souris. Arrêtez l'anesthésie que la souris ne soit pas plus respire. Observez le battement de coeur.
- Insérer l'aiguille 21G fixée à une seringue de 5 ml contenant du tampon de Tyrode stérile dans la veine cave inférieure de l'abdomen dans la cavité thoracique (à travers la membrane). Assurez-vous que le sang puisse sortir de la caudale de la veine cave de l'insertion de l'aiguille. Perfuser etampon de Tyrode e en douceur et avec une pression constante dans la veine cave jusqu'à ce que le cœur perd partiellement sa couleur rouge. Remarque: Le cœur battant reste permettant l'élimination du sang du cœur.
- Remplacer l'aiguille avec l'aiguille de 21G fixée à une seringue de 5 ml contenant une solution stérile de KCl. Perfuser doucement la solution de KCl dans la veine cave jusqu'à ce que le cœur cesse de battre et enlever l'aiguille. Remarque: La solution de KCl conserve le coeur dans la phase diastolique détendu, ce qui permettra l'insertion facile des aiguilles de perfusion et le système de perfusion coronaire.
- Soulever légèrement le cœur en utilisant des pinces courbes et l'aide de ciseaux disséquer le cœur libre du tissu environnant mais laissent artères et les veines proximales au cœur intact et fixée au cœur. Transférer le coeur dans un tube de 15 ml contenant du PBS glacé additionné de l'antibiotique / antimycotique (A / A). Conservez le cœur dans PBS glacé jusqu'à 3 h.
3. Cannulation des coeurs de la souris dans la Chambre Perfusion
- Effectuez toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire. Transférer le coeur isolé du tube de 15 ml à une boîte de 10 cm de Pétri et ajouter PBS complété avec A / A.
- Sous un microscope de dissection, utilisez le micro ciseaux et des pinces pour enlever tous les tissus non cardiaque, mais de préserver l'aorte ascendante au moins la bifurcation avec l'artère brachiocéphalique et les veines pulmonaires, 2 mm en amont vers le cœur. Couper le bout de la pointe du cœur pour créer l'accès à la lumière du ventricule gauche (généralement 2 mm). Placer la chambre de perfusion dans la hotte à flux sous le microscope à dissection.
- Attacher une seringue de 5 ml avec du milieu de l'aiguille d'insertion à l'aide du tube de silicone. Remplir la chambre de perfusion avec 20 ml de milieu et de mettre le coeur sur la scène de rotation entre les 2 aiguilles émoussées dans la chambre de perfusion (figure 1). Réglez la hauteur de l'étage de rotation de sorte que le coeur est positionné en face de laaiguilles.
4. La ligature pour la culture de la valve mitrale (voir Figure 1)
- Ligaturer l'aorte avec une suture (soie 7,0). Ligaturer l'appendice auriculaire gauche avec suture. Insérer l'aiguille (nr. 1 sur la figure 1) à travers la veine pulmonaire dans l'atrium gauche et ligaturer avec suture proximale à son entrée dans l'oreillette gauche. Assurez-vous que l'aiguille est pas trop loin dans l'oreillette gauche, comme cela endommagerait la valve mitrale.
- Insérer l'aiguille (nr.2 sur la figure 1) avec un mouvement linéaire dans le ventricule gauche. Transférer le milieu de la chambre de perfusion à un tube de 50 ml. Sceller l'aiguille vers le myocarde avec de la colle biocompatible.
- Après séchage de la colle, injecter attentivement moyen dans le cœur en connectant une seringue remplie de moyen à l'aiguille nr.1 et vérifier si il ya une fuite. Veiller à ce que les sorties moyennes de nr.2 de l'aiguille et le dernier reste du sang est perfusé sur le cœur.
5. Ligation pour la culture de la valve aortique (voir Figure 1)
- Insérer l'aiguille (numéro 1 sur la figure 1) dans l'aorte et ligaturer avec suture. Assurez-vous que l'aiguille est pas trop loin dans l'aorte, car cela nuirait à la valve aortique. Insérer l'aiguille (nr.2 sur la figure 1) avec un mouvement linéaire dans le ventricule gauche. Transférer le milieu de la chambre de perfusion à un tube de 50 ml. Sceller l'aiguille vers le myocarde avec de la colle biocompatible.
- Après séchage de la colle, injecter attentivement milieu dans le coeur en connectant une seringue remplie de moyen à l'aiguille nr.2 et vérifier si il ya une fuite. Veiller à ce que les sorties moyennes de nr.1 de l'aiguille et le dernier reste du sang est perfusé sur le cœur.
6. Placez Chambre perfusion sur le Stand
- Remplissez chambre de perfusion avec les 20 ml de milieu transférés. Placez le joint et le couvercle sur la chambre et serrer avec la rondelle et vis.
- Retirez les MTCS assemblés à partir de l'incubaTor. Fixez la chambre de perfusion sur le stand. Connectez le tuyau (voir figure 1D). Placer le support dans l'incubateur (5% de CO 2 et 37 ° C). Connectez le tuyau à la pompe. Tournez sur la pompe à la vitesse de l'écoulement autour de 600 pi / min.
- Assurez-vous que dans le réservoir et / ou le piège à bulles au niveau du milieu permet les visualisations de la présence de l'écoulement par la chute des gouttes moyennes entrants. Après culture, le cœur est éliminée du système, fixées et traitées pour l'examen histologique.
