Abstract
Stanse av tumor suppressor protein BRCA2 og sin påvisning av vanlige biokjemiske analyser representerer en stor teknisk utfordring på grunn av den store størrelsen på den menneskelige BRCA2 protein (ca. 390 kDa). Vi rapporterer modifikasjoner av standard siRNA transfeksjon og immunoblottingforsøk protokoller for å slå human BRCA2 og detektere BRCA2 endogent protein, henholdsvis i humane epitel-cellelinjer. Viktige skritt inkluderer en høy siRNA transfeksjon reagens ratio og to påfølgende runder av siRNA transfeksjon innenfor samme eksperiment. Ved hjelp av disse og andre modifikasjoner av standard protokoll vi konsekvent oppnå mer enn 70% stanse av det humane BRCA2-genet som bedømt ved immunblotting-analyse med anti-BRCA2-antistoffer. I tillegg er denaturering av cellelysatene ved 55 ° C i stedet for den konvensjonelle 70 til 100 ° C og andre tekniske optimaliseringer av prosedyren immunoblotting tillate påvisning av intakt protein BRCA2 selv when meget lave mengder av utgangsmaterialet er tilgjengelig eller når BRCA2 protein ekspresjonsnivåer er svært lave. Effektiv stanse av BRCA2 i humane celler tilbyr en verdifull strategi for å forstyrre BRCA2 funksjon i celler med intakt BRCA2, inkludert kreftceller, for å undersøke nye molekylære stier og cellulære funksjoner som kan bli berørt av patogene BRCA2 mutasjoner i svulstene. Tilpasning av denne protokollen for effektiv lyddemping og analyse av andre 'store' proteiner som BRCA2 bør være lett oppnåelig.
Introduction
Den BRCA2 (brystkreft mottakelighet gen-2) genet koder for en tumor suppressor protein som spiller en avgjørende rolle i å reparere DNA dobbelttrådbrudd ved å regulere funksjon av rekombinase enzymet Rad51 1. BRCA2 har også vært implisert i modulering av transkripsjon og i cellesykluskontroll 2. Germline mutasjoner i BRCA2 indusere en autosomal dominant mottakelighet for brystkreft og eggstokkreft hos kvinner og prostatakreft hos menn, samt predisposisjon for andre krefttyper 3,4. Men til tross for den økte risikoen i å utvikle kreft, BRCA2 mutasjoner som undertrykker eller reduserer BRCA2-funksjonen, kan gjøre kreftcellene mer sårbare for kjemoterapeutika som forårsaker DNA skade 5-7. Sporadiske kreftfremvise en lav sats av BRCA2-mutasjoner (<3%) om reduserte nivåer av BRCA2 protein har blitt oppdaget i enkelte krefttyper, som tyder på at BRCA2 proteinkan gå tapt under tumorigenesis i sporadiske kreft gjennom ikke-mutasjons-avhengige mekanismer 7,8. Derfor er det viktig å forstå BRCA2 funksjoner i sammenheng med kreft biologi, så vel som i andre biologiske innstillinger.
Et kraftig verktøy som brukes til å identifisere nye funksjoner av et gen i pattedyrceller er å dempe dens ekspresjon. Som et eksempel har tie BRCA2 uttrykk i en rekke normale epitelceller nylig førte til identifisering av en roman funksjon av BRCA2 som regulator av anoikis motstand, et viktig skritt i løpet av oppkjøpet av kreftcelle invasiv og metastatisk evne 9. Gene stanse kan oppnås ved å innføre i cellene enten små interfererende (si) RNA eller kort hårnål (sh) RNA-molekyler som er målrettet mot spesifikke genet. Den kraftige effekten av siRNA og dets brukervennlighet gjør det fortrinnsrett verktøy for å kneble eksperimenter som tar sikte på å få ny innsikt i kritiske biologiske prosesser ennd til å identifisere nye terapeutiske mål. Imidlertid kan effektiv knockdown av genekspresjon ikke være lett oppnåelig for alle genene, og kan være meget variabel, avhengig av celletype. Fordi en reduksjon i intracellulært protein nivåer er den mest relevante fenotype under undersøkelse, er det viktig å kvantifisere genet Slå ved immuno-analyse av genproduktet. Med denne respekt, presenterer BRCA2 protein en ytterligere utfordring: å være et stort protein (ca 390 kDa), gjør tekniske problemer eksisterer for konvensjonell biokjemisk analyse, inkludert immunoblotting.
