Abstract
Differentieringen av mus spermatider är en kritisk process för framställning av en funktionell hangamet med en intakt genom att överföras till nästa generation. Hittills har molekylära studier av denna morfologiska övergång hämmats av bristen på en metod som tillåter tillräcklig åtskillnad av dessa viktiga steg i spermatid differentiering för efterföljande analyser. Tidigare försök till korrekt grind av dessa celler med användning av flödescytometri kan ha varit svårt på grund av en egendomlig ökning av DNA-fluorescens i spermatider genomgår kromatin remodeling. Baserat på denna observation, vi lämna uppgifter om en enkel flödescytometri systemet möjliggör reproducerbar rening av fyra populationer av mus spermatider fast med etanol, var och en representerar en annan stat i kärn remodelleringsprocessen. Befolknings anrikning bekräftas med hjälp av stegspecifika markörer och morfologiska criterions. De renade spermatider kan användas för genomisk och proteomic analyser.
Protocol
Djuromsorg var i enlighet med djuromsorg och använda kommitté Université de Sherbrooke.
1. Tube Framställning
- Dagen före cellsortering, tillsätt 1-2 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till 5 ml polypropylen rund bottenrören, och till 15 ml och 50 ml polypropylen koniska rör.
Avgörande steg: Se till att alla rör som används i protokollet är belagda.
Obs: FBS beläggning förhindrar könsceller från att fastna vid rörväggarna. - Långsamt blanda O / N genom inversion vid 4 ° C för att belägga rören likformigt med användning av en rotator.
- Nästa dag, ta bort FBS från belagda rör genom dekantering.
- * Kritisk steg: Se till att 5 ml polypropen rund botten rör och de 15 och 50 ml rör som används för framställning cell (protokoll steg från 2,1 till 2,11) är helt tömda på FBS att förhindra fläkt- (dvs, oprecisa avvikelse av sidoströmmar). Använd en P200 pipett för att ta bort FBS.
- Lämna en liten restvolym av FBS (ca 100-200 | il) i 5 ml polypropylen med rund botten rör som används för uppsamling av renade celler.
- * Kritisk steg: Se till att 5 ml polypropen rund botten rör och de 15 och 50 ml rör som används för framställning cell (protokoll steg från 2,1 till 2,11) är helt tömda på FBS att förhindra fläkt- (dvs, oprecisa avvikelse av sidoströmmar). Använd en P200 pipett för att ta bort FBS.
2. Cellberedning
- Offra en manlig mus under anestesi med användning av O 2 / isofluran (induktion vid 5% sedan vid 2%) följt av CO 2 kvävning.
- Punkt och decapsulate båda testiklarna och finhacka med en liten sax i 500 ul av sorteringsbuffert i ett 1,5 ml rör.
- Flush könsceller från sädeskanalerna med mild upp och ner pipettering i 1,5 ml rör, först med en stympad 100-1000 pl spetsen, och därefter med en intakt 100-1000 pl spets.
- Ta bort skräp och klumpar av ett filtreringssteg med hjälp av en 40 ìm cell sil och samla filtratet till 50 ml koniska rör previously belagd med FBS i steg 1.
- Tvätta filtret en gång med sortering buffert upp till en total volym på 3 ml och överföring filtrat i 15 ml koniska rör tidigare belagts i steg 1.
- Lägg 16 pl 50 mM EDTA, pH 8 per ml cellsuspension (48 ul för 3 ml) för att erhålla en slutlig koncentration av 0,8 mM EDTA.
- För att fixa könsceller, långsamt tillsätt 3 volymer av iskall 100% etanol under användning av en 10 ml pipett under försiktig omrörning (virvel vid låg hastighet), som kommer att producera en mjölkaktig suspension.
Kritiskt steg: Långsamt tillsats av etanol är avgörande och viktigt för att bevara integriteten av cellpreparatet. Vi noterade att en snabb tillsättning av etanol orsakar cellys resulterar i en kraftig minskning av sorteringseffektivitet. För en 3 ml cellsuspension, bör 9 ml etanol tillsättas i ungefär en minut. - Inkubera cellerna på is under 15 min med tillfällig blandning genom inversion.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 800 x g under 5 min och avlägsna den klarasupernatanten.
