Protocol
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state condotte in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici e gli orientamenti della Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e sono stati approvati dalla Animal Comitato Etico della Macquarie University.
1. VEP elettrodi impianto
- Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg / kg) e medetomidina (0,5 mg / kg).
Nota: Dopo l'induzione dell'anestesia, osservare i riflessi di prelievo (test pizzico, riflessi cornea e della palpebra, ecc) e la loro assenza come indicazione per iniziare un intervento chirurgico. Monitorare continuamente gli animali in tutta la chirurgia e amministrare anestetico supplementare (10% della dose di ketamina iniziale per top-up) se sono presenti i riflessi. Ratti adulti (> 12 settimane) sono usati negli esperimenti. - Radere la pelle della zona chirurgica.Posto l'animale su un blocco di riscaldamento (37 ° C) per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. Preparare la pelle attraverso l'applicazione topica di povidone-iodio. Applicare drappeggio chirurgica. Applicare attualità pomata oftalmica per prevenire la secchezza della cornea in anestesia generale. Mantenere asepsi utilizzando strumenti sterili.
- Effettuare una incisione cutanea longitudinale sulla linea mediana della pelle testa. Eliminare il tessuto connettivo, per ottenere una buona esposizione del cranio.
- Con cautela, praticare dei piccoli fori radica manualmente utilizzando un trapano micro mano a 7 mm dietro il bregma e 3 mm lateralmente alla linea mediana.
- Elettrodi vite implantare attraverso il cranio nella corteccia (area 17), penetrando la corteccia ad una profondità di circa 0,5 mm. Impiantare un elettrodo di vite di riferimento sulla linea mediana 3 mm rostrale al bregma. Applicare cemento dentale di racchiudere e fissare le viti (non sempre necessario).
- Suturare la pelle della testa, amministrare pomata antibiotica sulla pelle e consentire all'animale di recover dall'anestesia su un blocco di riscaldamento.
Nota: In alternativa, gli elettrodi possono essere lasciati esposti, in modo che la pelle non deve essere riaperto in ogni registrazione. Immediatamente al momento della cessazione di un intervento chirurgico, ma prima del recupero anestetico, somministrare un farmaco non steroideo anti-infiammatori (FANS) (se non somministrato in fase preoperatoria) o un analgesico oppiaceo. Monitorare gli animali costantemente fino al pieno recupero da anestetico e completamente ambulatoriale. - Lasciare almeno 1 settimana per gli animali di recuperare da un intervento chirurgico prima della registrazione VEP.
2. Optic Nerve iniezione
- Anestetizzare l'animale, preparare la pelle e applicare drappeggio come sopra (1.1 e 1.2).
- Fare un 1 a 1,5 cm incisione nella pelle sopra l'orbita di un occhio selezionata casualmente. Aprire il tessuto sottocutaneo per raggiungere la cavità orbitale con iris sottili forbici. Aprire la congiuntiva e la capsula di Tenon anteriore sotto il microscopio operatorio.
- Ritrarre la extraocularemuscoli e ghiandole lacrimali intraobital per esporre circa 3 mm di lunghezza del nervo ottico. Aprire la dura madre e materia aracnoide strati attorno al nervo ottico longitudinalmente utilizzando una lama oftalmica.
- Inserire la pipetta di vetro nel nervo ottico ad una distanza di 2 mm posteriormente al globo. La micropipetta di vetro è attaccato ad una siringa Hamilton.
- Iniettare 1% lisolecitina (0,4-1,0 microlitri, con 0,02% di blu di Evan che non ha effetti sulla mielinizzazione) lentamente nel nervo circa per un periodo di 30 sec.
- Suturare la incisione cutanea. Applicare una pomata antibiotica per prevenire l'infezione. Occhi Compagni possono essere serviti come controlli interni per le registrazioni elettrofisiologiche.
- Mettere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia.
3. VEP registrazione
- Anestetizzare l'animale e preparare la pelle come 1.1 e 1.2.
Nota: Lower dose di anestetici può essere utilizzato per reco elettrofisiologicarding (ketamina 40 mg / kg e medetomidina 0,25 mg / kg). - Mettere il topo in una stanza buia e permettono di adattarsi al buio per 5-30 min. In alcuni casi, i ratti possono rispettivamente essere scuro O adattato / N per scotopica o la luce adatta per le registrazioni fotopica VEP 8.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 ° C dal sistema coperta homoeothermic con una sonda termometro rettale.
- Dilatare le pupille con 1,0% tropicamide collirio. Aprire la pelle sopra il cranio per accedere al pre-posto in elettrodi vite situ.
- Collegare la vite sulla corteccia visiva controlaterale dell'occhio stimolata e la vite riferimento all'amplificatore. Inserire un elettrodo ago nel coda come la terra. Misurare e mantenere l'impedenza dell'elettrodo sotto 5 kΩ.
