Abstract
마우스 정자의 분화는 그대로 게놈과 수컷 생식 기능의 제조를위한 하나의 중요한 과정이 다음 세대로 전달 될 것이다. 지금까지, 이러한 형태 학적 변화의 분자 연구는 후속 분석을위한 spermatid 분화 이러한 중요한 단계의 적절한 분리를 가능하게하는 방법의 결여에 의해 방해되어왔다. 유동 세포 계측법을 사용하여 이러한 세포의 적절한 게이트에서 이전 시도 때문에 염색질 리모델링을받은 정자의 DNA 형광의 독특한 증가로 어려웠을 수있다. 이러한 관찰에 기초하여, 우리는 에탄올로 고정 마우스 정자 네 개체군의 재현성 정화를 허용 방식 계측법 단순 흐름의 세부 사항을 제공하는, 각각의 핵 리모델링 과정에서 다른 상태를 나타내는. 인구 농축 단계 특정 마커와 형태 criterions에를 사용하여 확인할 수있다. 정자 정제 게놈과 proteom 위해 사용될 수있다IC는 분석한다.
Protocol
동물 보호는 셔 브룩 대학 동물 관리 및 사용위원회에 따라이었다.
1. 튜브 준비
- 셀 소팅 전날, 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 열 활성화 된 우 태아 혈청 (FBS) 1-2 mL를 넣고 15 mL 및 50 mL의 폴리 프로필렌 원추형 튜브에 관한 것이다.
중요한 단계 : 프로토콜에서 사용되는 모든 튜브가 코팅 된 것을 확인합니다.
참고 : FBS 코팅 튜브 벽에 달라 붙는 세균 세포를 방지 할 수 있습니다. - 천천히 튜브를 균일하게 회전을 사용하여 코트 4 ° C에서 반전에 의해 O / N을 섞는다.
- 다음 날, 경사에 의해 코팅 된 튜브에서 FBS를 제거합니다.
- * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
- 라운드 5 ML의 폴리 프로필렌 정제 된 세포를 수집하는 데 사용 하단 튜브 FBS (약 100 ~ 200 μL)의 작은 잔류 볼륨을 남겨주세요.
- * 중요한 단계 : 5 ML의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 및 셀 제조에 사용 (15)과 50 ㎖ 튜브 (프로토콜이 2.11에 2.1 단계) 완전히 패닝 (측면 스트림 즉, 부정확 편차)을 방지하기 위해 FBS의 비워되어 있는지 확인합니다. FBS를 제거하기 위해 P200 피펫을 사용합니다.
2. 휴대 준비
- O를 CO 2 질식 이어 2 / 이소 플루 란 (당시 2 %로 유지 5 %에서 유도)를 사용하여 마취 한 남성 마우스를 희생.
- 소비세 및 디 캡슐 모두 고환과 1.5 ML 튜브로 버퍼를 정렬 500 μL에 작은 가위로 말하다.
- 그대로 100-1,000 μL 팁과 후 정액을 운반하는 최초의 잘린 100-1,000 μL 팁과 1.5 ML 튜브에 부드러운 상하 피펫으로 세관,과에서 세척 생식 세포.
- 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 하나의 여과 공정에 의해 파편과 덩어리를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브 이전에 여과 액을 수집iously 1 단계에서 FBS로 코팅.
- 이전에 1 단계에서 코팅 된 15 ML 원뿔 튜브에 총 3 ㎖의 볼륨 및 전송 여과까지 버퍼를 정렬 한 번 필터를 씻으십시오.
- 0.8 mM의 EDTA의 최종 농도를 얻도록 50 mM의 EDTA 세포 현탁액의 pH를 8 밀리 리터당 (3 ㎖, 48 μL)의 16 μL를 추가한다.
- 생식 세포를 해결하려면, 천천히 우유 정지를 만들어 부드러운 교반 10ml를 피펫 (낮은 속도로 소용돌이)를 사용하여 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 3 볼륨을 추가합니다.
