Protocol
Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en de richtlijnen van de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Macquarie University.
1. VEP elektrode Implantatie
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg / kg) en medetomidine (0,5 mg / kg).
Opmerking: Na de inductie van de anesthesie, observeren de terugtrekking reflexen (pinch test, het hoornvlies en ooglidreflex, etc.) en hun afwezigheid als een indicatie voor een operatie te beginnen. Voortdurend toezicht dieren gedurende de operatie en beheren aanvullende anestheticum (10% van de oorspronkelijke dosis ketamine per herlading) indien de reflexen aanwezig zijn. Volwassen ratten (> 12 weken) worden gebruikt in de experimenten. - Scheer de huid van het operatiegebied.Leg het dier op een verwarmingskussen (37 ° C) tot lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. Bereid huid door topische applicatie van povidonjood. Breng chirurgische draperen. Breng actueel oogzalf om hoornvlies droog onder narcose te voorkomen. Handhaaf asepsis door steriele instrumenten.
- Maak een longitudinale incisie in de huid op de middellijn van de hoofdhuid. Wis het bindweefsel om een goede belichting van de schedel te bereiken.
- Zorgvuldig, boren kleine braam gaten handmatig met behulp van een micro handboor op 7 mm achter de bregma en 3 mm lateraal van de middellijn.
- Implant schroef elektroden door de schedel in de cortex (area 17), de cortex doordringen tot een diepte van ongeveer 0,5 mm. Implanteren een verwijzing schroef elektrode op de middellijn 3 mm rostraal van de bregma. Breng tandheelkundige cement te omsluiten en de schroeven vast te zetten (niet altijd vereist).
- Hecht de huid van het hoofd, dienen antibioticum zalf op de huid waarop het dier kan recover van narcose op een warming pad.
Opmerking: Als alternatief kunnen elektroden links worden blootgesteld, zodat de huid niet te worden heropend in elke opname. Direct na beëindiging van de operatie, maar vóór verdoving terugwinning, toedienen van een niet-steroïdaal anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID) (indien niet preoperatief toegediend) of een opioïde analgeticum. Bewaak de dieren voortdurend tot volledig herstel van de narcose en volledig ambulant. - Laat ten minste 1 week voor de dieren herstellen van de operatie vóór VEP opname.
2. Optic Nerve Injection
- Verdoven het dier, de huid voorbereiden en draperen toepassing zoals hierboven (1.1 en 1.2).
- Wordt 1 tot 1,5 cm incisie in de huid boven de baan van een willekeurig gekozen oog. Open de onderhuidse weefsel om de orbitale holte met behulp van fijne iris schaar te bereiken. Open het bindvlies en Tenon's capsule voorste onder operatiemicroscoop.
- Trek de oculairespieren en intraobital traanklieren tot ongeveer 3 mm lengte van de optische zenuw bloot te leggen. Open de dura en arachnoidea materie lagen rond de oogzenuw lengterichting met behulp van een oogheelkundig mes.
- Plaats de glazen pipet in de oogzenuw op een afstand van 2 mm achter de wereld. Het glas micropipet is een Hamilton spuit bevestigd.
- Injecteer 1% lysolecithine (0,4-1,0 pl, met 0,02% Evan's blauw die niet gevolgen myelinisatie heeft) langzaam in de zenuw ongeveer gedurende 30 sec.
- Hechtdraad de huid incisie. Breng antibiotische zalf om infectie te voorkomen. Fellow ogen kunnen worden geserveerd als interne controles voor elektrofysiologie opnames.
- Plaats de dieren op een warming pad om te herstellen van anesthesie.
3. VEP Opname
- Verdoven van het dier en de huid voor te bereiden als 1.1 en 1.2.
Opmerking: Lagere dosis verdovingsmiddelen kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische recording (ketamine 40 mg / kg en medetomidine 0,25 mg / kg). - Plaats de rat in een donkere kamer en laat het zich aanpassen aan het donker gedurende 5-30 min. In sommige gevallen kunnen ratten respectievelijk donker aangepaste O / N voor scotopic of licht aangepast voor fotopische VEP opnames 8.
- Houd de lichaamstemperatuur op 37 ± 0,5 ° C door het homoeothermic deken systeem met een rectale thermometer probe.
- Verwijden de pupillen met 1,0% tropicamide oogdruppels. Open de huid over de schedel om de pre-geplaatst in situ schroef elektroden.
- Sluit de schroef via contralaterale visuele cortex van de gestimuleerde oog en de schroef verwijzing naar de versterker. Plaats een naald elektrode in de staart als de grond. Meet en de elektrode impedantie onder de 5 kOhm behouden.
