Abstract
تمايز spermatids الفأر هو عملية حاسمة واحدة لإنتاج الأمشاج الذكور وظيفية مع الجينوم سليمة إلى أن تنتقل إلى الجيل التالي. حتى الآن، وقد أعاق الدراسات الجزيئية لهذا التحول الصرفي بسبب عدم وجود طريقة السماح للفصل الكافي لهذه الخطوات الهامة للتمايز النطف للتحليلات لاحقة. المحاولات السابقة في النابضة السليم لهذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي قد يكون صعبا بسبب زيادة غريبة في مضان DNA في spermatids تمر ونين التجديد. وبناء على هذه الملاحظة، ونحن نقدم تفاصيل تدفق بسيط الخلوي المخطط، مما يسمح تنقية استنساخه من أربعة سكان spermatids الماوس ثابتة مع الإيثانول، يمثل كل دولة مختلفة في عملية إعادة عرض النووية. وأكد تخصيب السكان الذين يستخدمون علامات خطوة محددة ومعيارا المورفولوجية. وspermatids النقاء يمكن استخدامها لالجينومية وproteomيحلل جيم.
Protocol
وكانت رعاية الحيوان وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة شيربروك.
1. أنبوب إعداد
- قبل يوم واحد فرز الخلايا، إضافة 1-2 مل من الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة، وإلى 15 مل و 50 مل أنابيب البولي بروبلين المخروطية.
خطوة حاسمة: تأكد من أن كل أنبوب المستخدمة في البروتوكول هو المغلفة.
ملاحظة: FBS طلاء يمنع الخلايا الجرثومية من الالتصاق على جدران الأنبوب. - مزيج ببطء O / N التي كتبها قلب في 4 ° C إلى معطف الأنابيب موحد باستخدام المدورة.
- في اليوم التالي، وإزالة FBS من الأنابيب المغلفة من قبل الصب.
- * خطوة حاسمة: تأكد من أن 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل جولة و15 و 50 مل أنابيب تستخدم لإعداد الخلية (بروتوكول الخطوات 2،1-2،11) يتم تفريغ تماما من FBS لمنع تأجيج (أي انحراف غير دقيق من تيارات الجانب). استخدام الماصة P200 لإزالة FBS.
- ترك حجم صغيرة متبقية من FBS (حوالي 100-200 ميكرولتر) في الجولة البولي بروبلين 5 مل أنابيب أسفل المستخدمة لجمع خلايا النقاء.
- * خطوة حاسمة: تأكد من أن 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل جولة و15 و 50 مل أنابيب تستخدم لإعداد الخلية (بروتوكول الخطوات 2،1-2،11) يتم تفريغ تماما من FBS لمنع تأجيج (أي انحراف غير دقيق من تيارات الجانب). استخدام الماصة P200 لإزالة FBS.
2. خلية التحضير
- التضحية الماوس واحد من الذكور تحت التخدير باستخدام O 2 / الأيزوفلورين (الحث على 5٪ ثم الحفاظ على 2٪)، يليه CO 2 الاختناق.
- المكوس وdecapsulate كلا الخصيتين واللحم المفروم مع مقص صغير في 500 ميكرولتر من فرز العازلة في أنبوب 1.5 مل.
- الخلايا الجرثومية دافق من الأنابيب المنوية التي كتبها طيف pipetting صعودا وهبوطا في أنبوب 1.5 مل، أولا مع اقتطاع 100-1،000 ميكرولتر الحافة، ثم مع سليمة طرف 100-1،000 ميكرولتر.
- إزالة الأنقاض وكتل خطوة الترشيح واحد باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع الرشاحة إلى 50 مل السابق أنبوب مخروطيالمغلفة iously مع FBS في الخطوة 1.
- غسل الفلتر مرة مع فرز عازلة تصل إلى الحجم الكلي لل3 مل ونقل الترشيح إلى 15 مل أنبوب مخروطي المغلفة سابقا في الخطوة 1.