중요한 단계 : 에탄올을 천천히 첨가 세포 제제의 무결성을 유지하는 것이 중요하고 중요하다. 우리는 빠른 에탄올 첨가 효율 정렬 주요한 감소의 결과로 세포 용해를 유발한다는 지적. 3 ml의 세포 현탁액의 경우, 에탄올의 9 ㎖를 약 1 분으로 첨가되어야한다. - 반전에 의해 가끔 혼합 15 분 동안 얼음에 세포를 품어.
- 원심 분리기 세포 5 분 800 XG에 서스펜션과 맑은 제거상층 액.
- 부드럽게 정렬 버퍼 2 ㎖에 고정 생식 세포를 재현 탁.
- SYTO16 DNA 염료 (DMSO 1 mM의 용액)의 4 μl를 추가하고 (빛으로부터 보호) 적어도 30 분 동안 품어.
주 : 최상의 정렬 결과는 쉽게 정자의 고도로 압축 된 핵에 도입되는 DNA 투과성 염료이므로 SYTO16를 사용하여 얻어진다.
3. 세포 분류기는 설정
참고 : 여기, 4 레이저 (405 nm의 - 보라색, 488 nm의 - 블루, 561 nm의 - 노란색 - 녹색, 633 nm의 - 빨강) 20 매개 변수 BDFACSAria III 세포 분류기 사용됩니다. BD FACSDiva 6.1.3 소프트웨어는 데이터를 시각화 및 분석하는 데 사용된다. 설정이 사용 분류기의 종류에 따라 달라질 수있다.
- 유체 역학 종료 절차 (소프트웨어의 "사이토"메뉴) 분류 이전시 칼집 유체로 70 % 에탄올을 실행하여 FACS 분류기를 소독. 소프트웨어의 도구 모음에서 "사이토"를 선택하고 "유체 쉬를 선택. "를 utdown 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다.
- 제조 및 수정 및 오염물을 제거하기 위하여 0.22 μm의 필터로 1X PBS 필터. 탱크 내부의 상부에 용접선에 칼집 탱크를 채우기.
- 소프트웨어를 시작하고 로그인합니다. 이전에 정렬에 적어도 30 분 동안 레이저를 따뜻하게 외과 분류기를 시작합니다. 유체 역학에서 에탄올을 세척하는 두 유체 시작 프로세스를 실행합니다. 소프트웨어의 도구 모음에서 "사이토"를 선택하고 "유체 시작"을 선택합니다. 프로세스에 의해 언급 된 단계를 수행합니다.
참고 :이 정상 칼집 유체 (1X PBS)와 유체 공학을 복원합니다. - 정렬 블록과 증류수로 편향 판을 청소하고 철저하게 그들을 건조. 초음파 욕에서 2 분 동안 증류수 튜브에 넣고 100 ㎛ 노즐을 초음파 처리. 철저하게 노즐을 닦습니다.
- 흐름 셀에 100 μm의 노즐을 삽입하고 12 노즐 잠금 레버를 시계 방향으로 돌립니다시간 위치. 20 PSI에 칼집 압력을 설정합니다.
- 스트림의 전원을 켜고 (약 30) 주파수에 대한 목표 값을 얻기 위해 진폭을 조정, 1 (150의 주위에) 삭제하고 (12 정도) 갭과 안정적인 방울 breakoff 패턴을 (몇 위성 방울) 설정합니다. 감쇠를 끕니다.
- 스트림이 직선이고 정렬 블록의 각도를 변경하여 폐기물 흡입기의 중심 안타 있는지 확인합니다. 참고 : 10 PSI에서 130 μm의 노즐도 테스트하고 명백한 차이는 발견되지 않았다.
- 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 적색 -77.39, 37.33 및 -39.85 0으로 설정 레이저 지연.