- Försiktigt resuspendera de fasta könsceller i 2 ml sorteringsbuffert.
- Tillsätt 4 il SYTO16 DNA färgämne (1 mM lösning i DMSO) och inkubera i minst 30 minuter (skyddad från ljus).
Anm: Bäst sorterings resultat erhålles med användning SYTO16 eftersom det är ett genomsläppligt DNA-färgämne som lätt införlivas i de högkompakterade kärnor av spermatider.
3. Cell Sorter Konfigurera
Obs: Här, en 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blå, 561 nm - gul-grön, 633 nm - röd) 20-parameter BDFACSAria III cellsorterare används. BD FACSDiva 6.1.3 mjukvara används för att visualisera och analysera data. Inställningarna kan variera beroende på vilken typ av sorterare som används.
- Sterilisera FACS sorterare genom att köra 70% etanol som omslutande vätska under Fluidics avstängningsproceduren ("Cytometer" -menyn i programvaran) före sortering. Välj "Cytometer" i verktygsfältet i programmet och välj "Fluidic shutdown ". Följ stegen som nämns av processerna.
- Förbered och filtrera 1x PBS med en 0,22 um filter för att eliminera eventuella kristaller och föroreningar. Fyll manteln tanken till den övre svetslinjen på insidan av tanken.
- Starta programmet och logga in. Starta FACS sorterare för att värma upp lasrarna under minst 30 min före sortering. Kör två fluidic startprocesser för att spola ut etanolen från fluidik. Välj "Cytometer" i verktygsfältet i programmet och välj "Fluidic start". Följ stegen som nämns av processerna.
Obs: Detta åter Fluidics med normal omslutande vätska (1x PBS). - Rengör sorteringsblocket och avlänkningsplattorna med destillerat vatten och torka dem noggrant. Sonikera en 100 um munstycke placerades i ett rör av destillerat vatten under 2 min i en sonikering bad. Torka munstycket noggrant.
- Sätt in 100 pm munstycket i flödescellen och vrid munstycket låsspak medurs till 12h position. Ställ manteln trycket till 20 psi.
- Slå på strömmen och justera amplituden att få målvärden för frekvens (cirka 30), Drop 1 (cirka 150) och Gap (cirka 12) och att etablera en stabil droppavbrytmönster (några satellit droppar). Stäng av dämpning.
- Kontrollera att strömmen är rak och träffar centrum avlopp aspirator genom att ändra vinkeln hos sorteringsblocket. Obs: En 130 pm munstycke vid 10 psi testades också och ingen uppenbar skillnad konstaterades.
- Ställ laser dröjsmål 0 för den blå, -77,39 för den röda, 37,33 för violett och -39,85 för gul-gröna lasrar.
- Ställ områden skalning till 1,14 efter den blå, 1,0 för den röda, 0,75 för violett och 0,96 för gul-grön laser.
- Med hjälp av en test Sortera (i "Side Stream" fönstret av programvaran), se till att sidoströmmar inte fläktade. I "Side Stream" fönstret, justera reglagen spännings varje sidoström så att de drabbade middle från provuppsamlingsröret. Om mittströmmen inte är tät, justera 2: a, 3: e och 4: e släpp inställningar för att begränsa mittströmmen.
- Starta Cytometer Setup och spårning (CS & T) program i mjukvaran (menyn "Cytometer").
- Använd cytometern installation och spårning pärlor på en droppe per 350 pl att automatisera karakterisering och spårning av cytometern prestanda när du använder tillverkarens instruktioner.
- Avsluta CS & T ansökan. Applicera CS & T inställning, se till att ström parametrar tillåter fortfarande en stabil droppavbrytmönster, och slå på Sweet Spot knappen som beskrivs i tillverkarens instruktioner (i "avbrytfönstret").