Vi rapporterer her en protokoll optimalisert for effektiv lyddemping av BRCA2 i humane epiteliale cellelinjer og for rask og vellykket påvisning av BRCA2 protein knockdown ved immunoblotting analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered siRNA løsninger
- Resuspender 5 nmol av kryptert (Ctrl) og 5 nmol av BRCA2 siRNA tørkede pellets i 100 pl RNase-fritt vann (slutt siRNA konsentrasjon: 50 uM). Dette er siRNA lager og må lagres ved -20 ° C i 10 mL alikvoter.
- Ta en prøve av 10 pl fra siRNA lager og tilsett 40 ul RNase-fritt vann for å oppnå den 10 uM siRNA arbeidsløsning. Denne fortynning må oppbevares ved -20 ° C inntil bruk.
MERK: siRNA arbeidsløsning bør ikke gjennomgå frysing / tining mer enn tre ganger.
2. Seeding of Human epitelcelle Lines
- Fjern vekstmedium fra humane epitel-cellelinjer som vokser som cellemonolag i vevskulturplater i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Vask cellene i platen en gang med PBS (RT 10 ml PBS for en 100 mm plate).
- Å løsne cellene fra platen,tilsett 2 ml av 0,25% trypsin / 0,53 mM EDTA-løsning og inkuberes 3-5 minutter, avhengig av celletype.
- Før oppsamling av de frigjorte celler, nøytralisere trypsin ved å tilsette 2 ml komplett vekstmedium inneholdende 10% føtalt bovint serum.
- Overfør cellene til et 15 ml rør.
- Sentrifuger cellene ved 320-330 x g i 3 minutter ved 4 ° C i en svingende spannrotor.
- Resuspender cellepelletene i 5 ml av antibiotika-fritt medium.
- Tell cellene under mikroskopet i et Burker kammer eller ved hjelp av et automatisk tellesystem i henhold til produsentens instruksjoner.
- Seed cellene i 6-brønners plater til å være omtrent 80% sammenflytende etter 24 timer (0,5-1 x 10 6 celler i 2 ml medium til hver brønn). Optimal celle nummer for å bli seedet kan variere avhengig av de spesifikke cellelinjer og veksttakten.
MERK: Ikke legg antibiotika i mediet på dette punktet fordi antibiotika vil negativt påvirke effektiviteten av transfeDette skjer. Det er meget viktig at cellene er ved lave dyrkningspassasjer (<10) for å oppnå høy virkningsgrad på BRCA2 siRNA transfeksjon.
3. transfektere celler med siRNA
- Tjuefire timer etter plating cellene, fortsette med den første runden av transfeksjon.
- Fortynne 6 ul lipidbasert 10 siRNA bestemt transfeksjon reagens i 130 mL av redusert serum medium.
- Fortynne 3 pl 10 mikrometer siRNA (30 pmol) i 130 mL av redusert serum medium.
- Kombiner den fortynnede siRNA med fortynnet transfeksjon reagens og inkuberes i 5-10 minutter ved romtemperatur.
- I løpet av inkubasjonen fjernes mediet fra cellene og tilsett 2 ml ferskt medium forvarmet ved 37 ° C (uten antibiotika).
- Tilsett 250 ul av siRNA transfeksjon reagens-komplekser til celler (denne mengde er for en enkelt brønn av en 6-brønn plate).
- Cellene inkuberes i en fuktet inkubator ved 3776 C med 5% CO2.
- Etter 24 timer, fortsette med den andre runden av transfeksjon ved å gjenta trinn 3.1.1-3.1.5 med følgende modifikasjon for trinn 3.1.2: fortynne 5 mL av 10 mm siRNA (50 pmol) i 130 mL av redusert serum medium.
- Cellene inkuberes i 1-2 dager ved 37 ° C før analyse.