- Mettere uno stimolatore mini-Ganzfeld direttamente sulla pelle intorno alle palpebre per fornire l'isolamento occhio superiore 7. L'illuminazione dello stimolatore necessario calibrare anticipoda un fotometro.
- Invia stimolazione luminosa attraverso lampi di luce 100 volte alla frequenza di 1 Hz, con impostazioni del filtro passa-banda bassa e alta di 1 e 100 Hz, rispettivamente. La frequenza di campionamento del segnale è a 5 kHz.
Nota: I segnali devono essere campionati almeno a circa 250-300 Hz per garantire che più di due campioni vengono raccolti durante ogni ciclo. - Suturare la pelle posteriore e tenere gli animali su un blocco di riscaldamento di recuperare da anestesia. La registrazione può essere ripetutamente registrati su singoli animali per monitorare le variazioni funzionali per un periodo di tempo.
- Al punto finale, somministrare una iniezione sovradosaggio di pentobarbitone sodio (100 mg / kg, ip) euthanize all'animale. Conferma eutanasia arresto cardiaco, arresto respiratorio e diminuzione della temperatura corporea.
4. Preparazione del tessuto e Istologia
- Rimuovere i nervi ottici da animali eutanasia sotto il microscopio e fissare il tessuto in 1% paraformaldeide O / N. <li> Lavare accuratamente i tessuti con soluzione fisiologica. Trattare il tessuto in un processatore automatico ed incorporare in paraffina. Sezioni tagliate (5-10 micron) utilizzando un microtomo rotativo.
- Incubare sezioni 0,1% soluzione blu veloce come il Luxol (nel 95% di etanolo) O / N a 56 ° C. Differenziare le sezioni a 0,05% di carbonato di litio per 30 sec e poi 70% di etanolo per altri 30 sec. Infine, colorazione di contrasto in soluzione violetto cresolo 0,1% per 30 sec prima di montare sezioni. Utilizzare la veloce colorazione blu per identificare mielina nel nervo ottico 5.
Nota: per studio immunoistochimica, fissare il tessuto in 1% paraformaldeide, lavare con soluzione fisiologica e incubare con il 30% di saccarosio O / N. Tessuto Incorpora in OCT mezzo di inclusione e fare criosezioni utilizzando un criostato.
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Representative Results
Riproducibili PEV tracce intra-sessione sono mostrati in Figura 1 e un significativo ritardo nella latenza N1 possono essere osservati dopo l'iniezione nervo ottico. Lesioni del nervo ottico parziali di demielinizzazione può essere osservato su sezioni istologiche utilizzando Luxol veloce colorazione blu 5. La Figura 2 mostra una sezione rappresentativa con una piccola lesione demyelinated focale nel centro del nervo ottico. Si noti che la sezione trasversale non rappresenta il volume totale di lesione. L'area demyelinated può essere misurata su ciascuna sezione consecutivi del nervo dedurre il volume della lesione utilizzando ricostruzione tridimensionale. Abbiamo dimostrato una forte correlazione tra il ritardo di latenza e il volume delle lesioni utilizzando questo modello in nostri studi precedenti e non c'era VEP ritardo di latenza nei controlli saline a iniezione 5.
Si ritiene che i componenti PEV primi seguenti l'illuminazione flash sono più stabili 7 5. Pertanto, si consiglia di N1 latenza dovrebbe essere utilizzato per l'analisi dei dati e per il monitoraggio VEP longitudinale nel valutare l'impatto delle terapie rimielinizzanti. L'ampiezza di VEP, anche se più variabile rispetto alla latenza è più indicativo della funzione degli assoni del nervo ottico 6. Ridimensionamento basato Elettroencefalogramma-può essere presa in considerazione per l'analisi di ampiezza 9.
Figura 1. VEP ritardo dopo l'iniezione del nervo ottico. Rappresentante VEP traccia da un topo individuale prima e 2 giorni dopo la microiniezione nervo ottico (0,8 ml lisolecitina). Registrazioni VEP sono state ripetute in ogni giorno (intra-sessione tracce sono spettacolon dello stesso colore) per dimostrare la riproducibilità di questo protocollo di registrazione VEP. (Barra della scala verticale: 10 mV; bar scala orizzontale: 10 msec). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Demielinizzazione nel nervo ottico. Rappresentante sezione del nervo ottico da un ratto dopo Lysolecithin microiniezione. Il componente mielina è macchiato blu utilizzando Luxol blu veloce. Una piccola lesione focale di demielinizzazione può essere visto nel centro della sezione. Zona demielinizzati può essere misurata su sezioni seriali longitudinali per stimare il volume delle lesioni in una scala tridimensionale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal oftalmica Research Institute of Australia (ORIA). Ringraziamo il Prof. Algis Vingrys e il dottor Bang Bui, Università di Melbourne, per primo ci aiuta a sviluppare la tecnica di registrazione VEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