- 노란색 - 녹색 레이저에 대한 파란색, 보라색의 붉은 1.0, 0.75 및 0.96에 대한 1.14로 확장 설정 지역.
- (소프트웨어의 "사이드 스트림"창에서) 테스트 정렬을 사용하여, 그 측면 스트림 패닝되지 않습니다 있는지 확인하십시오. 그들은 middl 충돌되도록 쪽 "스트림"윈도우에서, 각 사이드 스트림의 전압을 조정 슬라이더테스트 수집 튜브의 전자. 중앙 스트림 꽉 없으면 중앙 스트림을 제한하는 2 번째, 3 번째, 4 번째 드롭 설정을 조정.
- 소프트웨어 ( "사이토"메뉴)에서 사이토 설치 및 추적 (CS & T) 응용 프로그램을 시작합니다.
- 제조업체의 지침을 사용하여 세포 계수기의 성능 특성 및 추적을 자동화하기 위해 350 μL 당 1 방울의 세포 계측기 설치 및 추적 구슬을 사용합니다.
- CS & T 응용 프로그램을 종료합니다. CS & T 설정을 적용, 스트림 매개 변수는 여전히 안정적인 방울 breakoff 패턴을 할 수 있는지 확인하고 ( "Breakoff 창"에서) 제조 업체의 지침에 따라 스위트 스폿 (Sweet Spot) 버튼을 켭니다.
- 형광 비드를 사용하는 드롭 지연 값을 최적화 (자재 표 참조).
- 홀더에 수집 튜브를 설치합니다. 정렬 블록 문을 엽니 다. "사이드 스트림"창에서 "를 선택 한 후 전압을 켭니다시험 종류 "및 서랍을 열고 수집 튜브에 액세스 할 수 있도록 흡인기 서랍 버튼을 클릭합니다.
- 그들이 관의 중심으로 이동되도록 사이드 스트림을 최적화한다. 필요에 따라 값과 슬라이더를 조정합니다.
- 정렬 블록 문을 닫고 중앙의 밝은 구슬 자리를 얻기 위해 마이크로 미터 다이얼을 조절해야합니다. 선택 취소 폐기물 서랍, 시험 종류 및 전압. 컬렉션 튜브를 제거합니다.
- 제조자의 지시에 따라 드롭 지연을 최적화.
- 간략하게, 비드 바이알을 격렬히 흔들 PBS 0.5 ㎖에 구슬 1 방울을 희석.
- 제조업체의 지침을 사용하여 소프트웨어에서 사용할 수있는 드롭 지연 실험 템플릿을 사용하여 드롭 지연을 설정합니다. 또한, 드롭 지연을 설정하는 자동 드롭 지연 기능을 사용합니다.
- 형광 비드 튜브를로드하고 임계 속도가 될 때까지 3,000 ~ 4,000 이벤트 / 초를 유량을 조정한다. 정렬 정밀도를 설정하려면 "초기"최종LY "정렬 레이아웃"창에서 "미세 조정"에. 광학 필터를 선택하고 구슬을 정렬합니다. 100 %가 왼쪽으로 분류되어 있습니다 ~까지 드롭 지연을 조정합니다.
참고 :이 단계가 있는지 확인하는 것이 중요하다 측 스트림에 관심 종류의 세포. 구슬과 광학 필터는 100 % 액적 편차 부근 달성하는 데 사용된다.
- 금융위원회 검출기 블록의 왼쪽 끝에 FSC 1.5 ND (중성 농도) 필터를 놓습니다. 2.00 μS에 창을 확장하고 ( "사이토"창에서 "레이저"탭에서) 1.00 FSC 영역 확장을 설정합니다.
- 샘플 튜브를 넣기 전에, 응집을 피하기 위해 샘플 라인의 끝에 50 ㎛의 샘플 라인 필터를 배치했다. 이렇게하려면, "사이토"메뉴에서 "샘플 필터 변경"을 선택합니다.