- Optimera Drop Delay värdet med fluorescerande pärlor (se tabell of Materials).
- Montera uppsamlingsrören i hållaren. Öppna sorterings blocket dörren. I "Side Stream" fönster, slå på spänning och välj sedan "Test sortera "och klicka på Aspirator låda för att öppna lådan och har tillgång till uppsamlingsrören.
- Optimera sidoströmmarna så att de går in i mitten av röret. Justera värden och reglage som behövs.
- Stäng sorterings blocket dörren och se till att justera mätklockan för att få den ljusaste pärla plats i centrum. Avmarkera avfall låda, prov sortera och spänning. Ta bort uppsamlingsrören.
- Optimera drop fördröjningen enligt tillverkarens instruktioner.
- I korthet, skaka pärla flaskan kraftigt och späd en droppe av pärlor i 0,5 ml PBS.
- Med hjälp av tillverkarens instruktioner, ställa droppen fördröjningen med hjälp av Drop Delay experimentet mall som finns i programvaran. Alternativt kan du använda Auto Drop Delay funktionen för att ställa in drop fördröjning.
- Ladda röret av fluorescerande pärlor och justera flödeshastigheten tills tröskelhastigheten är ~ 3000 till 4000 händelser / sekund. Ställ in sorterings precision "Initial" och slutly till "Fininställning" i "Sort layout" fönstret. Välj det optiska filtret och sortera pärlorna. Justera Drop Fördröjning tills ~ 100% sorteras till vänster.
Obs! Det här steget är viktigt att se till att celler av intresse sortera i en sidoström. Pärlorna och det optiska filtret används för att uppnå nära en 100% dropp avvikelse.
- Placera en FSC 1.5 ND (neutral densitet) filter vid den vänstra änden av FSC detektorblocket. Ställ in fönstret förlängning till 2,00 ps och FSC-området skalning till 1,00 (i "Laser" -fliken i "Cytometer" fönster).
- Innan du laddar provrör, placera en provtagningsfiltren linje 50 pm vid slutet av provledningen för att undvika klumpbildning. För att göra detta, välj "Ändra Sample Filter" i menyn "Cytometer".
- Testa sammansättningen av provfluiden för att uppnå god separation utan fanning mellan sidoström och för att förhindra cellerna från att fastna vid den polypropylene rör.
- Ladda provröret, slå på avlänkningsplattorna och välj "Test slags" med lådan stängd. Titta på sidoströmmar om separation sker utan alltför mycket fläkta.
Obs: Fanning beror sannolikt på en hög proteinkoncentrationen i provbufferten.
- Ladda provröret, slå på avlänkningsplattorna och välj "Test slags" med lådan stängd. Titta på sidoströmmar om separation sker utan alltför mycket fläkta.
- Ladda provet röret i FACS-instrumentet. Välj en prov omröring av 300 varv per minut och en provtemperatur av 4 ° C. Välj "Hämta Data" i "Förvärv Dashboard".
- Om det är nödvändigt, späd provet för att uppnå en lämplig händelsefrekvens till maximalt 5000 händelser / sek (med en maximal flödeshastighet av 3,0). Strikt respektera dessa gränser för att upprätthålla renheten hos de sorterade celler.
- Att analysera och sortera celler, optimera FSC tröskelvärdet för att eliminera skräp utan att störa den intressanta populationen. I logaritmisk skala, justera spänningen av fotomultiplikatorn rör (PMT) detektor med 530/30 filtret, för att göraSe till att fluorescenssignalen av den totala befolkningen passar i skalan, och grinden på den positiva populationen (Figur 1, Gate 1).
- Producera en framåtspridning-område (FSC-A) / sidospridning-område (SSC-A) kurva över SYTO16 positiva populationen och justera FSC-A till omkring 110 V i linjär skala, och SSC-A till omkring 150 V i logaritmisk skala för att visualisera alla händelser samtidigt exklusive mycket stora celler och cellaggregat.
