Introduction
مرض صمام القلب هو سبب رئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. انتشاره يزيد مع التقدم في السن ويؤثر على أكثر من 10٪ من السكان 75 سنة فأكثر 1. صمامات الجزء النظامية للقلب، والصمام الأورطي والتاجي، ومعظمهم من المتضررين. يتميز مرض صمام القلب من جراء فقدان هيكل درجة عالية من التنظيم للصمامات، الذي ينتج تغيير في الخواص الميكانيكية 2. السلامة الهيكلية ذلك فمن الأهمية البالغة وظيفة الصمام.
وتتألف منشورات صمام الخلايا صمامي الخلالي (VIC)، الخلايا البطانية صمامي (VEC)، والمصفوفة خارج الخلية، الذي يتم تنظيمه للغاية في نمط الطبقات 3،4. وفيكس هي المسؤولة عن تركيب ECM، وتدهور والتنظيم. العوامل النابعة من مجرى الدم، ECS أو المقيمين في فعل ECM على فيكس بتدبير وظيفتها. بالإضافة،تعمل القوى الميكانيكية على النشرة خلال دورة القلب مما أدى إلى الصفحي أو إجهاد القص متذبذبة، يؤكد الضغط أو الشد التأثير على سلوك فيكس 5.
من أجل فهم كيفية تنظيم هيكل صمام، يجب أولا أن يفهم كيف فيكس لرد على مجموعة متنوعة من المحفزات شهدت خلال دورة القلب. وقد تم في الدراسات المختبرية مفيدة للغاية حول خصائص وقدرات الخلايا صمامي. استجابة هذه الخلايا في المختبر، ومع ذلك، قد لا تحاكي بدقة دائما الاستجابة في الجسم الحي 6؛ على سبيل المثال، استجابة للمؤثرات VIC تعتمد على وجود ECS وتكوين ECM 5. وعلاوة على ذلك، واستجابة خلايا صمامي للمنبهات تعتمد على مواقعها المحددة في النشرة 7. بالإضافة إلى المحفزات الحيوية، يتم تحديد سلوك الخلايا صمامي من قبل القوات الميكانيكية س يتصرفن صمام 8. يخضع كل منطقة من صمام لتشكيلتها الخاصة من الضغوط الدورة الدموية. على الرغم من أن النماذج الحالية فيفو السابقين قد أظهرت أن القوى الميكانيكية هي محددات هامة للبنية صمامي 5، والآليات المرتبطة بها لا تزال غير واضحة. في حين قدمت النماذج في الجسم الحي نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير صمامي 9،10، نظرة ثاقبة صمامي البيولوجيا الكبار لا تزال بعيدة المنال.
لذلك، تم وضع فيفو السابقين نموذج تدفق فيه صمامات القلب يمكن تربيتها في وضع طبيعي في القلب لفترة طويلة من الزمن 11. هذا له ميزة أنه لا تزال الصمامات في شكلها الطبيعي وفيكس تجربة نفس البيئة كما هو الحال في الجسم الحي، مما يجعل ردود فيكس للمحفزات طبيعية قدر الإمكان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الصمامات في وضعهم الطبيعي في قلب يسهل إخضاع كلالمنطقة صمامي لضغوط الدورة الدموية ذات الصلة. في هذا النموذج المجراة سابقا، أي نظام زراعة الأنسجة مصغرة (تلك الخلايا)، والصمامات يمكن أن تتعرض لمختلف المحفزات الحيوية والدورة الدموية مما يتيح للتحقيق لدورهم في القلب إعادة عرض الصمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية LUMC لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية.
1. إعداد الآلات، الثقافة المتوسطة، وتلك الخلايا
ملاحظة: إجراء كافة الاستعدادات في غطاء تدفق الصفحي. ووصف تلك الخلايا غرفة نضح، فخ فقاعة وموقف في ليبر وآخرون، 2010 (11).
- تطهير ملقط ومقص الجزئي مع 70٪ من الإيثانول. تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة مع معقم تايرود العازلة (130 ملي كلوريد الصوديوم، 5.4 ملي بوكل، 6.0 ملي HEPES، 1.2 ملي MgSO 4، 1.2 مم KH 2 PO 4، 20 ملي الجلوكوز، 1.5 ملي CaCl 2 .2H 2 O، الرقم الهيدروجيني = 7.2). تحضير حقنة 5 مل مع 21G إبرة بمحلول معقم بوكل (100 ملم).
- إعداد 65 مل من المتوسط في القلب: DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين العجل المصل، مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A؛ 100 وحدة من البنسلين، 100 ميكروغرام من الستربتومايسين، و 0.25 ميكروغرام من الأمفوتريسين B / مل)، الانسولين Transferrin-السيلينيوم (ITS، و 10 ميكروغرام / مل الأنسولين، و 5.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 6.7 نانوغرام / مل سيلينات الصوديوم) وفلتر تعقيم.