MERK: To runder med transfections og bruk av en høy siRNA / transfeksjon reagens forhold i andre runde er avgjørende for å få høy effektivitet i BRCA2 lyddemping.
- Cellene inkuberes i 1-2 dager ved 37 ° C før analyse.
4. Lyse celler for immunoblotting analyse
- Forbered frisk lysis buffer med PBS (pH 7,4) inneholdende 1% av den ikke-ioniske, ikke-denaturerende detergent Octylphenoxypolyethoxyethanol, 5 mM natriumpyrofosfat, 1 mM natriumortovanadat, 10 mM natriumfluorid, 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug / ml leupeptin, 10 ug / ml aprotinin. Hold det på is.
- Fjern mediet fra cellene og waske dem én gang med kald PBS (2 ml / brønn) i platen. For å hindre enhver PBS overføring, fjerne den fra platen.
- Tilsett 200 ul lyseringsbuffer til hver brønn.
MERK: Hvis cellene har til å bli brukt også for andre analyser, trypsineres cellene, som beskrevet i trinn 2.1 til 2.6 og resuspender cellene i passende buffer / medium i henhold til programmet som skal brukes. - Forsiktig rotere platen for å jevnt fordele lysis buffer og inkuberes i 15 min ved 4 ° C på en rotator.
- Samle cellelysat i et mikrosentrifugerør på is ved hjelp av en celleskrape.
- Sentrifuger ved 17900 xg i 25 min ved 4 ° C og samle supernatanten i et nytt rør.
- Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjoner.
5. BRCA2 immunoblotting analyse
- Klargjør kjører buffer ved å fortynne 50 ml 20x Tris-acetat SDS kjører bUffer (50 mM Tricine, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8.24) med 950 ml destillert vann.
- Preparere prøven som følger: Tilsett 15 ug av totalt cellelysat, 5 mL av 4x prøvebuffer inneholdende litium-dodecyl-sulfat ved pH 8,4, 2 pl av prøve 10x reduksjonsmiddel (0,5 M DTT), og lyseringsbuffer til et endelig volum på 20 ul.
MERK: Denne protokollen tillater påvisning av BRCA2 i normale cellelinjer også når du bruker et lavere beløp av totale proteiner (ned til 5 mikrogram). - Denaturering prøver ved 55 ° C i 10 min.
MERK: Det er viktig å bruke 55 ° C. Siden BRCA2 protein er thermo 11, høyere denaturerende temperaturer føre konsekvent tap av intakt full lengde (390 kDa) BRCA2 protein. - Sett opp elektrokammeret i henhold til produsentens instruksjoner.
- Laster prøvene og 10 ul av høy molekylvekt forhånds farget protein standard på en gel precasted (Tris-acetat 3-8%) og kjørt ved 120 V for abut 2 timer 12. Stopp elektro løp før 55 kDa blå markøren forlater precasted gel.
- Klargjør overføringsbuffer med 50 ml 20x overføringsbuffer, 100 ml 100% metanol og 850 ml vann.
- Aktiver PVDF-membran (0,45 um porestørrelse) ved bløtlegging i 100% metanol i 5 minutter, skyll med destillert vann og likevekt i overføringsbuffer i minst 5 min. Sug svampene i overføringsapparat i overføringsbuffer ved 4 ° C inntil bruk.
- Når elektro løp er over, montere sandwich i overføringen stabelen i følgende rekkefølge (bottom-up): tre svamper mettet i overføringsbuffer, en 3MM papir ark mettet i overføringsbuffer, gel, aktivert PVDF membran, en 3MM papir ark mettet i overføringsbuffer, tre svamper mettet i overføringsbuffer 13,14. Plasser stabelen inn i apparatet og overførings proteiner ved 350 mA i 4 timer ved 4 ° C eller ved 180 mA over natten ved 4 ° C.
