Introduction
מחלה שסתום לב היא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בעולם המערבי; שכיחותה עולה עם גיל, וזה משפיע על יותר מ -10% מאוכלוסיית השנים 75 ומעלה 1. שסתומים של החלק המערכתי של הלב, שסתומים אב העורקים וצניפי, הם בעיקר מושפעים. מחלה שסתום לב מאופיינת באובדן של המבנה מאורגן של השסתומים, שתוצאתה השינוי של התכונות מכאניות 2. השלמות המבנית ולכן קריטית לתפקוד של השסתום.
העלונים של השסתום מורכבים מתאים מסתמית ביניים (ויק), תאי האנדותל מסתמית (VEC), ומטריקס, המאורגן בתבנית שכבות 3,4. VICS אחראי לסינתזת ECM, השפלה והארגון. גורמים הנובעים ממחזור הדם, ECS או מתגוררים במעשה ECM על VICS מנצח את תפקידו. בנוסף,כוחות מכאניים לפעול בעלון במהלך מחזור הלב וכתוצאה מכך למינרית או מאמץ הגזירה oscillatory, לחצי דחיסה או מתיחה המשפיעים על ההתנהגות של VICS 5.
על מנת להבין כיצד המבנה של השסתום מוסדר, זה חייב להיות ראשון הבין איך VICS להגיב לקבוצה המגוונת של גירויים חוו במהלך מחזור הלב. מחקרים במבחנה היו מאוד אינפורמטיבי על המאפיינים והיכולות של התאים מסתמית. התגובה של תאים אלה במבחנה, עם זאת, לא תמיד בצורה מדויקת לחקות את התגובה בvivo 6; לדוגמא, התגובה של ויק לגירויים תלויה בנוכחות של ECs והרכב ECM 5. יתר על כן, התגובה של התאים מסתמית לגירויים תלויה במיקומם הספציפי בעלון 7. בנוסף לגירויים ביוכימי, ההתנהגות של התאים מסתמית נקבעה על ידי כוחות מכאניים הפועלים on השסתום 8. כל אזור של השסתום הוא נתון לסדרה הספציפית משלו של לחצים המודינמית. למרות שהמודלים הנוכחיים vivo לשעבר הראו כי כוחות מכאניים הם גורמים חשובים של מבנה מסתמים 5, המנגנונים הקשורים עדיין אינם ברורים. בעוד מודלים in vivo סיפקו תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח מסתמים 9,10, תובנות ביולוגיה מסתמית מבוגרת עדיין חמקמקות.
לכן, vivo לשעבר זרימת מודל פותח באשר יכולים להיות מתורבת שסתומי לב בעמדה הטבעית שלהם בלב לתקופה ממושכת של זמן 11. זה היתרון שהסתומים להישאר בתצורה הטבעית שלהם וVICS לחוות את אותה הסביבה כמו בvivo, מה שהופך את התגובות לגירויים VICS טבעיים ככל האפשר. בנוסף, התרבות של השסתומים בעמדה הטבעית שלהם בלב מאפשרת להעמיד את כלאזור מסתמית ללחצים המודינמית הרלוונטיים. במודל זה vivo לשעבר, כלומר, מערכת תרבות רקמות זעירה (MTCS), יכולה להיות נתונה סתומה לגירויים ביוכימיים והמודינמית שונים המאפשרים החקירה של תפקידם בשיפוץ שסתום לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות LUMC של ועדת האתיקה מחקר בבעלי החיים.
1. הכנה של מכשירים, תרבות בינונית, וMTCS
הערה: בצע את כל ההכנות בזרימה למינרית. תא זלוף MTCS, מלכודת הבועה והעמדה מתוארות בליבר et al., 2010 11.
- לחטא את המלקחיים ומספריים מיקרו עם 70% אתנול. הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם הצפת (130 מ"מ NaCl של Tyrode סטרילי, 5.4 מ"מ KCl, 6.0 מ"מ Hepes, 1.2 מ"מ MgSO 4, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, 20 מ"מ גלוקוז, 1.5 מ"מ CaCl 2 .2H 2 O, pH = 7.2). הכן מזרק 5 מיליליטר עם מחט 21G עם פתרון סטרילי KCl (100 מ"מ).
- הכן 65 מיליליטר של מדיום ללב: DMEM בתוספת 10% עגל סרום עוברי, אנטיביוטיקה / antimycotic (/; פניצילין 100 יחידות, של סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם, ו0.25 UG של amphotericin B / מיליליטר), אינסולין-Transferrin-סלניום (ITS; 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5.5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 6.7 ng / הסלניום נתרן מיליליטר) ולסנן לעקר.