- 사이드 스트림 사이에서 패닝이없이 양호한 분리를 달성하고 polypropyle 달라 붙는 것을 방지하기 위해 세포를 샘플 유체의 조성물을 시험NE 튜브.
- 샘플 튜브를로드 편향 판을 켜고 서랍이 닫힌 "테스트 정렬"을 선택합니다. 분리가 너무 많이 패닝없이 발생하는 경우 측면 스트림 봐.
주 : 패닝 인해 샘플 버퍼에 높은 단백질 농도 쉽다.
- 샘플 튜브를로드 편향 판을 켜고 서랍이 닫힌 "테스트 정렬"을 선택합니다. 분리가 너무 많이 패닝없이 발생하는 경우 측면 스트림 봐.
- 외과 악기로 샘플 튜브를 넣습니다. 300 rpm의 교반과 샘플 4 ° C의 온도 샘플을 선택한다. "취득 대시 보드"에서 "데이터를 획득"을 선택합니다.
- 필요한 경우 (3.0의 최대 유량) / 초 5000 이벤트 최대 적절한 이벤트 레이트를 달성하기 위해 시료를 희석. 분류 세포의 순도를 유지하도록 엄격하게 이러한 한계를 존중한다.
- 분석 및 세포를 정렬 관심 인구 간섭없이 이물질을 제거하기 FSC 임계 값을 최적화한다. 대수 눈금에서 만들기 위해 30분의 530 필터와 광 승산기 튜브 (PMT)의 검출 전압을 조정반드시 전체 인구의 형광 신호는 스케일에 들어가고, 그 양의 모집단의 게이트 (도 1, 게이트 1).
- 앞으로 캐터 영역 (FSC-A) / 사이드 캐터 지역 SYTO16 긍정적 인 인구 (SSC-A) 플롯을 생산하고 약 110 V 선형 규모에 FSC-을 조정하고, 약 150 V로 SSC- 매우 큰 세포와 세포 집합체를 제외하는 동안 로그 스케일의 모든 이벤트를 시각화합니다.
- "정렬 레이아웃"창에서 "정렬 정밀 모드"설정 "4 방향 순도"에 (수율 마스크 : 0, 순도 마스크 : 32, 위상 마스크 : 0). 연속 정렬에 대해 "대상 이벤트"메뉴에서 "연속"을 선택합니다.
- ( "정렬 레이아웃"창에서) 튜브에 해당하는 필드에 정렬하는 인구를 추가합니다. 높은 중간 주파수와 끝에서 낮은 주파수를 가진 사람들과 장소의 인구. 정렬하는 동안 2500 (V)의 전압 판을 설정 샘플 모음 (T)를 유지얼음에 ubes.
4. 셀 정렬
- 즉시 정렬 전에, 둥근 바닥 튜브를 이전에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 50 μm의 필터를 사용하여 필터 세포.
- 버퍼를 정렬 1-2 ㎖로 광범위하게 필터를 씻으십시오.
- 그림 1에 설명 된 게이트 방식 다음 488 nm의 레이저를 갖추고 세포 분류기를 사용하여 정렬 고정 생식 세포는. 이전에 얼음 섹션 1에 코팅을 5 ml 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브의 정제 분수를 수집합니다.
- FBS의 100 ~ 200 μL가 튜브 벽에 정렬 된 세포의 부착을 방지하기 위해 수집 관에 보관되어 있는지 확인합니다.
- SYTO16의 농도가 정렬 기간 동안 형광 변동을 방지하기 위해 포화되어 있는지 확인합니다. 정렬 그래픽 알렉사 488 형석 파라미터 (DNA 염색) 세포에서 염색 강도의 더 이상의 변화가 없을 때 SYTO16은 포화된다. 필요한 경우, 1 μl를 추가정렬 튜브 SYTO16은 포화에 도달한다.
- 알렉사 플 루어 488 대 사건 번호 : 다음 매개 변수를 표시하는 그래픽의 총 이벤트를 표시합니다.