MERK: Å være BRCA2 et meget stort protein, er det avgjørende å forlenge overføringstiden fra 1 time (som foreslått av produsenten, og de fleste overføringsprotokoller) til 4 timer eller over natten for å sikre fullstendig overføring av høymolekylære proteiner. I tillegg, på grunn av den lange overføringstiden, er det viktig å utføre blotting i et kaldt rom ved 4 ° C for å minimalisere overoppheting og lette demontering-sandwich. Halv-tørr overføringssystemer er ikke bra for overføring av store proteiner. - Etter overføring, vaskes membranen med TBS, blokkere den i 1 time ved RT i TBS-Tween 0,25% (TBS-T) som inneholdt 5% fettfri tørrmelk og sonden over natten ved 4 ° C med 30 ul anti-BRCA2 kanin polyklonalt antistoff ( 200 ug / ml), fortynnet i 9 ml TBS-T + 5% fettfri tørrmelk [1: 300 (v / v) fortynning].
- Vask membranen tre ganger (10 min hver) med TBS-T, og deretter inkuberes filteret i 1 time med 1 mL av pepperrot peroksidase-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff fortynnet i 10 ml TBS-T + 5% fettfri tørrmelk. Deretter vaskes membranen tre ganger (10 min hver) med TBS-T.
- Utfør immundeteksjon av ECL å avsløre BRCA2 protein med utvidet chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection Reagent, etter produsentens anvisninger. Visual immunochemiluminescent band på høyoppløselige ECL filmer.
- Utføre immundeteksjon med et antistoff for et husholdningsgenet, som β-tubulin (55 kDa), på det samme filteret som lasting kontrollen ved hjelp av et monoklonalt antistoff til β-tubulin fortynnet 1: 1 000 (10 ul av anti-tubulin-antistoff i 10 ml TBS-T + 5% fettfri tørrmelk) i 1 time ved RT. Vask og inkuber sekundært antistoff som beskrevet for BRCA2 (05.10 til 05.11), bortsett fra anvendelse av pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus istedenfor anti-kanin sekundært antistoff.
- Anskaffe et digitalt bilde av filmene imponerte med immunochemiluminescent band og analysere bandet intensiteten av dedikerte bildeanalyse programvare (f.eks., ImageJ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du fortsetter med et biologisk / biokjemisk analyse for å undersøke effekten av BRCA2 lyddemping på cellefunksjoner, er første skritt å bekrefte spesifisiteten av taushet ved å bruke en egge siRNA (non-måls siRNA) side om side med BRCA2 siRNA (figur 1A ). Det er viktig å utføre en andre runde med siRNA transfeksjon med en høy siRNA / transfeksjon forhold for å få en høy virkningsgrad av BRCA2 demping. Faktisk, utfører bare en runde av siRNA transfeksjon eller ved hjelp av en nedre siRNA transfeksjon forholdet i den andre runden (25 pmol av siRNA og 6 pl av transfeksjon reagens) vil resultere i lavere knockdown effektivitet (figur 1B). Det andre trinnet er å vurdere den optimale minimum tid å få det høyeste nivået av genet Slå. Avhengig av celletypen, kan dette variere mellom 24 og 48 timer etter den andre runden av siRNA transfeksjon. For eksempel, 24 hr er tilstrekkelig for Nthy skjoldbrusk-celler, men opp til 48hr er nødvendig for effektiv BRCA2 knockdown i PNT1A prostata celler (Figur 2A). BRCA2 lyddemping er ganske stabil frem til dag 7 etter den andre transfeksjon syklus (figur 2B). Av notatet denaturerende cellelysatene ved en temperatur over 55 ° C (100 ° C i 5 min), resulterer i opp til 50% tap av BRCA2-protein (figur 2C), på grunn av thermosensitivity av BRCA2 11.
Når optimal lyddemping tid er etablert, kan effekten av tap av BRCA2 protein utnyttes i flere analyser. Etter in vivo mutasjoner som forårsaker tap av funksjon av BRCA2 fremme økt følsomhet for PARP-inhibitorer, så vel som til andre kjemoterapeutiske medikamenter som forårsaker DNA-skade 15-18, er en vanlig analyse for å bestemme sensitiviteten av BRCA2 -silenced celler til PARP-inhibitor rucaparib eller oloparib. I forsøket er rapportert i figur 3, PNT1A celler utarmet of BRCA2 protein gjennom siRNA har blitt behandlet med 10 uM rucaparib i 24 timer, hvoretter celle-proliferasjon er blitt vurdert av en MTT-baserte celleproliferasjonsanalyse. Nedbryting av BRCA2 protein resulterer i en tidsavhengig reduksjon i celleformering etter rucaparib behandling (figur 3).