- إضافة 16 ميكرولتر من 50 ملي درجة الحموضة 8 في الملليمتر الواحد من تعليق خلية (48 ميكرولتر لمدة 3 مل) EDTA وذلك للحصول على التركيز النهائي من 0.8 ملي EDTA.
- لإصلاح الخلايا الجرثومية، إضافة ببطء 3 مجلدات من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام الماصة 10 مل مع الإثارة لطيف (الدوامة بسرعة منخفضة)، والتي سوف تنتج تعليق حليبي.
خطوة حاسمة: إضافة ببطء الايثانول أمر حاسم ومهم للحفاظ على سلامة إعداد الخلية. لاحظنا أن إضافة السريع من الايثانول تسبب تحلل الخلايا مما أدى إلى انخفاض كبير في فرز الكفاءة. لخلية تعليق 3 مل، وينبغي أن يضاف 9 مل من الايثانول في حوالي 1 دقيقة. - احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان عن طريق الانقلاب.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة واضحةطاف.
- بلطف resuspend الخلايا الجرثومية الثابتة في 2 مل من فرز العازلة.
- إضافة 4 ميكرولتر من SYTO16 DNA صبغ (حل 1 ملم في DMSO)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل (محمية من الضوء).
ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج فرز باستخدام SYTO16 لأنها صبغة DNA قابلة للاختراق الذي يسهل إدراجها في نوى المضغوط للغاية من spermatids.
فارز 3. خلية محدد حتى
يستخدم 20 معلمة BDFACSAria III فارز الخلية وهنا 4-الليزر (أحمر 405 نانومتر - البنفسجي، 488 نانومتر - الأزرق، 561 نانومتر - - الأصفر والأخضر، 633 نانومتر): ملاحظة. يتم استخدام BD FACSDiva 6.1.3 برنامج لتصور وتحليل البيانات. قد تختلف إعدادات اعتمادا على نوع فارز المستخدمة.
- تعقيم فارز FACS عن طريق تشغيل 70٪ من الإيثانول كسائل غمد أثناء إجراء fluidics اغلاق (القائمة "عداد الكريات" في البرنامج) قبل الفرز. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختيار "ش فلويديكutdown ". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
- إعداد وتصفية 1X PBS مع مرشح 0.22 ميكرون وذلك للقضاء على أي بلورات والملوثات. ملء خزان غمد إلى خط اللحام العلوي في داخل الخزان.
- بدء تشغيل البرنامج وتسجيل الدخول. بدء فارز FACS في عملية الاحماء الليزر لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الفرز. تشغيل اثنين عمليات بدء التشغيل الموائعية لطرد الإيثانول من fluidics. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختر "بدء التشغيل فلويديك". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
ملاحظة: هذا يعيد fluidics مع الطبيعي السائل غمد (1X PBS). - تنظيف كتلة الفرز واللوحات انحراف بالماء المقطر وتجفيفها جيدا. يصوتن فوهة 100 ميكرومتر وضعت في أنبوب من الماء المقطر لمدة 2 دقيقة في حمام صوتنة. مسح فوهة بدقة.
- أدخل فوهة 100 ميكرومتر في خلية تدفق وتحويل قفل فوهة رافعة عقارب الساعة إلى 12موقف ساعة. ضبط ضغط غمد إلى 20 رطل.
- بدوره على تيار وضبط السعة للحصول على القيم المستهدفة للتردد (حوالي 30)، قطرة 1 (حوالي 150) وجاب (حوالي 12) وإلى تأسيس نمط قطرة breakoff مستقر (قطرات قليل من الأقمار الصناعية). إيقاف التوهين.
- تأكد من أن تيار مستقيم ويضرب وسط الشافطة النفايات عن طريق تغيير زاوية من كتلة النوع. ملاحظة: تم اختبار فوهة 130 ميكرومتر في 10 رطل أيضا وتوجد فروق واضحة.
- تعيين تأخير الليزر ل0 ل-77.39 الأزرق، للأحمر، 37.33 لالبنفسجي و-39.85 ليزر الأصفر والأخضر.
- المناطق المحددة لرفع 1.14 ل1.0 الأزرق، للأحمر، 0.75 لالبنفسجي و0.96 لأشعة الليزر الأصفر والأخضر.