- 도 1에 도시 된 바와 같이, 게이트 1 DNA 양성 염색 세포를 선택한다.
- 매개 변수로 FSC-대 SSC-를 사용하여 그래픽에 게이트 1 표시 셀
- 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 셀을 선택합니다.
- 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 2 표시 셀.
- 그림 1에 켰을 때, 게이트 2 그래픽에 게이트 5 게이트 6 셀을 선택합니다.
- 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 게이트 5 게이트 6 표시합니다.
- 선택 spermiogenesis는 게이트 (5) 그래픽에 1-9 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는, 게이트 6 그래픽에 10-12 정자 단계를 반복합니다.
- 디스플레이매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 FSC-A를 사용하여 그래픽에 게이트 1에서 세포
- 그림 1에 켰을 때, 문 3 문 4 셀을 선택합니다.
- 매개 변수로 알렉사 플 루어 488 대 488-W 알렉사 플 루어를 사용하여 그래픽에 별도로 문 3 문 4 표시합니다.
- 선택 spermiogenesis는 게이트 3 그래픽에 13 ~ 14 정자 단계를 그림 1에 켰을 때, spermiogenesis는 게이트 4 그래픽에 15 ~ 16 정자 단계를 반복합니다.
- 매개 변수로 FSC-대 SSC-를 사용하여 그래픽에 게이트 1 표시 셀
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Representative Results
게이팅 전략 유동 세포 계측법에 사용
그림 1은 네 개의 순수 spermatid 인구를 정렬 유동 세포 계측법에 사용되는 게이팅 전략을 나타냅니다. 간단히, 긍정적 인 DNA 염색과 세포 (알렉사 플 루어 488-A)를 처음 크기 대 granulosity (SSC-A)를 보여주는 도트 플롯에 spermiogenesis 1. 정자가 12이 선택 단계들 게이트 (문 2)와 선택 (FSC 게이트 (1)로부터 -A) 그런 다음, spermiogenesis에서 정자 1-9 단계 및 spermiogenesis 10-12은 DNA 염색 강도의 변화에 따라 서로 분리 될 수있는 단계 (게이트 (5, 6)). spermiogenesis에서 정자는 단계 13-14 및 15-16는 직접 DNA 염색 (알렉사 형석 488-A) 대 도트 플롯 나타내는 크기 (FSC-A)에 적극적으로 염색 된 세포로부터 선택된다 (게이트 3 및 4). 모든 분류 인구는 알렉사 플 루어로 재정의 488-W 알렉사 플 루어 488 점의 말은 증가하는 대 IR 순도.
표면 형광 현미경으로 정제 기법의 유효성
그림 2는 유동 세포 계측법에 의해 정자의 정렬 인구의 DAPI 염색을 나타냅니다. spermiogenesis 1-9 정자가 원형 정자와 spermiogenesis 9 단계 정자의 타원형 핵의 전형적인 둥근 모양의 핵을 표시 단계를 반복합니다. spermiogenesis 10-12 정자 큰 고리 모양의 연신 핵을 보여 단계를 반복합니다. Spermiogenesis은 13 ~ 14과 15 ~ 16 정자 비슷한 모양의 핵을 가지고 있지만, 자신의 정렬을 허용 DNA 염색 강도에 약간 다를 단계를 반복합니다. 다른 정렬 된 집단의 분화 단계 및 순도는 이전 연구 9에 기재된 바와 같이 특정 바이오 마커를 이용하여 확인 하였다. 정렬 spermatid 개체군의 순도는 표 1에 도시된다.