- לעקר את תא זלוף ומלכודת בועה על ידי ריסוס עם אתנול 70% ויבשים עם מגבת נייר. להרכיב את MTCS (1D איור), עם זאת, בתחילה בלי תא זלוף. מקם את מלכודת הבועה על הדוכן. השתמש במשאבת הרים פריסטלטיים ראשי משאבה קל עומס.
- שימוש בצינורות סיליקון ליצור קשרים בין המאגר (שפופרת 50 מיליליטר) והמשאבה, המשאבה ומלכודת הבועה, בועת המלכודת והמאגר (ראה איור 1D). הפוך את צינורות בתוך האינקובטור ארוך מספיק כדי לאפשר בינוני להגיע לשיווי משקל גז עם הגז בחממה דרך צינורות הגז החדירים סיליקון (1 מ ') והצינורות מחוץ לחממה הקצרה ככל האפשר.
- מלא את צינור 50 מיליליטר עם 70% אתנול, להפעיל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה כדי לאפשר זרימה תקינה) ולתת CIR אתנולculate למשך 30 דקות כדי לעקר את כל צינורות. הסר את אתנול על ידי ריקון המאגר והשאיבה החוצה אתנול מהמערכת.
- מלא את צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים סטריליים, להפעיל את המשאבה ולתת לזרום המים למשך 30 דקות להיפטר נותר אתנול. הסר את המים על ידי ריקון המאגר ושאיבה החוצה את המים מהמערכת.
- מלא את צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של מדיום, לשים את הדוכן בחממה. הפעל את המשאבה (מהירות זרימה סביב 1 מיליליטר / דקה) ולהפיץ את המדיום כדי למלא את כל צינורות, להסיר את כל בועות האוויר ולאפשר בינוניים להסתגל לרכב הגז בחממה במשך שעה לפחות 1. לשמור על החממה בתנאים סטנדרטיים רקמות תרבות (5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס). ודא שאין בועות נמצאות בצינור.
2. בידוד של לב העכבר
- הזרק את העכבר עם 500 יחידות של הפרין. זה ימנע את קרישת הדם ומאפשר את הסרת באת מזון מהלב. לאחר 10 דקות, להרדים את העכבר בתא אינדוקציה עם isoflurane 4% באמצעות אידוי דיוק. ההרדמה היא מספיק כאשר העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן.
- העבר את העכבר ללוח לנתיחה ולשמור על הרדמה באמצעות facemask מחובר למעגל קואקסיאליים. לחטא את הפרווה של העכבר עם אלכוהול 70%. בעזרת מספריים לפתוח את חלל הבטן לחשוף את הווריד הנבוב והסרעפת.
- כדי לחשוף את הלב, לעשות חתכים רוחב החל מהאחרונות לצלעות הראשונות ומשקפים את כלוב בית החזה מעל ראשו של העכבר. לעצור את ההרדמה כעכבר לא נושם יותר. שים לב לפעימות הלב.
- הכנס את מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל המאגר של Tyrode סטרילי לתוך הווריד הנבוב הנחות מהבטן לתוך חלל בית החזה (דרך סרעפת). ודא שהדם יכול לצאת מזנב הווריד הנבוב מהחדרת המחט. Perfuse ההמאגר של הדואר Tyrode בעדינות ועם לחץ מתמיד לווריד הנבוב עד הלב מאבד חלקו הצבע האדום שלו. הערה: הלב נשאר להכות מאפשר הסרת הדם מהלב.
- החלף את המחט עם מחט 21G מצורפת מזרק 5 מיליליטר מכיל פתרון KCl סטרילי. בעדינות perfuse פתרון KCl לתוך הווריד הנבוב עד הלב מפסיק לפעום ולהסיר את המחט. הערה: פתרון KCl משמר את הלב בשלב הדיאסטולי רגוע, שיאפשר כניסה קלה יותר של מחטי זלוף וטפטוף של מערכת הלב.
- מעט להרים את הלב באמצעות מלקחיים מעוקלים ומספריים באמצעות לנתח את הלב חופשי מרקמות אך להשאיר עורקים וורידים הפרוקסימלי ללב שלם ומחובר ללב. העבר את הלב לצינור 15 מיליליטר מכיל PBS קר כקרח בתוספת (/) אנטיביוטי / antimycotic. אחסן את הלב בPBS קר כקרח עד 3 שעות.