- تعقيم غرفة نضح وفخ فقاعة عن طريق الرش مع 70٪ من الإيثانول والجافة مع منشفة ورقية. تجميع تلك الخلايا (الشكل 1D)، ومع ذلك، في البداية دون غرفة التروية. ضع في فخ فقاعة على الوقوف. استخدام مضخة الأسطوانة تحوي سهلة الحمل رؤساء المضخة.
- باستخدام أنبوب السيليكون إجراء اتصالات بين الخزان (أنبوب 50 مل)، ومضخة، مضخة وفخ فقاعة، في فخ فقاعة وخزان (انظر الشكل 1D). جعل الأنابيب داخل الحاضنة لفترة كافية للسماح المتوسطة للوصول إلى التوازن الغاز مع غاز في الحاضنة من خلال أنابيب الغاز قابلة للاختراق السيليكون (1 م) وأنابيب خارج الحاضنة قصيرة قدر الإمكان.
- ملء أنبوب 50 مل مع 70٪ من الإيثانول، بدوره على مضخة (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة للسماح التداول السليم)، والسماح للسي آي آر الإيثانولculate لمدة 30 دقيقة لتعقيم جميع الأنابيب. إزالة الإيثانول عن طريق إفراغ الخزان وتضخ الايثانول من النظام.
- ملء أنبوب 50 مل بالماء المقطر المعقم، بدوره على مضخة والسماح للتعميم الماء لمدة 30 دقيقة للتخلص من الايثانول المتبقية. إزالة المياه من خلال تفريغ الخزان وتضخ المياه من النظام.
- ملء أنبوب 50 مل مع 45 مل من المتوسط، وضعت الوقوف في الحاضنة. بدوره على (سرعة تدفق حوالي 1 مل / دقيقة) مضخة وتعميم المتوسطة لملء جميع الأنابيب، وإزالة جميع فقاعات الهواء، والسماح للالمتوسطة على التكيف مع تركيبة الغاز في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل. الحفاظ على الحاضنة في ظروف الأنسجة الثقافة القياسية (5٪ CO 2 و 37 ° C). ضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب.
2. عزل القلب ماوس
- حقن الفأر مع 500 وحدة من الهيبارين. هذا سوف يمنع الدم من التخثر، وتتيح للإزالة بlood من القلب. بعد 10 دقيقة، تخدير الماوس في غرفة الاستقراء مع 4٪ الأيزوفلورين باستخدام المرذاذ الدقة. التخدير كافية عندما الماوس لا يستجيب لقرصة أخمص قدميه.
- نقل الماوس إلى لوحة تشريح والحفاظ على التخدير عن طريق قناع متصلة الدائرة المحورية. تطهير الفراء من الفأر مع الكحول 70٪. باستخدام مقص فتح تجويف البطن لفضح الوريد الأجوف والحجاب الحاجز.
- لفضح القلب، وجعل الشقوق الجانبية ابتداء من آخر من الأضلاع الأولى وتعكس القفص الصدري فوق رأس الفأر. وقف التخدير كما الماوس لا يتنفس بعد الآن. مراقبة القلب النابض.
- ادخال الإبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على العازلة العقيمة تايرود في الوريد الأجوف السفلي من البطن إلى داخل التجويف الصدري (من خلال الحجاب الحاجز). تأكد من أن الدم يمكن الخروج من الذيلية الوريد الأجوف من غرز الإبرة. يروي عشرالعازلة البريد تايرود بلطف ومع الضغط المستمر في الوريد الأجوف حتى يفقد القلب جزئيا لونه أحمر. ملاحظة: لا يزال قلب ينبض السماح للإزالة الدم من القلب.
- استبدال الإبر مع إبرة 21G تعلق على حقنة 5 مل تحتوي على حل بوكل العقيمة. يروي بلطف الحل بوكل في الوريد الأجوف حتى يتوقف القلب النابض وإزالة الإبرة. ملاحظة: الحل بوكل يحافظ على القلب في مرحلة الانبساطي استرخاء، والتي سوف تسمح الإدراج أسهل من الإبر نضح ونضح من نظام التاجي.
- قليلا رفع القلب باستخدام ملقط المنحنية وباستخدام مقص تشريح القلب خالية من الأنسجة المحيطة ولكن ترك الشرايين والأوردة القريبة إلى القلب سليمة وتعلق على القلب. نقل قلب لأنبوب 15 مل تحتوي تستكمل PBS الجليد الباردة مع مضاد حيوي / مضاد فطري (A / A). تخزين قلب في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة لمدة تصل إلى 3 ساعات.