- I "Sortera Layout" fönstret, ställa in "Sort Precision Mode" till "4-vägs renhet" (Utbyte mask: 0, renhet mask: 32, Phase Mask: 0). Välj "Continuous" från "Target Events" menyn för kontinuerlig sortering.
- Lägg befolkningar att sortera på fältet som motsvarar rören (i "Sortera Layout" fönster). Placera populationer med högre frekvenser i mitten och de med lägre frekvenser i ändarna. Ställ in spänningsplattorna till 2500 V. Under sortering, hålla provsamlingen tubes på is.
4. cellsortering
- Omedelbart före sortering, filtrera celler genom att använda en 50 um filter i en tidigare belagd 5 ml polypropylen rundbottnad röret.
- Tvätta filtret omfattande med 1-2 ml av sorteringsbuffert.
- Sortera fixerade könsceller med användning av en 488 nm laser-utrustade cellsorterare efter grindningsschema i detalj i fig 1. Samla renade fraktionerna i 5 ml polypropen rund bottenrören tidigare belagts i avsnitt 1 på is.
- Se till att 100 till 200 | j, l av FBS hålles i uppsamlingsrören för att undvika klibbning av de sorterade cellerna till rörväggen.
- Se till att koncentrationen av SYTO16 är mätta för att undvika fluorescens fluktuationer under sorteringsperioden. SYTO16 är mätta när det inte finns någon ytterligare variation av cellfärgningsintensitet på Alexa Fluor 488 parameter (DNA färgning) i sorterings grafik. Om det behövs, tillsätt 1 ilSYTO16 till sorteringsröret för att nå mättnad.
- Visa den totala händelser ett grafiskt visar följande parametrar: antal händelser vs Alexa Fluor 488-A.
- Välj de positiva DNA-färgningsceller med Gate 1, såsom visas i fig 1.
- Visa celler från gate 1 på en grafisk använder SSC-A vs FSC-A som parametrar
- Markera cellerna med gate 2, såsom visat i fig 1.
- Visa celler från Gate 2 på en grafisk använder FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametrar.
- Välj celler med Gate 5 och Gate 6 på Gate 2 grafiskt, såsom visade i figur 1.
- Visa separat Gate 5 och Gate 6 på grafik med Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametrar.
- Välj spermiogenesen steg 1-9 spermatider på Gate 5 grafik och spermiogenesen steg 10-12 spermatider på Gate 6 grafik, såsom visade i figur 1.
- Visaceller från gate 1 på en grafisk använder FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametrar
- Välj celler med Gate 3 och Gate 4, som visade i figur 1.
- Visa separat Gate 3 och Gate 4 på grafik med Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametrar.
- Välj spermiogenesen steg 13-14 spermatider på Gate 3 grafik och spermiogenesen steg 15-16 spermatider på Gate 4 grafiskt, såsom visade i figur 1.
- Visa celler från gate 1 på en grafisk använder SSC-A vs FSC-A som parametrar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategi som används med flödescytometri
Figur 1 visar grind strategi som används i flödescytometri för att sortera fyra mycket rena spermatid populationer. Kortfattat, celler med positiv DNA färgning (Alexa Fluor 488-A) först väljs med Gate 1. spermatider från spermiogenesen stegen 1-12 väljs (Gate 2) på ett punktdiagram som visar granulosity (SSC-A) vs storlek (FSC -A) från Gate 1. Därefter spermatider från spermiogenesen steg 1-9 och spermiogenesen stegen 10-12 kan separeras från varandra i enlighet med variationen av DNA färgningsintensitet (Gates 5 och 6). Spermatider från spermiogenesen steg 13-14 och 15-16 är direkt valda bland positivt färgade celler på ett punktdiagram som visar storleken (FSC-A) mot DNA-färgning (Alexa Fluor 488-A) (Portar 3 och 4). Alla sorterade populationer omdefinieras med Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A dot blöts för att öka ir renhet.