3. Cannulation של לבבות העכבר בתא זלוף
- לבצע את כל ההליכים בזרימה למינרית. העבר את הלב מבודד מצינור 15 מיליליטר לצלחת פטרי 10 סנטימטרים ולהוסיף PBS בתוספת /.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במספריים ומלקחי מיקרו כדי להסיר את כל הרקמה הלא-הלב אלא לשמר את אב העורקים עולים לפחות ההסתעפות עם עורק brachiocephalic והוורידים הריאה, הפרוקסימלי 2 מ"מ ללב. חותך את קצה הקודקוד של הלב כדי ליצור גישה ללום החדר השמאלי (בדרך כלל 2 מ"מ). מניחים את חדר זלוף בזרימת מכסה המנוע תחת מיקרוסקופ לנתח.
- צרף מזרק 5 מיליליטר עם מדיום למחט הכנס באמצעות צינורות סיליקון. למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר בינוני ולשים לב על הבמה הסיבוב בין 2 המחטים קהות בתא זלוף (איור 1). התאם את הגובה של שלב הרוטציה כך הלב ממוקם מולמחטים.
4. קשירת לCulturing שסתום צניפי (ראה איור 1)
- לקשור את אב העורקים עם תפר (משי 7.0). לקשור את תוספת פרוזדורי שמאל עם תפר. הכנס את המחט (NR. 1 באיור 1) דרך עורק הריאה לפרוזדור השמאלי ולקשור עם הפרוקסימלי תפר לכניסתה בפרוזדור השמאלי. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאטריום השמאל כמו זה יפגע בשסתום צניפי.
- הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית.
- לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.1 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.2 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב.
5. ליgation לCulturing שסתום אבי העורקים (ראה איור 1)
- הכנס את המחט (nr.1 באיור 1) באב העורקים ולקשור עם תפר. ודא את המחט היא לא רחוקה מדי לאב העורקים כזה יפגע בשסתום אב העורקים. הכנס את המחט (nr.2 באיור 1) עם תנועה ליניארית לתוך החדר השמאלי. העבר הבינוני מתא זלוף לצינור 50 מיליליטר. חותם את המחט לשריר הלב עם דבק ביולוגית.
- לאחר הדבק התייבש, להזריק בזהירות בינונית ללב על ידי חיבור מזרק מלא בינוני לעקוץ nr.2 ולבדוק אם יש דליפה כלשהי. ודא שיציאות בינוניות מnr.1 המחט והדם האחרון שנותר הוא perfused מתוך הלב.
6. מקום זלוף הלשכה במעמד
- למלא את תא זלוף עם 20 מיליליטר הועבר בינוני. הנח אטם ומכסה על החדר ולהדק עם מכונת כביסה וברגים.
- הסר את MTCS הורכב מאינקובטוריםטור. צרף את תא זלוף על הדוכן. חבר את צינורות (ראה איור 1D). הנח את העמדה בחממה (5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס). חבר את הצינור למשאבה. הפעל את המשאבה עם מהירות זרימה כ -600 μl / דקה.
- ודא כי במאגר ו / או מלכודת בועת רמת בינונית מאפשרת חזותי של הנוכחות של הזרימה על ידי הנפילה של הטיפות בינוניות הנכנסות. אחרי התרבות, הלב יוסר מהמערכת, קבוע ומעובד לבדיקה היסטולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שסתום אב העורקים (איור 2) או צניפי 11 שסתום יכול להיות מתורבת לפחות 3 ימים. על ידי culturing במצב הפתוח (המייצג את העמדה הסיסטולי לשסתום אב העורקים ואת המיקום הדיאסטולי לשסתום צניפי), תאים מסתמית להישאר קיימא. לא מוות של תאים הוא ציין, כפי שנקבע על ידי בהעדר תאי TUNEL-החיובי (איור 2H, אני) או caspase-3 ביטוי ביקע (לא מוצג וליבר et al., 2010 11). הפצת קולגן (כמו דמיין ידי מכתים Trichrome של האסון) דומה למצב המקורי כאשר בתרבית בסרום 1% (איור 2 ד, ה). השסתומים מגיבים לשינויים בתנאי תרבות. הגדלת הכמות של סרום 10% בתוצאות עלונים עבים (איור 2 ג). יתר על כן, אזור נטול קולגן ברור הוא ציין בצד של החדר של העלון ליד הקובץ המצורף לקיר אב העורקים (חץ באיור 2F
מערכת תרבות רקמות זעירה באיור 1.. (א) בתא זלוף לב הנחה על הבמה הסיבוב וligated עם המחטים הקהות מצויינים עם nr.1 וnr.2. (ב) זלוף קאמרי הוא רכוב על הדוכן. ציור סכמטי של הלב (C) כאשר culturing שסתום צניפי (משמאל) או שסתום אב העורקים (מימין). ציור סכמטי של ההתקנה של מערכת זרימת vivo לשעבר לתרבות שסתום אב העורקים (ד '). נתון זה השתנה באופן חלקי מהמחקר הקודם 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר oF נתון זה.
