Protocol
Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i samsvar med den australske Code of Practice for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål og retningslinjene for ARVO Statement for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research, og ble godkjent av Animal Ethics Committee of Macquarie University.
1. VEP elektrode Implantasjon
- Bedøve dyret med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (75 mg / kg) og medetomidin (0,5 mg / kg).
Merk: Etter innledning av anestesi, observere abstinens reflekser (klype testen, hornhinnen og palpebral refleks, etc.) og deres fravær som en indikasjon for å starte operasjonen. Kontinuerlig overvåke dyr i hele kirurgi og administrere ekstra bedøvende stoff (10% av opprinnelig ketamin dose per top-up) hvis refleksene er til stede. Voksne rotter (> 12 uker) blir brukt i forsøkene. - Barbere huden på det kirurgiske området.Plasser dyret på en varmepute (37 ° C) for å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen. Forbered huden gjennom lokal applikasjon av povidon-jod. Påfør kirurgisk drapering. Påfør øyedråpeprodukt salve for å hindre at hornhinnen tørrhet under narkose. Opprettholde asepsis ved hjelp av sterile instrumenter.
- Foreta en langsgående snitt i huden på midtlinjen av hodehuden. Fjerne bindevevet for å oppnå god eksponering av hodeskallen.
- Nøye, bore små grad hull manuelt ved hjelp av en mikro hånd drill på 7 mm bak bregma og 3 mm lateralt for midtlinjen.
- Implantatskrue elektroder gjennom skallen inn i cortex (område 17), trenger inn i cortex til en dybde på omtrent 0,5 mm. Implantere en referanseelektrode skrue på midtlinjen 3 mm rostralt til bregma. Påfør dental sement til encase og fikse skruene (ikke alltid nødvendig).
- Suturer huden på hodet, administrere antibiotisk salve på huden, og at dyret kan recover fra anestesi på en oppvarming pad.
Merk: Alternativt kan elektroder stå eksponert, slik at huden ikke trenger å bli gjenåpnet i hvert opptak. Umiddelbart etter avslutning av operasjonen, men før bedøvelse utvinning, gi et ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID) (hvis ikke administreres pre-operativt) eller et opioid analgetikum. Overvåk dyrene hele tiden til full gjenoppretting fra narkosen og fullt oppegående. - La det være minst en uke for dyrene å komme seg etter operasjonen før VEP opptaket.
2. Optic Nerve Injection
- Bedøve dyret, forberede huden og påfør drapering som ovenfor (1.1 og 1.2).
- Foreta en 1- til 1,5-cm innsnitt i huden over banen til et tilfeldig valgt øyet. Åpne underhud å nå orbital hulrom hjelp av gode iris saks. Åpne konjunktiva og fremre Tenon sin kapsel under drifts mikroskop.
- Trekke extraocularmuskler og intraobital tårekjertlene til å eksponere ca 3 mm lengde på synsnerven. Åpne dura og arachnoid uansett lag rundt synsnerven lengderetningen ved hjelp av en oftalmisk blad.
- Sett glasset pipette inn i synsnerven i en avstand på 2 mm posteriort for kloden. Glasset mikropipette er festet til en Hamilton-sprøyte.
- Injiser 1% lysolecitin (0,4 til 1,0 mL, med 0,02% Evans blå som ikke har effekt på myelinisering) sakte inn i det nerve omtrent over en periode på 30 sek.
- Sutur huden snittet. Påfør antibiotisk salve for å hindre smitte. Andre øyne kan serveres som interne kontroller for elektrofysiologi opptak.
- Plassere dyrene på en oppvarming pad for å gjenopprette fra anestesi.
3. VEP Recording
- Bedøve dyret og forberede huden som 1.1 og 1.2.
Merk: lavere dose av bedøvelsesmidler kan benyttes for elektro Recording (ketamin 40 mg / kg og medetomidin 0,25 mg / kg). - Plasser rotte i et mørkt rom og la den tilpasse seg mørket i 5 - 30 min. I noen tilfeller rotter kan henholdsvis være mørk tilpasset O / N for scotopic eller lett tilpasses for photopic VEP innspillinger 8.
- Opprettholde kroppstemperaturen ved 37 ± 0,5 ° C ved homoeothermic teppe system med en rektal termometer sonde.
- Dilate elevene med 1,0% tropikamid øyedråper. Åpne huden over skallen for å få tilgang til pre-plassert in situ skrue elektroder.
- Koble skruen over kontralaterale visuelle cortex av stimulert øyet og referanse skruen til forsterkeren. Stikker en nål-elektrode inn i halen i bakken. Mål og opprettholde impedansen under lektroden 5 kQ.