Validering av reningsschemat genom epifluorescensmikroskopi
Figur 2 representerar DAPI-färgning av de sorterade populationer av spermatider genom flödescytometri. Den spermiogenesen steg 1-9 spermatider visar typiska rund kärna av de runda spermatider och oval kärna spermiogenesen steg 9 spermatider. Den spermiogenesen steg 10-12 spermatider visar en stor krok-formad förlängning kärna. Spermiogenesen steg 13-14 och 15-16 spermatider har en liknande formad kärna, men skiljer sig något i DNA färgningsintensitet, som låtit sin sortering. Differentieringen steg och renhet hos de olika sorterade populationer också fastställas med hjälp av särskilda biomarkörer som beskrivs i en tidigare studie 9. Renheten av de sorterade spermatid populationer avbildas i tabell 1.
tält "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Detaljerad grindstrategi för att sortera ultrarent spermatid populationer. Schematisk bild av grind strategi som används för att sortera spermiogenesen steg 1-9 spermatider, steg 10-12 spermatider, steg 13-14 spermatider och steg 14-16 spermatider samtidigt med en 488 nm laser-utrustade cellsorterare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Visualisering av sorterade spermatider per epifluorescens. Sorterade spermatider är cytospined på objektglas, färgades med DAPI och visualiseras med en epifluorescensmikroskop med lämpliga filter för DAPI och utrustade med en CCD caMera. Celler visas i inverterad gråskala. Bar = 20 pm. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
| Celltyp observerats i majoritet | Renhet | Ungefärligt antal celler (8 tim sortering) | Föroreningar | |
| Population 1 | Steg 1-9 spermatider | 99-100% | 4.000.000 | Steg 10 spermatider |
| Population 2 | Stegen 10-12 spermatider | 95-98% | 1.000.000 | Spermatocyter |
| PBefolknings 3 | Stegen 13-14 spermatider | 99-100% | 800 tusen | Spermatocyter, steg 1-9 spermatider |
| Population 4 | Stegen 15-16 spermatider | 98-100% | 1.500.000 | Spermatocyter |
Tabell 1: Sorterat spermatid populationer och deras föroreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogenescykler celler har alltid varit en utmaning att studera med tanke på komplexiteten av seminiferiepitel, liksom den begränsade framgången för in vitro kultur. Under årens lopp har många metoder rena könsceller från olika arter utvecklades. Sedimenteringstekniker som använder gravitation rening med Percoll eller bovinserumalbumin gradienter brukar ge en god avkastning på intakta germinalceller, men saknar ordentlig definition mellan vissa celltyper såsom meiotiska tetraploida celler och spermatider 10. Dessutom är dessa tekniker kräver speciella enheter (ofta hemlagad) som kanske inte lätt tillgänglig för många laboratorier, vilket gör dem svåra att återge utan besvärliga trial and error. Dessa metoder är även tidskrävande, mycket känslig för vibrationer och obekvämt som anordningen hålls vanligen vid 4 ° C för att upprätthålla cellviabilitet. När framgångsrik, sedimenteringsmetoder ger dock flera miljoner renade levande calnar per invånare. Dock är den låga nivån av cell anrikning som kan uppnås den huvudsakliga nackdelen med dessa tekniker, eftersom det sällan når mer än 80 till 90% renhet. I vissa fall är en kontaminering av 10 till 20% från andra celltyper närvarande när den mäts med DNA, RNA eller proteinhalt, som representerar ett stort hinder för molekylära analyser.
När vi söker för att förbättra renheten hos cellpopulationer, har vissa forskare kombinerade gravitationssedimentering med andra metoder. Ett av de mest effektiva metoder är att använda omogna möss för att begränsa antalet olika cellpopulationer som representerar senare skeden. Man kan dra fördel av den första vågen av spermatogenes och erhållande av en cellberedning innehållande germinalceller upp till en given differentieringsfasen baserat på deras sekventiella utseende efter födseln. Detta kräver dock kombinerade tillvägagångssättet fler djur för att kompensera för den begränsade mängden utgångsmaterial och ändå inte lösa bristen på definition av sedimenteringsmetoder. Dessutom kan ett sådant tillvägagångssätt inte tillämpas i praktiken för senare celltyper såsom spermatider, men används främst för spermatogonier och primär spermatocyte. Dessutom finns det vissa tecken på att den första vågen av spermatogenesen kan hysa celler med lite olika egenskaper än för cykel epitel av äldre möss 11,12.