- باستخدام ترتيب اختبار (في "الجانب ستريم" نافذة البرنامج)، تأكد من أن تيارات الجانب لا تثيران. في "الجانب ستريم" نافذة، وضبط المتزلجون الجهد من كل تيار الجانب بحيث تصل إلى middl(ه) من أنبوب جمع اختبار. إذا كان تيار الوسط غير محكم، وضبط الثاني 2، 3 الثالثة، وإعدادات قطرة ال 4 لكبح تيار الوسط.
- بدء الإعداد الكريات وتتبع (CS & T) التطبيق في البرنامج ("عداد الكريات" القائمة).
- استخدام الإعداد وتتبع حبات الكريات في 1 قطرة في 350 ميكرولتر لأتمتة توصيف وتتبع أداء الكريات باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
- إنهاء التطبيق CS & T. تطبيق الإعداد CS & T، تأكد من المعلمات تيار لا تزال تسمح نمط قطرة breakoff مستقر، وبدوره على زر الحلو بقعة كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة (في "نافذة Breakoff").
- تعظيم قيمة قطرة تأخير باستخدام الخرز فلوري (انظر الجدول المواد).
- تثبيت أنابيب جمع في حامل. فتح باب كتلة النوع. في "الجانب ستريم" نافذة، بدوره على الجهد ثم حدد "اختبار نوع "وانقر فوق الزر المضخة درج لفتح درج والحصول على أنابيب جمع.
- تحسين تيارات جانب ذلك يذهبون إلى وسط الأنبوب. ضبط القيم والمتزلجون حسب الحاجة.
- إغلاق كتلة الباب فرزها والتأكد من ضبط الطلب ميكرومتر للحصول على ألمع بقعة حبة في المركز. درج النفايات غير منتقى، اختبار الفرز والجهد. إزالة أنابيب جمع.
- تحسين تأخير هبوط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- لفترة وجيزة، ويهز حبة قارورة بقوة وتمييع 1 قطرة من الخرز في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- باستخدام تعليمات الصانعين، تعيين التأخير قطرة باستخدام القالب تجربة قطرة تأخير المتاحة في البرنامج. بدلا من ذلك، استخدم ميزة السيارات قطرة تأخير لضبط تأخير الهبوط.
- تحميل أنبوب من الخرز الفلورسنت وضبط معدل تدفق حتى معدل عتبة هو ~ 3000 إلى 4000 أحداث / ثانية. تعيين دقة الفرز إلى "الأولية" ونهائيلاي ل"تهذيب" في إطار "تخطيط ترتيب". حدد مرشح بصري وفرز الخرز. ضبط قطرة تأخير حتى ~ يتم فرز 100٪ إلى اليسار.
ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للتأكد من أن الخلايا التي تهم النوع الى تيار الجانب. يتم استخدام الخرز ومرشح بصري لتحقيق ما يقرب من 100٪ قطرة الانحراف.
- وضع FSC 1.5 ND (الكثافة المحايدة) مرشح في الطرف الأيسر من كتلة كشف FSC. تعيين ملحق نافذة إلى 2.00 ميكرو ثانية والتحجيم FSC منطقة إلى 1.00 (في "ليزر" في علامة التبويب "عداد الكريات" نافذة).
- قبل تحميل أنبوب عينة، ضع خط مرشح عينة من 50 ميكرون في نهاية السطر عينة لتجنب تراكمها. للقيام بذلك، حدد "تغيير نموذج تصفية" في القائمة "عداد الكريات".
- اختبار تكوين السائل عينة لتحقيق فصل جيد من دون اثارة بين تيار الجانب ومنع الخلايا من الالتصاق على بولي بروبلينأنابيب ني.
- تحميل أنبوب عينة، بدوره على لوحات انحراف واختر "اختبار النوع" مع درج مغلق. ننظر إلى تيارات الجانب في حال حدوث الانفصال دون الكثير من تأجيج.
ملاحظة: من المحتمل فانينغ بسبب تركيز نسبة عالية من البروتين في عينة العازلة.