- Plaats een mini-Ganzfeld stimulator direct op de huid rond de oogleden om superieure isolatie ogen 7 voorzien. De verlichting van de stimulator moet vooraf gekalibreerddoor een fotometer.
- Lever fotische stimulatie door middel van licht knippert 100 keer bij een frequentie van 1 Hz, met lage en hoge band-pass filter instellingen van 1 en 100 Hz, respectievelijk. Het signaal sampling rate is op 5 kHz.
Opmerking: De signalen worden bemonsterd ten minste ongeveer 250-300 Hz zodat meer dan twee monsters worden genomen tijdens elke cyclus. - Hechtdraad de huid terug en houden de dieren op een warming pad om te herstellen van anesthesie. De opname kan herhaaldelijk worden opgenomen individuele dieren functionele over een bepaalde tijd te volgen.
- Aan het eindpunt, toedienen van een overdosis injectie met natriumpentobarbiton (100 mg / kg, ip) de dieren inslapen. Bevestig euthanasie door een hartstilstand, ademhalingsstilstand en de daling van de lichaamstemperatuur.
4. Tissue Voorbereiding en histologie
- Verwijder de optische zenuwen van geëuthanaseerd dieren onder de microscoop en bevestig het weefsel in 1% paraformaldehyde O / N. <li> Was het weefsel grondig met zoutoplossing. Behandel het weefsel in een automatische weefselprocessor en inbedden in paraffine. Cut secties (5-10 micrometer) met een rotatiemicrotoom.
- Incubeer secties in 0,1% fast blue oplossing zoals Luxol (in 95% ethanol) O / N bij 56 ° C. Differentiëren secties 0,05% lithiumcarbonaat voor 30 seconden en vervolgens 70% ethanol nog eens 30 sec. Tenslotte tegenkleuring in 0,1% cresyl violet oplossing 30 seconden vóór het monteren van de onderdelen. Gebruik de snelle blauwe vlekken aan myeline te identificeren in de oogzenuw 5.
Opmerking: Voor immunohistochemie studie, repareren weefsel in 1% paraformaldehyde, wassen met zoutoplossing en incubeer met 30% sucrose O / N. Insluiten weefsel in oktober inbeddingsmedium en maak cryosecties met behulp van een cryostaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduceerbare intra-zittingen VEP sporen worden getoond in figuur 1 en een significante vertraging in N1 latency kan worden gezien na de oogzenuw injectie. Gedeeltelijke nervus opticus demyelinisatie kan worden waargenomen op coupes middels Luxol fast blue kleuring 5. Figuur 2 toont een representatief gedeelte met een kleine focale gedemyeliniseerde laesie in het midden van de optische zenuw. Merk op dat doorsnede totale volume van de laesie niet vertegenwoordigen. De gedemyeliniseerde gebied kan gemeten op elke opeenvolgende dwarsdoorsnede van de zenuw naar de laesie volume door driedimensionale reconstructie afleiden. We hebben een sterke correlatie tussen latency vertraging en laesie volume met dit model in onze eerdere studies aangetoond en er was geen VEP latency vertraging in de zoutoplossing geïnjecteerd controles 5.
Aangenomen wordt dat de vroege VEP componenten na flitserverlichting stabieler 7 5. Daarom raden wij aan dat N1 latency moet worden gebruikt voor data-analyse en voor longitudinale VEP bewaking bij de beoordeling van de gevolgen van de remyelinisatie-therapieën. De amplitude van VEP, hoewel variabeler in vergelijking met de latentie, een betere indicatie van de functie van de axonen in de oogzenuw 6. Elektro-gebaseerde scaling kan worden beschouwd voor de amplitude analyse 9.
Figuur 1. VEP vertraging na de oogzenuw injectie. Vertegenwoordiger VEP sporen van een individu rat voor en 2 dagen na de oogzenuw micro-injectie (0,8 ul lysolecithine). VEP opnames werden herhaald op de elke dag (intra-zittingen sporen tonenn in dezelfde kleur) voor de reproduceerbaarheid van deze VEP opnameprotocol tonen. (Verticale schaal bar: 10 mV; horizontale schaal bar: 10 msec). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Demyelinisatie in de oogzenuw. Representatieve dwarsdoorsnede van de optische zenuw uit een rat na lysolecithine micro-injectie. De myeline component is gekleurd blauw met behulp Luxol snel blauw. Een kleine focale laesie demyelinisatie is te zien in het midden van de sectie. Gedemyeliniseerde gebied kan worden gemeten aan de lengterichting seriële doorsneden aan de laesie volume in een drie-dimensionale schaal schatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Ophthalmic Research Institute of Australia (ORIA). Wij danken Prof. Algis Vingrys en Dr. Bang Bui, Universiteit van Melbourne, in eerste instantie voor ons te helpen om de VEP opname techniek te ontwikkelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