Vitamin A-synkronisering av spermatogenes användes också för att förbättra germinal cellrening eftersom denna procedur smalnar antalet steg som finns i testiklarna hos ett behandlat djur. Emellertid var detta förfarande används främst för att synkronisera spermatogenes hos råtta, med viss framgång rapporterats i möss 13,14. Från vår egen erfarenhet, vitamin A synkronisering hos möss är tidskrävande, ger sällan reproducerbara resultat och ger skadliga biverkningar höja oro den cellulära integriteten av seminiferiepitel.
OtheR-grupper med framgång använt flödescytometri för att rena könsceller från mus 15-18. Men ingen av dem rapporterade rening av spermatid populationer förbi runda spermatider steg. Vår grindstrategi gör det möjligt att rena fyra höggradigt renade haploida cellpopulationer som representerar viktiga differentieringssteg mottagliga för molekylära studier. Den huvudsakliga begränsningen av den metod som beskrivs i detta dokument kan vara det begränsade utbytet av sorterade celler. Den höga nivån av renhet är något erhålles på bekostnad av antalet sorterade celler. Men för att vara säker på att sorterings förutsättningarna är optimala, vi lagt några kritiska råd till protokollet. Alla dessa tekniska råd syftar till att öka vare sig antalet eller renheten hos sorterade spermatider. Exempelvis användning av FBS belagda rör under sortering kraftigt minskar förlusten av celler som fastnar till rören. Också genom att använda mättande koncentration av SYTO16 hjälper till att minska variationerna i DNA-färgningsintensitet som resulterar i mer stabil populatjoner som kan ses på FACS tomter och en bättre avkastning och renhet hos sorterade spermatider under en 8 timmar sorteringsperioden. Dessutom tillhandahålls tekniska råd för FACS sorterare set-up definitivt bidra till att öka den totala effektiviteten i sortering genom att undvika cell träskor eller korskontaminering samla in rören. Alternativt kan grindar utökas för att öka antalet av sorterade celler, så småningom resulterar i en liten minskning av populationen renhet, vilket kan vara acceptabelt för vissa studier. Vidare etanolfixerade könsceller färgade med SYTO16 är mycket stabila vid 4 ° C och kan sorteras i mer än 8 timmar med begränsade justeringar och tillsyn grind. I slutändan kan flera dagars sortering slås samman för att få ett tillräckligt antal celler för alla tillämpningar.
Flödes sorterade spermatider som erhållits såsom beskrivits här kan användas för en mängd olika experiment. DNA från dessa celler kan lätt extraheras med användning av kommersiella genomiska DNA-reningssatser och visadevara av rätt kvalitet för PCR-analyser 9 och nästa generations sekvensering (data ej visade). Sorterade spermatider kan också användas för proteinanalys 9 där vi utfört flera immunoblottar mot stadiespecifika markörer för att bekräfta den höga renheten av de sorterade spermatider. Vi verifierade den cellulära integriteten av de sorterade spermatider och fann att kärnan och cytoplasman i alla populationer förblir intakta. Men vi hittade en del av stegen 13-14 spermatider och en mindre andel av stegen 15-16 spermatider som saknas sin flagellum (data visas ej). Följaktligen högrena könscellspopulationer sorteras med användning av denna metod är lämplig för proteomik och genomiska analyser, såväl som andra applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Leonid Volkov och Éric Bouchard för sina tekniska råd om epifluorescensmikroskopi.
Ekonomiskt stöd
Finansieras av den kanadensiska Institutes of Health Research (bidrags # MOP-93.781) till GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