- تحميل أنبوب عينة، بدوره على لوحات انحراف واختر "اختبار النوع" مع درج مغلق. ننظر إلى تيارات الجانب في حال حدوث الانفصال دون الكثير من تأجيج.
- تحميل أنبوب العينة إلى أداة FACS. حدد التحريض عينة من 300 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة العينة من 4 ° C. حدد "الحصول على البيانات" في "اقتناء لوحة".
- إذا لزم الأمر، وتمييع العينة إلى تحقيق معدل الحدث المناسب إلى حد أقصى قدره 5000 أحداث / ثانية (بمعدل تدفق الأقصى من 3.0). بدقة احترام هذه الحدود وذلك للحفاظ على نقاء خلايا فرزها.
- لتحليل وفرز الخلايا، وتحسين قيمة عتبة FSC للقضاء على الحطام دون التدخل مع السكان من الاهتمام. في مقياس لوغاريتمي، وضبط الجهد من الأنبوب الصور المضاعف (PMT) كاشف مع فلتر 530/30 من أجل جعلالتأكد من أن إشارة مضان من مجموع السكان يناسب داخل نطاق، وبوابة على السكان الإيجابي (الشكل 1، بوابة 1).
- إنتاج مبعثر في منطقة الأمام (FSC-A) / جانبية مبعثر في منطقة (SSC-A) قطعة من السكان إيجابي SYTO16 وضبط FSC-A إلى حوالي 110 V في مقياس خطي، وSSC-A إلى حوالي 150 V في مقياس لوغاريتمي لتصور كل الأحداث مع استبعاد الخلايا الكبيرة جدا والمجاميع الخلية.
- في إطار "ترتيب تخطيط"، تعيين "وضع الدقة ترتيب" إلى "النقاء 4-الطريق" (قناع الغلة: 0، الطهارة قناع: 32، قناع المرحلة: 0). حدد "مستمر" من "أحداث الهدف" القائمة على الفرز مستمر.
- إضافة السكان لفرز في مجال المطابقة للأنابيب (في إطار "ترتيب تخطيط"). سكان المكان مع ترددات أعلى في الوسط، وتلك مع ترددات منخفضة نسبيا في نهايات. ضبط لوحات الجهد ل2500 V. أثناء الفرز، والحفاظ على تي جمع العيناتubes على الجليد.
4. خلية الفرز
- على الفور قبل الفرز، والخلايا مرشح باستخدام فلتر 50 ميكرون في المغلفة سابقا 5 مل البولي بروبلين الجولة أنبوب أسفل.
- غسل المرشح على نطاق واسع مع 1-2 مل من فرز العازلة.
- الخلايا الجرثومية نوع ثابتة باستخدام مجهزة ليزر فارز خلية 488 نانومتر التالية مخطط النابضة المفصل في الشكل 1. جمع الكسور النقاء في 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة المغلفة سابقا في القسم 1 على الجليد.
- تأكد من 100-200 ميكرولتر من FBS يتم الاحتفاظ بها في أنابيب جمع لتجنب التصاق الخلايا مرتبة على الجدار أنبوب.
- تأكد من أن تركيز SYTO16 والإشباع لتجنب تقلبات مضان خلال الفترة الفرز. SYTO16 وتشبع عندما لا يكون هناك تباين المزيد من شدة تلطيخ الخلية في اليكسا فلور 488 معلمة (تلطيخ DNA) في الرسومات الفرز. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميكرولتر منSYTO16 إلى أنبوب الفرز للوصول إلى الإشباع.
- عرض مجموع الأحداث على الرسم تظهر المعلمات التالية: عدد من الأحداث مقابل اليكسا فلور 488-A.
- حدد الخلايا تلطيخ DNA إيجابية مع بوابة 1، كما هو مبين في الشكل 1.
- عرض الخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام SSC-A مقابل FSC-A كمعلمات
- حدد الخلايا مع بوابة 2، أظهرت كما في الشكل 1.