3. Cannulatioن من قلوب ماوس في غرفة الإرواء
- تنفيذ كافة الإجراءات في غطاء تدفق الصفحي. تستكمل نقل قلب معزولة عن أنبوب 15 مل إلى صحن 10 سم بيتري وإضافة PBS مع A / A.
- تحت المجهر تشريح، استخدم مقص الجزئي وملقط لإزالة جميع الأنسجة غير القلب ولكن الحفاظ على الأبهر الصاعد إلى ما لا يقل عن التشعب مع الشريان العضدي الرأسي والأوردة الرئوية، 2 مم الأقرب إلى القلب. قطع غيض من قمة القلب إلى خلق الوصول إلى تجويف البطين الأيسر (عادة 2 ملم). وضع غرفة نضح في غطاء تدفق تحت المجهر تشريح.
- نعلق حقنة 5 مل مع المتوسطة إلى الإبرة إدراج باستخدام أنابيب السيليكون. ملء غرفة نضح مع 20 مل المتوسطة ووضع القلب في مرحلة التناوب بين الإبر اضعافها 2 في غرفة نضح (الشكل 1). ضبط ارتفاع مرحلة التناوب بحيث يتم وضع القلب أمامالإبر.
4. من ربط لزراعة صمام تاجي (انظر الشكل 1)
- Ligate الشريان الأورطي مع خياطة (الحرير 7.0). Ligate لاحقة الأذين الأيسر مع خياطة. ادخال الإبرة (رقم 1 في الشكل 1) عن طريق الوريد الرئوي إلى الأذين الأيسر وligate مع خياطة الأقرب إلى دخولها في الأذين الأيسر. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الأذين الأيسر حيث أن ذلك من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام التاجي.
- ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا.
- بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية متوسطة إلى القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.1 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.2 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب.
5. لىgation لزراعة صمام الأورطي (انظر الشكل 1)
- ادخال الإبرة (nr.1 في الشكل 1) في الشريان الأورطي وligate مع خياطة. تأكد من أن الإبرة ليست بعيدة جدا في الشريان الأورطي لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تلف الصمام الأبهري. ادخال الإبرة (nr.2 في الشكل 1) مع الحركة الخطية إلى البطين الأيسر. نقل متوسطة من غرفة نضح إلى أنبوب 50 مل. ختم الإبرة إلى عضلة القلب مع الغراء حيويا.
- بعد أن يجف الغراء، وضخ بعناية المتوسطة في القلب من خلال ربط حقنة مليئة المتوسطة إلى إبرة nr.2 ومعرفة ما اذا كان هناك أي تسرب. تأكد من أن مخارج المتوسطة من nr.1 إبرة وperfused الدم آخر ما تبقى من القلب.
6. ضع غرفة الإرواء على حامل
- تملأ غرفة نضح مع 20 مل نقل متوسطة. وضع طوقا وغطاء على غرفة وتشديد مع غسالة ومسامير.
- إزالة تلك الخلايا تجميعها من incubaتور. نعلق غرفة نضح على الوقوف. توصيل أنابيب (انظر الشكل 1D). وضع الوقوف في حاضنة (5٪ CO 2 و 37 ° C). توصيل الأنابيب إلى المضخة. بدوره على مضخة مع سرعة تدفق نحو 600 ميكرولتر / دقيقة.
- تأكد من أن في الخزان و / أو فخ فقاعة مستوى المتوسطة يسمح للتصورات وجود تدفق قبل سقوط قطرات المتوسطة واردة. بعد والثقافة، وإزالة القلب من النظام، الثابتة وتجهيزها للفحص النسيجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصمام الأبهري (الشكل 2) أو صمام تاجي 11 يمكن أن يكون مثقف لمدة 3 أيام على الأقل. من خلال زراعة في موقف فتح (والذي يمثل موقف الانقباضي للالصمام الأبهري وموقف الانبساطي للصمام التاجي)، تظل خلايا صمامي قابلة للحياة. يتم احترام أي موت الخلايا على النحو الذي يحدده غياب TUNEL إيجابية الخلايا (الشكل 2H، I) أو المشقوق كاسباس 3 التعبير (لا يظهر ويبر وآخرون، 2010 11). توزيع الكولاجين (كما تصور من قبل ماسون ثلاثي الألوان تلطيخ) مشابه لحالة الأم عند تربيتها في 1٪ مصل (الشكل 2D، E). الصمامات هي استجابة للظروف المتغيرة الثقافة. زيادة كمية الدم إلى 10٪ في نتائج منشورات سمكا (الشكل 2C). وعلاوة على ذلك، لوحظ منطقة خالية من الكولاجين واضحة في الجانب البطين للنشرة بالقرب من التعلق على جدار الأبهر (السهم في الشكل 2F
الشكل 1. نظام زراعة الأنسجة مصغرة. (A) في غرفة نضح القلب وزرع على مرحلة التناوب وligated مع الإبر أضعفت أشار مع nr.1 وnr.2. (B) هي التي شنت الإرواء غرفة على الوقوف. (C) الرسم التخطيطي للقلب عندما زرع صمام التاجي (يسار) أو الصمام الأبهري (إلى اليمين). (D) رسم تخطيطي من الإعداد للخارج الحي نظام تدفق للثقافة الصمام الأورطي. تم تعديل هذا الرقم جزئيا من دراسة سابقة 11. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة سو هذا الرقم.