Figur 1. To runder med transfeksjon og høy siRNA transfeksjon reagens ratio forbedre BRCA2 lyddemping. (A) Spesifisitet av BRCA2 lyddemping ble bekreftet i Nthy celler ved immunoblotting analyse 24 timer etter den andre runden av transfeksjon, ved hjelp av egge siRNA (Ctrl) som kontroll for sammenligning av BRCA2 protein nivåer. Molekylære markører rapporteres til venstre. (B) PNT1A cellene ble utsatt for en eller to sykluser med BRCA2 sIRNA transfeksjon som beskrevet i protokollen [sykluser (#) 1 og 2] og BRCA2 protein tømming ble kvantifisert ved immunoblotting. To sykluser av transfeksjon med egge siRNA ble brukt som kontroll (Ctrl). I 2b, ble PNT1A cellene underkastet to cykler av BRCA2 siRNA transfeksjon ved hjelp av en nedre siRNA transfeksjon reagens-forholdet i den andre syklusen som en modifikasjon (25 pmol siRNA / 6 pl transfeksjon reagens). I alle tilfeller ble BRCA2 proteinnivåer analysert 48 timer etter den annen syklus. Nederst er kvantifisering av BRCA2 proteinnivåer rapportert som BRCA2 / Tubulin ratio. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Optimalisering av BRCA2 knockdown. (A) Optimal BRCA2 knockdown kan kreve 24 til 48 timer etter den annen siRNA transfeksjon syklus. To forskjellige cellelinjer (PNT1A og Nthy) ble vurdert for BRCA2 knockdown 24 timer og 48 timer etter den annen syklus siRNA transfeksjon ved immunblotanalyse. Nederst er BRCA2 protein nivåer rapportert som prosent av nivåene ved 0 timer, satt til 100. Data representerer gjennomsnittet ± SE av tre uavhengige eksperimenter. (B) BRCA2 knockdown er stabil i 7 dager. PNT1A celler ble vurdert for BRCA2 knockdown inntil 196 timer etter den annen siRNA transfeksjon syklus ved immunoblotting. Forholdet mellom BRCA2 til tubulin signal er rapportert i bunnen. (C) BRCA2 protein er thermo. Ikke-transfekterte PNT1A celler ble samlet 24 timer etter utplating (omtrent 70% konfluens) og lysert i henhold til protokollen. To alikvoter av den samme cellelysat (15 ug total protein) ble denaturert enten ved 55 ° C i 10 min eller ved 100 #176 C i 5 minutter og BRCA2 proteinnivåer ble bestemt ved immunblotting. Nederst, forholdet mellom BRCA2 til tubulin signal er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. BRCA2 stanse øker cellens følsomhet overfor PARP inhibitor rucaparib. PNT1A-celler transfektert med enten kontroll (Ctrl) eller BRCA2 siRNA ble samlet 48 timer etter transfeksjon, og sådd ut i 96-brønns plate (2000 celler / brønn). Etter 24 timer ble 10 uM rucaparib tilsatt til cellene i 24 timer, hvoretter cellene ble holdt i fravær av stoffet opp til 96 timer. Celleproliferasjon ble evaluert ved den angitte tiden ved anvendelse av MTT-analysen ved å måle absorbansen ved 550 til 690 nm. Each tid punkt representerer middelverdien ± SD for tre brønner fra et representativt eksperiment. Ctrl siRNA, blå linje, BRCA2 siRNA, rød linje. På toppen, BRCA2 protein profil i BRCA2 siRNA-transfekterte celler er rapportert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi germline mutasjoner av BRCA2-genet fører til økt risiko for flere krefttyper, inkludert kvinnelig og mannlig brystkreft, eggstokkreft, prostatakreft, kreft i bukspyttkjertelen, og føflekkreft 3,4, en rekke studier har blitt gjennomført for å forstå den biologiske funksjonen av BRCA2 protein. De fleste av disse studiene er genetisk basert hovedsakelig på grunn av tekniske problemer i å analysere et gigantisk protein som BRCA2. Metoden som beskrives her for lyddemping og analyse av BRCA2 protein ekspresjon gir et effektivt verktøy for å undersøke funksjonene i BRCA2 tumor suppressor-gen i et bredt spekter av biologiske analyser. Taushet protokollen er basert på standard siRNA transfeksjon prosedyrer ennå inneholder flere viktige modifikasjoner samt tips for vellykket og konsekvent knockdown av BRCA2. SiRNA transfeksjon protokollen er trygg, rask og effektiv, og forskjellig fra shRNA, som vanligvis gjør bruk av lentiviral vektorer, er ikke nødvendig for biologisk spesifikke fremgangsmåter og kan lett utføres i en hvilken som helst laboratorium utstyrt med en cellekultur anlegg. Likeledes har immunoblotting protokollen blitt optimalisert for effektiv detektering av et stort protein som BRCA2. Den immunoblotting protokollen er også godkjent for påvisning av rekombinant humant BRCA2 protein, heterologt uttrykt i gjærceller 9.