- عرض الخلايا من بوابة 2 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
- حدد الخلايا مع بوابة 5 و 6 على بوابة بوابة 2 الرسم، أظهرت كما في الشكل 1.
- عرض منفصل بوابة 5 و 6 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
- حدد تكون النطاف الخطوات 1-9 spermatids على بوابة 5 الرسم وتكون النطاف الخطوات 10-12 spermatids على بوابة 6 الرسومات، وأظهرت كما في الشكل 1.
- عرضخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات
- حدد الخلايا مع بوابة 3 وبوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.
- عرض منفصل بوابة 3 و 4 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
- حدد تكون النطاف الخطوات 13-14 spermatids على الرسم البوابة رقم 3 وتكون النطاف الخطوات 15-16 spermatids على الرسم بوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.
- عرض الخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام SSC-A مقابل FSC-A كمعلمات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استراتيجية النابضة استخدامها مع التدفق الخلوي
الشكل 1 يمثل استراتيجية النابضة المستخدمة في التدفق الخلوي لفرز أربعة السكان النطف نقية للغاية. لفترة وجيزة، والخلايا مع تلطيخ DNA الإيجابي (فلور اليكسا 488-A) ويتم اختيار أولا مع بوابة الخطوات يتم اختيار 1. Spermatids من النطاف 1-12 (بوابة 2) على قطعة نقطة تظهر كتلة تحببية (SSC-A) مقابل حجم (FSC -A) من بوابة 1. ثم spermatids من النطاف خطوات 1-9 وتكون النطاف الخطوات 10-12 يمكن فصلها عن بعضها البعض وفقا لاختلاف كثافة تلطيخ DNA (غيتس 5 و 6). Spermatids من النطاف خطوات 13-14 و15-16 ويتم اختيار مباشرة من الخلايا الملون إيجابا على حجم المؤامرة التي تبين نقطة (FSC-A) مقابل تلطيخ DNA (فلور اليكسا 488-A) (جيتس 3 و 4). يتم تعريف جميع السكان فرزها مع فلور اليكسا 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A نقطة البقع لزيادة نقاء الأشعة تحت الحمراء.
المصادقة على مخطط تنقية بواسطة المجهر epifluorescence
ويمثل الرقم 2 تلطيخ دابي من السكان فرزها من spermatids التدفق الخلوي. وتكون النطاف الخطوات عرض 1-9 spermatids الجولة شكل نواة نموذجية من spermatids جولة ونواة بيضاوية الشكل من الخطوة تكون النطاف 9 spermatids. وتكون النطاف الخطوات تظهر 10-12 spermatids على شكل الخطاف كبيرة التطويل النواة. تكون النطاف الخطوات 13-14 و15-16 spermatids لديها نواة على شكل مماثلة، ولكنها تختلف قليلا في الحمض النووي كثافة تلطيخ، مما سمح الفرز الخاصة بهم. تم التحقق من الخطوات التمايز ونقاء مختلف السكان فرزها أيضا باستخدام المؤشرات الحيوية معينة كما هو موضح في دراسة سابقة 9. ويصور نقاء السكان النطف فرزها في الجدول 1.