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Representative Results
La valve aortique (figure 2) ou la valvule mitrale 11 peuvent être cultivées pendant au moins 3 jours. Par la mise en culture dans la position ouverte (qui représente la position systolique pour la valve aortique diastolique et la position de la valve mitrale), les cellules restent viables valvulaires. Aucune mort cellulaire est observée comme déterminé par l'absence de cellules TUNEL-positives (figure 2H, I) ou de la caspase-3 clivée expression (non représenté et Lieber et al., 2010 11). La distribution de collagène (comme visualisé par coloration au trichrome de Masson) est similaire à l'état natif lorsqu'il est cultivé dans 1% de sérum (figure 2D, E). Les vannes sont sensibles à l'évolution des conditions de culture. L'augmentation de la quantité de sérum à 10% des résultats dans des tracts épais (figure 2C). En outre, une région exempte de collagène-claire est observée sur le côté ventriculaire du dépliant près de la fixation à la paroi aortique (flèche dans la figure 2F
Figure 1. Le système de culture de tissu miniature. (A) Dans la chambre de perfusion cœur est couché sur le stade de la rotation et ligaturé avec les aiguilles émoussées indiqués avec nr.1 et nr.2. (B) la chambre de perfusion est monté sur le stand. (C) de dessin schématique du coeur lorsque la culture de la valve mitrale (à gauche) ou la valve aortique (à droite). (D) de dessin schématique de la configuration du système ex vivo d'écoulement pour culture de la valve aortique. Ce chiffre a été en partie modifiée de l'étude précédente 11. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une version plus grande of ce chiffre.
Figure 2. L'analyse histologique de vannes en culture à partir de 2 mois de souris âgées. (AC) heamatoxylin et de l'éosine (H & E) Trichrome coloration et GI (DF) Masson) coloration TUNEL d'une valve aortique non cultivées (A, D, G), une valve aortique cultivées en présence de 1% de sérum (B, E , H) ou 10% de sérum (C, F, I) pendant 3 jours dans le MTCS. La vanne cultivées avec 1% de sérum semble similaire à la soupape de non-culture, tandis que la valve en culture avec 10% de sérum est plus épaisse (C) et a un diagramme d'ECM modifié (F). N apoptose est observée dans les vannes (GI). La barre d'échelle est de 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes critiques dans la mise en culture des soupapes de souris cardiaques comprennent rendant le temps entre l'excision du coeur de la souris et la ligature dans la chambre de perfusion le plus court possible pour assurer la viabilité et la ligature des aiguilles perpendiculaires aux soupapes pour assurer une orientation adéquate de l'écoulement . De plus, le contrôle du débit après la ligature dans la chambre de perfusion sans moyen assure l'insertion d'aiguilles et la ligature appropriée. Il est essentiel de maintenir une culture stérile et empêche les bulles d'air dans le tube, ce qui pourrait potentiellement se retrouver piégé dans le cœur obstruant l'écoulement.
Le volume total de milieu utilisé pour la perfusion d'un coeur est de 45 ml (à noter que le moyen qui est perfusé à travers le coeur n'a pas de contact avec les 20 ml de milieu dans la chambre de perfusion). Par l'addition de virus, par exemple un volume plus petit peut être préféré. Temporellement le réservoir (et une partie de la tubulure) peuvent être retirées du circuit le fait de laisser 5-7 ml dans le système pour permettre à l'infection de la vanne.
L'absence de battements de coeur pourrait être considéré comme une limitation. Cependant, elle permet la création d'une condition expérimentale, dans lequel tous les stimuli de travail sur la notice peut être maintenue constante. Cela donne l'occasion unique d'étudier l'effet d'une seule modification. Lorsque les vannes mobiles sont nécessaires, un flux pulsatile peut être créé.
Pour étudier la biologie valvulaire et le rôle des stimuli moléculaires, cellulaires et mécaniques sur la vanne, des modifications peuvent être facilement apportées au système de culture. Modification moléculaire peut être réalisé par l'addition de facteurs de croissance, des composés chimiques et des virus médiant la délivrance de gènes 11 dans le milieu de perfusion. Types de cellules une ou plusieurs peuvent être administrés pour le milieu de perfusion pour examiner l'influence de ces cellules sur la biologie valvulaire ou leur contribution à la vanne. L'influence du stress oxydatif ou hypoxie peut êtreétudié en modifiant la pression de l'oxygène dans le milieu de culture. Les contraintes hémodynamiques sur la valve peuvent être modifiées en changeant la vitesse d'écoulement, direction d'écoulement, pulsatilité d'écoulement et la viscosité. La morphologie globale peut être examinée (figure 2B, C) par H & E, la coloration histochimique et immunofluorescence. En outre, l'organisation et la composition de l'ECM, le phénotype, la prolifération et la viabilité des cellules valvulaires et l'activation des voies de signalisation permettent de mieux comprendre les effets de la variation de ces conditions. Les souris génétiquement modifiées peuvent être utilisés pour suivre les cellules endothéliales, en utilisant des souris rapporteurs endothéliales (en utilisant le Tie2-Cre et Floxé souris rapporteur) indiquant la présence de l'endothélium-mésenchymateuse transformation ou la souris avec perte ou gain de fonction des voies de signalisation spécifiques. Globalement, le système présenté ici est un outil utile pour étudier cardiaque valvulaire biologie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
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