- Plasser en mini-ganzfeld stimulator direkte på huden rundt øyelokkene å gi overlegen øye isolasjon 7. Belysningen av stimulator trenger å bli kalibrert på forhåndav en fotometer.
- Lever photic stimulering gjennom lys blinker 100 ganger ved en frekvens på 1 Hz, med lave og høye båndpassfilteret på 1 og 100 Hz, henholdsvis. Signalet samplingsfrekvens er på 5 kHz.
Merk: Signaler skal samples i det minste ved omkring 250 til 300 Hz for å sikre at mer enn to Prøver samles i løpet av hver syklus. - Sutur huden tilbake og holde dyr på en oppvarming pad for å gjenopprette fra anestesi. Opptak kan gjentatte ganger tatt opp i individuelle dyr for å overvåke funksjonelle endringer over en tidsperiode.
- Ved endepunktet, administrere en overdose injeksjon av natriumpentobarbiton (100 mg / kg, ip) for å avlive dyret. Bekreft dødshjelp ved hjertestans, respirasjonsstans og reduksjon av kroppstemperaturen.
4. Vevspreparering og histologi
- Fjern de optiske nervene fra avlives dyrene under mikroskopet og fikse vevet i 1% paraformaldehyde O / N. <li> Vask vevet grundig med saltvann. Behandle vev i en automatisk prosessor vev og legge i parafin. Snittavsnitt (5 - 10 um) ved hjelp av en roterende mikrotom.
- Inkuber seksjoner i 0,1% fast blå løsning som Luxol (i 95% etanol) O / N ved 56 ° C. Skille delene på 0,05% litiumkarbonat i 30 sekunder og deretter 70% etanol i en annen 30 sek. Endelig counterstain i 0,1% cresylfiolett løsning i 30 sek før montering av delene. Bruk rask blå flekker å identifisere myelin i synsnerven 5.
Merk: For immunhistokjemi studie, fikse vev i 1% paraformaldehyde, vask med saltvann og inkuber med 30% sukrose O / N. Embed vev i oktober innstøpningsmediet og gjøre frysesnitt ved hjelp av en kryostat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduserbare intra-sesjoner VEP traser er vist i figur 1, og en betydelig forsinkelse i N1 latens kan sees etter synsnerven injeksjon. Partielle synsnerven lesjoner av demyelinisering kan observeres på histologiske snitt under Luxol fast blue-farging 5. Figur 2 viser et representativt snitt med en liten fokal demyelinerte lesjon i sentrum av synsnerven. Legg merke til at tverrsnittet ikke representerer totalt volum på lesjon. Den demyelinerte Området kan måles på hver påfølgende tverrsnitt av nerve å utlede lesjonen volumet ved hjelp av tredimensjonal rekonstruksjon. Vi har vist en sterk sammenheng mellom ventetid forsinkelse og lesjonsvolumet bruke denne modellen i våre tidligere studier, og det var ingen VEP latency forsinkelse i saltvann-injisert kontroller fem.
Det antas at tidlige VEP komponenter Følgende blitsbelysningen er mer stabile 7 5. Derfor anbefaler vi at N1 ventetid skal brukes for dataanalyse og for langsgående VEP overvåking i å vurdere virkningen av remyelinating terapier. Amplituden av VEP, selv om flere variable i forhold til ventetid, er mer indikativ for funksjon av aksonene i synsnerven 6. Elektroencefalogram basert skalering kan bli vurdert for amplitude analyse 9.
Figur 1. VEP opphold etter synsnerven injeksjon. Representant VEP spor fra en enkeltperson rotte før og to dager etter synsnerven mikroinjeksjon (0,8 mL lysolecitin). VEP opptakene ble gjentatt på hver dag (intra-sesjoner spor er showetN i samme farge) for å demonstrere reproduserbarheten av denne VEP opptak protokollen. (Vertikal skala bar: 10 uV, horisontal skala bar: 10 millisekunder). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Demyelinisering i synsnerven. Representativt tverrsnitt av synsnerven fra en rotte etter lysolecitin mikroinjeksjon. Myelinet komponenten er farget blå ved hjelp Luxol fort blå. En liten fokal lesjon av demyelinisering kan ses i midten av seksjonen. Demyelinerte området kan måles på langsgående serie tverrsnitt å anslå lesjonen volum i en tre-dimensjonal skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Ophthalmic Research Institute of Australia (ORIA). Vi takker Prof. Algis Vingrys og Dr. Bang Bui, Universitetet i Melbourne, for i utgangspunktet å hjelpe oss å utvikle VEP opptaksteknikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
