Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec le Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et les lignes directrices de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research, et ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université de Macquarie.
1. VEP implantation d'électrodes
- Anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de kétamine (75 mg / kg) et la médétomidine (0,5 mg / kg).
Remarque: Après l'induction de l'anesthésie, observer les réflexes de retrait (test de pincement, réflexe cornéen et palpébrale, etc.) et leur absence comme une indication pour commencer la chirurgie. Surveiller continuellement les animaux tout au long de la chirurgie et administrer anesthésique supplémentaire (10% de la dose de kétamine initial par top-up) si les réflexes sont présents. Des rats adultes (> 12 semaines) sont utilisés dans les expériences. - Raser la peau de la zone chirurgicale.Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 ° C) afin de maintenir la température du corps pendant l'intervention chirurgicale. Préparer la peau grâce à l'application topique de povidone-iode. Appliquer drapage chirurgical. Appliquer une pommade ophtalmique topique pour prévenir la sécheresse de la cornée sous anesthésie générale. Maintenir l'asepsie en utilisant des instruments stériles.
- Faire une incision longitudinale de la peau sur la ligne médiane de la peau de la tête. Désactivez le tissu conjonctif pour obtenir une bonne exposition du crâne.
- Soigneusement, percer de petits trous de bavures manuellement à l'aide d'une perceuse à main micro à 7 mm derrière le bregma et 3 mm latéralement de la ligne médiane.
- Implant à vis des électrodes à travers le crâne dans le cortex (zone 17), pénétrant dans le cortex à une profondeur d'environ 0,5 mm. Implanter une électrode de vis de référence sur la ligne médiane 3 mm rostral au bregma. Appliquer ciment dentaire pour envelopper et fixer les vis (pas toujours nécessaire).
- Suturer la peau de la tête, administrer une pommade antibiotique sur la peau et permettre aux animaux de recover de l'anesthésie sur un coussin chauffant.
Remarque: vous pouvez électrodes peuvent être laissés exposés, de sorte que la peau n'a pas besoin d'être rouvert dans chaque enregistrement. Immédiatement après la cessation de la chirurgie, mais avant la récupération anesthésique, administrer un médicament non-stéroïdiens anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) (si pas administré en pré-opératoire) ou un analgésique opioïde. Surveiller les animaux constamment jusqu'à ce que le rétablissement complet de l'anesthésie et entièrement ambulatoire. - Prévoyez au moins 1 semaine pour les animaux de récupérer de la chirurgie avant l'enregistrement VEP.
2. Optic Nerve Injection
- Anesthésier l'animal, préparer la peau et appliquer drapage comme ci-dessus (1.1 et 1.2).
- Ajouter un 1- à 1,5 cm incision dans la peau au-dessus de l'orbite de l'oeil choisi de façon aléatoire. Ouvrez le tissu sous-cutané pour atteindre la cavité orbitaire en utilisant l'iris ciseaux fins. Ouvrir la conjonctive et de la partie antérieure de la capsule de Tenon sous le microscope opératoire.
- Rétracter le extraoculaireles muscles et les glandes lacrymales intraobital pour exposer environ 3 mm de longueur du nerf optique. Ouvrez la dure-mère et l'arachnoïde matière couches autour du nerf optique en utilisant une lame longitudinalement ophtalmique.
- Insérez la pipette en verre dans le nerf optique à une distance de 2 mm en arrière du globe. La micropipette en verre est fixée à une seringue Hamilton.
- Injecter 1% lysolécithine (0,4 à 1,0 pi, avec 0,02% de bleu d'Evan qui n'a pas d'effets sur la myélinisation) lentement dans le nerf environ sur une période de 30 sec.
- Suturer l'incision de la peau. Appliquer une pommade antibiotique pour prévenir l'infection. Compagnons yeux peuvent être servis que des contrôles internes pour les enregistrements électrophysiologiques.
- Placez les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie.
3. VEP Enregistrement
- Anesthésier l'animal et de préparer la peau en tant que 1,1 et 1,2.
Remarque: Une dose réduite d'anesthésiques peut être utilisé pour reco électrophysiologiquerding (kétamine à 40 mg / kg de médétomidine et 0,25 mg / kg). - Placez le rat dans une pièce sombre et lui permettre d'adapter à l'obscurité pendant 5 - 30 min. Dans certains cas, les rats peuvent être respectivement O adapté foncé / N pour scotopique ou de lumière adapté pour les enregistrements photopique de VEP 8.
- Maintenir la température du corps à 37 ± 0,5 ° C par le système de couverture homéothermes avec une sonde de thermomètre rectal.
- Dilater les pupilles avec 1,0% tropicamide gouttes oculaires. Ouvrir la peau sur le crâne pour accéder à la pré-électrodes placés dans de vis situ.
- Connectez la vis sur le cortex visuel de l'oeil controlatéral stimulée et la vis de référence à l'amplificateur. Insérez une électrode de l'aiguille dans la queue que le sol. Mesurer et maintenir l'impédance de l'électrode en dessous de 5 kQ.