1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "십t
1. 자세한 게이팅 전략은 고순도 spermatid 인구를 정렬하는 그림. spermiogenesis을 정렬하는 데 사용 게이팅 전략의 도식 표현은 1-9 정자 단계 10-12 정자 단계, 13 ~ 14 정자 단계와 488 나노 미터로 14-16 정자 동시에 단계 레이저가 장착 셀 소터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 표면 형광으로 분류 정자의 시각화. 정렬 된 정자는 DAPI로 염색 현미경 슬라이드에 cytospined 및 DAPI에 대한 적절한 필터 표면 형광 현미경을 사용하여 시각과는 CCD CA 장착되어 있습니다메라. 세포 반전 계조에 나타낸다. 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 유형은 대부분 관찰 | 청정 | 세포의 대략적인 수 (8 시간 정렬) | 오염 물질 | |
| 인구 1 | 1-9 정자 단계 | 99-100% | 4,000,000 | (10) 정자 단계 |
| 인구 2 | 10-12 정자 단계 | 95~98% | 1,000,000 | 정모 세포 |
| 피opulation 3 | 13 ~ 14 정자 단계 | 99-100% | 80 만 | 정모 세포는 1-9 정자 단계 |
| 인구 4 | 15 ~ 16 정자 단계 | 98~100% | 1,500,000 | 정모 세포 |
표 1 : 정렬 spermatid 집단과 오염 물질.
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Discussion
정자 세포는 항상 정액을 운반하는 상피 세포의 복잡성뿐만 아니라 체외 문화의 제한된 성공을 주어 연구에 도전하고있다. 수년에 걸쳐, 많은 접근법은 다양한 종에서 생식 세포가 개발되었다 정제한다. 퍼콜 또는 소 혈청 알부민 구배로 중력을 이용하여 침전 정화 기법은 일반적으로 그대로 생식 세포의 우수한 수율을 제공하지만, 이러한 감수 배체 세포 및 정자 10 일부 세포 유형 사이의 적절한 정의가 부족하다. 또한, 이러한 기술이 필요 성가신 시행 착오없이 재현하기가 어려운 렌더링 많은 실험실에 쉽게 사용하지 못할 수 있습니다 (종종 집에서 만든) 특수 장치.을 장치는 일반적으로 세포의 생존을 유지하기 위해 4 ℃에서 보관 될 때 이들 방법은 또한 시간 소모, 진동에 매우 민감하고 불편하다. 성공하면, 침전 방법 그러나 수백만 정제 라이브 C를 제공인구 당 ELL 학생. 그러나, 달성 될 수있는 셀 농축 로우 레벨은 거의 이상 80~90% 순도에 도달하지 않기 때문에이 기술의 주요 단점이다. 분자량 분석에 큰 장애물을 나타내는 DNA, RNA 또는 단백질 함량에 의해 측정 할 때 어떤 경우에는, 다른 세포 유형으로부터의 10 내지 20 %의 오염이 존재한다.
세포 인구의 순도를 향상하고자하는 경우, 일부 연구자들은 다른 방법을 중력 침강을 결합했다. 가장 효과적인 방법 중 하나는 후기 단계를 나타내는 다른 세포 집단의 수를 제한하는 미성숙 마우스를 사용하는 것이다. 하나는 정자의 제 웨이브 활용하고 생후 그들의 연속 출현에 기초하여 소정의 분화 단계까지 생식 세포를 포함하는 세포 제제를 얻을 수있다. 그러나,이 합성 방법은 defin의 부족을 해결되지 않는 또 출발 물질의 제한된 양을 보상하기 위해 더 많은 동물을 필요침전 방법 ition. 또한, 이러한 접근은 실질적으로 같은 정자 후술 세포 유형에 대해 적용 할 수 있지만, 일차 spermatocyte 정조 세포에 주로 사용된다. 또한, 정자의 첫 번째 물결은 성숙한 쥐 (11, 12)의 순환 상피 세포에 비해 약간 다른 특성을 가진 세포를 항구 수 있다는 몇 가지 증거가있다.