איור 2. ניתוח היסטולוגית של שסתומים בתרבית מ2 חודשי עכברים ישנים. (AC) heamatoxylin וeosin מכתים (DF) של האסון Trichrome וGI) מכתים TUNEL של שסתום אב העורקים שאינם מתורבת (H & E) (A, D, G), שסתום אב העורקים בתרבית בנוכחות סרום 1% (B, E , H) או בסרום% 10 (C, F, I) במשך 3 ימים בMTCS. השסתום תרבותי עם סרום 1% נראה דומה לשסתום הלא מתורבת, ואילו את השסתום תרבותי עם סרום 10% עבה יותר (C) ויש לו דפוס שינה ECM (F). אין אפופטוזיס הוא ציין שבסתומים (GI). סרגל קנה מידה הוא 100 אום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בculturing שסתומי לב העכבר כוללים ביצוע הזמן בין הכריתה של הלב מהעכבר והקשירה בתא זלוף הקצר ככל האפשר על מנת להבטיח יכולת קיום וקשירה של המחטים בניצב לשסתומים כדי להבטיח כיוון נכון של הזרימה . בנוסף, בדיקת הזרימה לאחר קשירה בתא זלוף ללא בינוני מבטיחה הכנסה וקשירה של מחטים נכונים. זה קריטי כדי לשמור על תרבות סטרילי ולמנוע בועות אוויר בצינור, אשר עלול להילכד בלב שיבוש הזרימה.
הנפח הכולל של מדיום המשמש לטפטוף של לב הוא 45 מיליליטר (שים לב שהמדיום שהוא perfused דרך הלב הוא לא במגע עם 20 מיליליטר של מדיום בתא זלוף). לתוספת של למשל וירוסי נפח קטן יותר יכול להיות מועדף. באופן זמני את המאגר (וחלק מהצינורות) ניתן להסיר מl המעגלeaving 5-7 מיליליטר במערכת כדי לאפשר לזיהום של השסתום.
היעדר פעימות הלב יכול להיחשב הגבלה. עם זאת, היא מאפשרת יצירת תנאי ניסוי שבו יכולים להיות כל הזמן קבוע כל הגירויים עובדים על העלון. זה נותן הזדמנות הייחודית כדי לחקור את ההשפעה של שינוי אחד בודד. כאשר שסתומים נעו נדרשים, ניתן ליצור זרימה פועמת.
כדי לחקור את הביולוגיה מסתמית ואת התפקיד של גירויים מולקולריים, תאיים ומכאניים על השסתום, שינויים יכולים להתבצע בקלות למערכת התרבות. שינוי מולקולרי יכול להיות מושגת על ידי התוספת של גורמי גדילה, תרכובות כימיות ווירוסים תיווך משלוח גן 11 עד בינוני זלוף. יכולים להינתן אחת או מספר סוגי תאים למדיום זלוף לבחון את השפעתם של תאים אלה על ביולוגיה מסתמית או תרומתם לשסתום. ההשפעה של מתח או היפוקסיה חמצוני יכולה להיותלמד על ידי שינוי החמצן בלחץ במדיום התרבות. לחצים המודינמית על השסתום יכולים להיות מגוונים על ידי שינוי מהירות הזרימה, כיוון זרימה, זרימת pulsatility והצמיגות. המורפולוגיה הכללית ניתן לבחון (איור 2, C) על ידי H & E, מכתים histochemical וimmunofluorescent. בנוסף הארגון וההרכב של ECM, פנוטיפ, התפשטות, ויכולת קיום של התאים מסתמית וההפעלה של מסלולי איתות לספק תובנה ההשפעות של משתנה תנאים אלה. עכברים מהונדסים גנטי יכולים לשמש כדי לעקוב אחר תאי האנדותל, באמצעות עכברי כתב אנדותל (באמצעות Tie2-Cre וfloxed עכברי כתב) המעידים על הנוכחות של האנדותל לmesenchymal שינוי או עכברים עם הפסד או רווח של פונקציה של מסלולי איתות ספציפיים. בסך הכל, המערכת שהוצגה כאן היא כלי שימושי לחקר ביולוגיה מסתמית לב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0.8 x1.59 x 0.40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N.
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