- Placer un stimulateur mini-Ganzfeld directement sur la peau autour des paupières pour assurer une isolation supérieure 7 de l'oeil. L'illumination du stimulateur doit être étalonné au préalablepar un photomètre.
- Livrer la stimulation lumineuse à travers clignote 100 fois à une fréquence de 1 Hz, avec des réglages de filtre passe-bande basse et haute de 1 et 100 Hz, respectivement. Le taux d'échantillonnage du signal est à 5 kHz.
Remarque: Les signaux doivent être échantillonnés au moins à environ 250 à 300 Hz pour assurer que plus de deux échantillons sont prélevés au cours de chaque cycle. - Suturer la peau du dos et de garder les animaux sur un coussin chauffant pour récupérer de l'anesthésie. L'enregistrement peut être enregistrée de façon répétée sur des animaux individuels pour surveiller les changements fonctionnels sur une période de temps.
- À la fin du point, administrer une injection surdose de pentobarbital de sodium (100 mg / kg, ip) pour euthanasier l'animal. Confirmez l'euthanasie par arrêt cardiaque, arrêt respiratoire et la diminution de la température du corps.
4. Préparation des tissus et histologie
- Retirer les nerfs optiques à partir d'animaux euthanasiés au microscope et fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde O / N. <li> Laver le tissu à fond avec une solution saline. Traiter le tissu dans un processeur automatique de tissu et l'intégrer dans de la paraffine. sections coupées (5 - 10 um) à l'aide d'un microtome rotatif.
- Incuber les coupes dans 0,1% de solution de bleu rapide tels que Luxol (dans 95% d'éthanol) O / N à 56 ° C. Différencier les sections de carbonate de lithium à 0,05% pendant 30 secondes et ensuite éthanol à 70% pendant 30 sec. Enfin, contre-colorer dans une solution de violet de crésyl à 0,1% pendant 30 secondes avant de monter les sections. Utilisez la coloration au bleu rapide pour identifier la myéline dans le nerf optique 5.
Remarque: Pour l'étude d'immunohistochimie, fixer le tissu dans 1% de paraformaldehyde, laver avec une solution saline et incuber avec 30% de saccharose O / N. Incluez le tissu dans l'OCT milieu d'inclusion et de faire cryosections l'aide d'un cryostat.
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Representative Results
Traces de VEP intrasessions reproductibles sont présentés dans la figure 1 et un retard important dans la latence N1 peuvent être observés après l'injection du nerf optique. Lésions du nerf optique partielles de démyélinisation peuvent être observées sur des coupes histologiques utilisant Luxol coloration au bleu rapide 5. La figure 2 montre une section représentative avec une petite lésion démyélinisée focal dans le centre du nerf optique. Notez que section ne représente pas le volume total de lésion. La zone démyélinisée peut être mesurée sur chaque section consécutive du nerf de déduire le volume de la lésion à l'aide de reconstruction tridimensionnelle. Nous avons démontré une forte corrélation entre le délai de latence et le volume de la lésion en utilisant ce modèle dans nos études précédentes et il n'y avait pas de temps de latence VEP retard dans les commandes de solution saline injectée 5.
On croit que les composants de VEP début suivantes l'éclairage au flash sont plus stables 7 5. Par conséquent, nous recommandons que latence N1 doit être utilisé pour l'analyse des données et pour la surveillance de VEP longitudinale pour évaluer l'impact des thérapies remyélinisantes. L'amplitude de VEP, bien plus variable par rapport à la latence, est plus représentatif de la fonction des axones dans le nerf optique 6. Mise à l'échelle en fonction électroencéphalogramme-peut être considéré pour l'analyse d'amplitude 9.
Figure 1. VEP délai après l'injection du nerf optique. Représentant VEP retrace à partir d'un rat individuel avant et 2 jours après la microinjection du nerf optique (0,8 pi de lysolécithine). VEP enregistrements ont été répétées sur le chaque jour (traces de intrasessions sont shown de la même couleur) pour démontrer la reproductibilité de ce protocole d'enregistrement VEP. (Verticale barre d'échelle: 10 mV; barre d'échelle horizontale: 10 ms). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La démyélinisation dans le nerf optique. En coupe représentant du nerf optique à partir d'un rat après lysolécithine microinjection. Le composant de la myéline est coloré bleu en utilisant luxol bleu rapide. Une petite lésion focale de démyélinisation peut être vu dans l'axe de la section. Zone démyélinisée peut être mesurée sur des sections longitudinales de série pour estimer le volume de la lésion à une échelle en trois dimensions. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par l'Institut de recherche en ophtalmologie de l'Australie (ORIA). Nous remercions Prof. Algis Vingrys et le Dr Bang Bui, Université de Melbourne, pour d'abord nous aider à développer la technique d'enregistrement VEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
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