정자의 비타민 동기화 또한이 절차는 처리 된 동물에서 고환 본 단수 좁혀 생식 세포로서 정제를 향상시키기 위해 사용되었다. 그러나,이 절차는 주로 쥐 13,14보고 일부 성공을, 래트에서 정자를 동기화하기 위해 사용되었다. 우리 자신의 경험에서, 마우스의 동기화를 비타민 것은 시간이 많이 걸리는이며, 거의 재현 가능한 결과를 제공하지 않고 정액을 운반하는 상피의 세포 무결성에 대한 우려를 제기 부작용을 생산하고 있습니다.
인접R 그룹이 성공적 15-18 마우스에서 배아 세포를 정화 유동 세포 계측법을 사용했다. 그러나 그들 중 누구도 라운드 정자 단계 과거 spermatid 인구의 정화를보고. 우리의 게이팅 전략은 분자 연구 의무가 중요한 분화 단계를 나타내는 네 개의 정제 반수체 세포 집단을 정화 할 수 있습니다. 이 논문에 기재된 방법의 주요 제약은 분류 세포의 수율이 제한 될 수도있다. 순도 높은 수준은 다소 분류 세포의 수의 희생이 얻어진다. 그러나, 우리는 프로토콜에 몇 가지 중요한 조언을 추가, 정렬 조건이 최적인지 확인합니다. 이러한 모든 기술적 조언은 번호 나 분류 정자의 순도를 향상하는 것을 목표로하고 있습니다. 예를 들어, 크게 분류 중에 튜브를 피복 FBS의 사용은 튜브를 부착 세포의 손실을 감소시킨다. 또한, SYTO16의 사용 포화 농도는 더 안정의 populat 결과 DNA 염색 강도의 변화를 줄일 수 있습니다이온 외과 플롯과 8 시간 정렬 기간 동안 더 나은 수율과 정렬 된 정자의 순도에 볼 수있다. 또한, FACS 분류기 셋업을위한 조언을 제공하는 기술은 확실히 수집 튜브에 세포 막힘이나 교차 오염을 방지하여 정렬의 전체 효율을 향상시키는 데 도움이. 대안 적으로, 게이트는 결국 일부 연구 허용 될 수 인구 순도 작은 감소의 결과, 분류 세포의 수를 증가시키기 위해 확장 될 수있다. 또한, SYTO16로 염색 에탄올 고정 생식 세포는 4 ° C에서 매우 안정적이며 제한 게이팅 조정 및 감독에 8 개 이상의 시간 동안 정렬 할 수 있습니다. 궁극적으로, 정렬 며칠 어떤 애플리케이션 셀 충분한 수를 얻기 위해 풀링 될 수있다.
여기에 기술 된 바와 같이 수득 된 유동 정렬 정자는 다양한 실험에 사용될 수있다. 이러한 세포의 DNA는 쉽게 상업 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 추출하고 입증 할 수PCR 9 분석 차세대 시퀀싱 (데이터는 도시하지 않음)를위한 적절한 품질이어야한다. 또한, 단백질에 사용될 수 정렬 정자 저희 정렬 정자의 높은 순도를 확인하는 단계 - 특정 마커에 대해 여러 면역 블롯을 수행 9를 분석한다. 우리는 정렬 된 정자의 세포 무결성을 확인하고 모든 인구의 핵 및 세포질은 그대로 유지 한 것으로 나타났습니다. 그러나, 우리는 단계 13-14 정자의 비율과 그들의 편모 누락 단계 15-16 정자의 작은 비례하는 결과 (데이타 미기재). 따라서, 고순도의 생식 세포 집단은이 방법을 프로테오믹스 게놈 분석뿐만 아니라 다른 애플리케이션에 적합하여 정렬.
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Acknowledgments
저자는 표면 형광 현미경에 관한 기술적 조언 박사 레오 니드 볼코프 에릭 보우 차드을 감사드립니다.
경제적 지원
GB의 건강 연구 (보조금 # 1 MOP-93781)의 캐나다 연구소에 의해 자금 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