خيمة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" 1 ">
الشكل 1. استراتيجية النابضة مفصلة لفرز السكان عالى النقاء النطف. تمثيل تخطيطي للاستراتيجية النابضة تستخدم لفرز النطاف الخطوات 1-9 spermatids، الخطوات 10-12 spermatids، الخطوات 13-14 spermatids والخطوات 14-16 spermatids في وقت واحد مع 488 نانومتر مجهزة ليزر فارز الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وcytospined الشكل 2. التصور من spermatids فرزها من قبل epifluorescence. فرزها spermatids على الشرائح المجهر، ملطخة دابي وتصور باستخدام مجهر epifluorescence مع الفلاتر المناسبة للدابي ومجهزة كاليفورنيا CCDميرا. وتظهر الخلايا في مقياس الرمادية مقلوب. بار = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع من الخلايا لوحظ في غالبية | نقاء | العدد التقريبي للخلايا (8 ساعة الفرز) | الملوثات | |
| السكان 1 | الخطوات 1-9 spermatids | 99-100٪ | 4،000،000 | الخطوة 10 spermatids |
| السكان 2 | الخطوات 10-12 spermatids | 95-98٪ | 1،000،000 | الخلايا المنوية |
| Population 3 | الخطوات 13-14 spermatids | 99-100٪ | 800،000 | الخلايا المنوية، الخطوات 1-9 spermatids |
| السكان 4 | الخطوات 15-16 spermatids | 98-100٪ | 1،500،000 | الخلايا المنوية |
الجدول 1: الترتيب السكان النطف والملوثات الخاصة بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا المنوية دائما تحديا للدراسة نظرا لتعقيد ظهارة المنوية، وكذلك النجاح المحدود للثقافة في المختبر. على مر السنين، وقد وضعت الخلايا الجرثومية من الأنواع المختلفة العديد من الطرق لتنقية. تقنيات الترسيب باستخدام تنقية الجاذبية مع Percoll أو الأبقار مصل الزلال التدرجات عادة ما توفر عائد جيد للخلايا جرثومي سليمة، ولكنها تفتقر تعريف مناسب بين بعض أنواع الخلايا مثل الخلايا وspermatids 10 الانتصافي رباعي الصيغة الصبغية. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنيات أجهزة خاصة (غالبا محلية الصنع) التي قد لا تكون متاحة بسهولة إلى العديد من المختبرات، مما يجعل من الصعب إعادة إنتاج دون محاكمة مرهقة والخطأ. هذه الأساليب هي أيضا مضيعة للوقت، حساسة جدا لاهتزازات وغير مريح كما عادة يتم الاحتفاظ الجهاز عند 4 درجات مئوية للحفاظ على بقاء الخلية. عندما ناجحة، وطرق الترسيب ومع ذلك توفر عدة ملايين من النقاء ج الحيةملتعلمي اللغة اإلنكليزية في السكان. ومع ذلك، فإن انخفاض مستوى تخصيب الخلية التي يمكن تحقيقها هو العيب الرئيسي من هذه التقنيات لأنها نادرا ما تصل إلى أكثر من 80-90٪ النقاء. في بعض الحالات، وتلوث 10-20٪ من أنواع الخلايا الأخرى موجودة عند قياسها بواسطة DNA، RNA أو محتوى البروتين، وهو ما يمثل عائقا رئيسيا أمام التحليلات الجزيئية.
عندما تسعى إلى تحسين نقاء للسكان الخلية، وبعض المحققين تضافرت خطورة الترسيب إلى أساليب أخرى. إحدى الطرق الأكثر فعالية هو استخدام الفئران غير ناضجة للحد من عدد السكان مختلفة من الخلايا التي تمثل مراحل لاحقة. يمكن للمرء الاستفادة من الموجة الأولى من تكوين الحيوانات المنوية والحصول على إعداد الخلايا التي تحتوي على الخلايا الجرثومية تصل إلى مرحلة التمايز معين استنادا إلى مظهرهم متتابعة بعد الولادة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب الجمع بين أكثر الحيوانات للتعويض عن كمية محدودة من المواد ابتداء وحتى الآن لم يحل عدم وجود definition الطرق الترسيب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مثل هذا النهج لا يمكن تطبيقها عمليا لاحقة أنواع الخلايا مثل spermatids، ولكنها تستخدم أساسا للأمهات المني وخلية نطفية الأولية. وعلاوة على ذلك، هناك بعض الأدلة على أن الموجة الأولى من الحيوانات المنوية يمكن أن تؤوي خلايا ذات خصائص مختلفة قليلا من ظهارة ركوب الدراجات من الفئران ناضجة 11،12.
تم استخدام فيتامين A تزامن الحيوانات المنوية أيضا لتحسين تنقية الخلايا الجرثومية كما يضيق هذا الإجراء أسفل عدد من المراحل الموجودة في الخصيتين من الحيوانات المعالجة. ومع ذلك، تم استخدام هذا الإجراء أساسا لمزامنة تكوين الحيوانات المنوية في الفئران، مع بعض النجاح التي أعلن عنها في الفئران 13،14. من تجربتنا الخاصة، فيتامين A التزامن في الفئران وقتا طويلا، ونادرا ما يعطي نتائج قابلة للتكرار وتنتج الآثار الجانبية الضارة مما أثار القلق حول سلامة الخلوية من ظهارة المنوية.