الشكل 2. تحليل النسيجي صمامات مثقف من 2 أشهر الفئران القديمة. (AC) heamatoxylin ويوزين (H & E) (DF) ماسون ثلاثي الألوان تلطيخ وGI) TUNEL تلطيخ للصمام الأبهري غير مثقف (A، D، G)، وهو صمام الأبهري مثقف في وجود 1٪ مصل (B، E ، H) أو 10٪ مصل (C، F، I) لمدة 3 أيام في تلك الخلايا. صمام مثقف مع 1٪ مصل يظهر مشابها صمام غير مثقف، في حين أن الصمام مثقف مع 10٪ مصل هو أكثر سمكا (C) ويحتوي على نمط ECM تغير (F). يتم احترام أي موت الخلايا المبرمج في صمامات (GI). شريط المقياس هو 100 أم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في زراعة الصمامات الماوس القلب مما يجعل الوقت بين استئصال القلب من الماوس وربط في غرفة نضح قصيرة قدر الإمكان لضمان سلامة وربط الإبر عمودي على الصمامات لضمان الاتجاه الصحيح من تدفق . بالإضافة إلى ذلك، والتحقق من تدفق بعد ربط في غرفة نضح دون المتوسط يضمن الإدراج السليم وربط الإبر. فمن الأهمية بمكان للحفاظ على الثقافة العقيمة ومنع فقاعات الهواء في الأنبوب، والتي من المحتمل أن تحصل على المحاصرين في قلب عرقلة التدفق.
إجمالي حجم الوسيلة المستخدمة للنضح من القلب هو 45 مل (لاحظ أن المتوسط الذي perfused عن طريق القلب ليست على اتصال مع 20 مل من المتوسط في غرفة التروية). يمكن لإضافة بحثا عن الفيروسات سبيل المثال حجم أصغر من المفضل. الزمان الخزان (وجزء من الأنبوب) ويمكن إزالتها من الدائرة لeaving 5-7 مل في النظام للسماح إصابة الصمام.
ويمكن اعتبار غياب ضربات القلب وجود قيود. ومع ذلك، فإنه يسمح خلق حالة تجريبية في جميع المحفزات التي تعمل على النشرة يمكن أن تظل ثابتة. وهذا يعطي فرصة فريدة لدراسة تأثير تعديل واحد. عندما يطلب صمامات متحركة، يمكن إنشاء تدفق نابض.
لدراسة البيولوجيا صمامي ودور المحفزات الجزيئية الخلوية والميكانيكية على الصمام، والتعديلات يمكن أن يتم بسهولة إلى النظام الثقافة. لا يمكن أن يتحقق تعديل الجزيئي من خلال إضافة عوامل النمو، والمركبات الكيميائية والفيروسات التوسط توصيل الجينات 11 إلى المتوسطة نضح. واحد أو عدة أنواع الخلايا يمكن أن تدار إلى المتوسطة نضح لدراسة تأثير هذه الخلايا على البيولوجيا صمامي أو مساهمتها في الصمام. تأثير الاكسدة أو نقص الأكسجين يمكن أن يكوندرس عن طريق تغيير الأكسجين الضغط في مستنبت. يمكن أن تختلف الضغوط الدورة الدموية على الصمام عن طريق تغيير سرعة التدفق، اتجاه التدفق، pulsatility تدفق واللزوجة. يمكن فحص التشكل العام (الشكل 2B، C) بواسطة H & E، وتلطيخ النسيجية ومناعي. بالإضافة إلى تنظيم وتكوين ECM، النمط الظاهري، والانتشار، وبقاء خلايا صمامي وتفعيل مسارات إشارات توفر نظرة ثاقبة آثار متفاوتة هذه الظروف. الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم لتعقب الخلايا البطانية، وذلك باستخدام الفئران مراسل البطانية (باستخدام Tie2-لجنة المساواة العرقية وfloxed مراسل الفئران) تشير إلى وجود-البطانية لالوسيطة التحول أو الفئران مع الخسارة أو الربح من وظيفة من مسارات إشارات محددة. وعموما، فإن نظام المقدمة هنا هي أداة مفيدة لدراسة القلب صمامي علم الأحياء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