Flere viktige faktorer for effektiv levering av siRNA rapporteres her. De omfatter to sykluser av transfections og en høy siRNA transfeksjon reagens ratio, spesielt i andre syklus. Fravær av antibiotika før og under transfeksjon prosedyren er en annen kritisk faktor. Imidlertid eksponerer denne prosedyren celler i kultur til økt risiko for bakteriell forurensning; dermed ekstra forholdsregler bør tas for å sikre en høy standard på sterilitet på alle trinn. Det bør bemerkes at, avhengig av celletype, effektivt gen knockdown vil vanligvis krever 24-48 timer etter den annen syklus. Den nåværende metoden har den fordelen av å holde genet Slå ganske stabil i alle fall til dag 7 etter den andre syklus transfeksjon. Dette gjør det mulig å studere effektene av BRCA2 knockdown i en rekke biologiske analyser, herunder cellulær respons overfor forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter. Det er imidlertid en begrensning av den foreliggende teknikk er representert ved det faktum at eksogene siRNA-molekyler ikke er integrert i genomet, ikke kan oppnås og dermed stabil knockdown av genekspresjon. Alternativt, for å få stabil knockdown, shRNA lentiviral infeksjon kan utføres, forutsatt at laboratoriet er forberedt på ytterligere krav biosikkerhet (BSL-2 standarder ifølge NIH retningslinjer). I tillegg, når transfeksjon ikke er en anvendelig metode for å studere genfunksjon i en bestemt celletype (f.eks., T-lymfocytter), forblir bruk av celle-spesifikke betinget BRCA2 knockout-mus er den eneste alternAtive 19.
Denne metoden rapporter også flere tips for vellykket påvisning av en høy molekylvekt protein ved immunoblotting og det er hensiktsmessig for både høy og lav overflod proteiner. Spesielt, på grunn av thermosensitivity av BRCA2-proteinet, er en lavere temperatur denaturerende kritisk for optimal deteksjon, i overensstemmelse med en tidligere studie 11. Denne tekniske "lure" kan også være nyttig for andre proteiner som deteksjon ved hjelp av standard immunoblottingforsøk protokoller har blitt påvist mislykket. Vi forventer at denne metoden inneholder tips til generell gyldighet og dermed kan lette lyddemping og påvisning av mange andre utfordrende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1,000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
References
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).
- Martin, A. M., et al. Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic. J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).
- Castro, E., Eeles, R. The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer. Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).
- Vencken, P. M., et al. Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients. Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).
- Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434, 917-921 (2005).
- Arbini, A. A., et al. Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2. Oncogenesis. 2, e82 (2013).
- Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma. Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).
- Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death. Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).
- Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives. Pharm Res. 14, 853-859 (1997).
- Su, L. K., et al. Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression. Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. ' 'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Hunter, F. W., et al. Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. , (2014).
- Drew, Y., et al. Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2. J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).
- Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434, 913-917 (2005).
- Ihnen, M., et al. Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).
- Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction. Mol Cells. , (2015).