آلات موسيقية أخرىص الجماعات استخدمت بنجاح التدفق الخلوي لتنقية الخلايا الجرثومية من الماوس 15-18. ومع ذلك، فإن أيا منها ذكرت تنقية للسكان النطف الماضي الخطوات spermatids الجولة. استراتيجية النابضة لدينا يسمح لتنقية أربعة السكان الخلية فرداني عالي النقاء تمثل خطوات مهمة التمايز قابلة للدراسات الجزيئية. العائق الرئيسي من الطريقة الموضحة في هذه الورقة قد يكون العائد محدود من الخلايا فرزها. يتم الحصول على مستوى عال من النقاء إلى حد ما على حساب عدد الخلايا فرزها. ومع ذلك، للتأكد من أن الظروف الفرز هي الأمثل، واضاف نحن بضعة نصائح هامة للبروتوكول. وتهدف كل هذه النصائح التقنية لزيادة إما رقم أو نقاء spermatids فرزها. على سبيل المثال، استخدام FBS المغلفة أنابيب أثناء الفرز إلى حد كبير يقلل من فقدان الخلايا التي تلتصق الأنابيب. أيضا، وذلك باستخدام تشبع تركيز SYTO16 يساعد في تقليل الاختلافات من الحمض النووي كثافة تلطيخ مما أدى إلى populat أكثر استقراراأيونات كما هو ظاهر على المؤامرات FACS وأفضل عائد ونقاء spermatids فرزها خلال فترة فرز 8 ساعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النصائح التقنية المقدمة للFACS فارز انشاء تساعد بالتأكيد إلى زيادة الكفاءة العامة للفرز عن طريق تجنب انسداد الخلية أو انتقال التلوث في جمع الأنابيب. بدلا من ذلك، والبوابات يمكن توسيعها لزيادة عدد الخلايا فرزها، مما أدى في النهاية إلى انخفاض طفيف في الطهارة السكان، والتي يمكن أن تكون مقبولة بالنسبة لبعض الدراسات. وعلاوة على ذلك، الخلايا الجرثومية الثابتة الإيثانول ملطخة SYTO16 مستقرة جدا في 4 درجات مئوية، ويمكن فرزها لأكثر من 8 ساعات مع تعديلات النابضة محدودة والإشراف عليها. في نهاية المطاف، عدة أيام من الفرز ويمكن تجميعها للحصول على عدد كاف من خلايا لأي تطبيق.
spermatids تدفق مرتبة الحصول عليها كما هو موضح هنا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من التجارب. DNA من هذه الخلايا يمكن بسهولة استخراج باستخدام الجينومية مجموعات تجارية تنقية الحمض النووي وتظاهرأن تكون ذات نوعية مناسبة لPCR يحلل 9 والجيل القادم التسلسل (لا تظهر البيانات). الترتيب spermatids يمكن أن تستخدم أيضا للبروتين يحلل 9 حيث أجرينا عدة immunoblots ضد علامات مرحلة محددة للتأكد من نقاء عالية من spermatids فرزها. نحن التحقق من سلامة الخلوية من spermatids فرزها وجدت أن النواة والسيتوبلازم من جميع السكان لا تزال سليمة. ومع ذلك، وجدنا نسبة من الخطوات 13-14 spermatids ونسبة أقل من الخطوات 15-16 spermatids مفقودة السوط لهم (لا تظهر البيانات). وبالتالي، فرز نقية للغاية سكان الخلية الجرثومية باستخدام هذا النهج هي مناسبة لتحليل البروتين والجينوم، فضلا عن التطبيقات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر الدكتور ليونيد فولكوف واريك بوشار للحصول على المشورة التقنية بشأن المجهر epifluorescence.
الدعم المالي
بتمويل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (منحة # MOP-93781) لGB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
