Abstract
La diferenciación de espermátidas de ratón es uno proceso crítico para la producción de un gameto masculino funcional con un genoma intacto para ser transmitido a la siguiente generación. Hasta ahora, los estudios moleculares de esta transición morfológica se han visto obstaculizados por la falta de un método que permite una separación adecuada de estos pasos importantes de la diferenciación espermátide para análisis posteriores. Los anteriores intentos de la selección adecuada de estas células usando citometría de flujo pueden haber sido difícil debido a un aumento en la fluorescencia peculiar ADN en espermátidas sometidos a remodelación de la cromatina. Sobre la base de esta observación, proporcionamos los detalles de un flujo sencillo citometría de esquema, lo que permite la purificación reproducible de cuatro poblaciones de espermátidas de ratón fijados con etanol, cada uno representando un estado diferente en el proceso de remodelación nuclear. Enriquecimiento de Población se confirma el uso de marcadores de pasos específicos y criterios morfológicos. Las espermátidas purificadas se pueden utilizar para genómico y proteomic analiza.
Protocol
Cuidado de los animales estaba en conformidad con el cuidado de los animales y el uso comité de la Universidad de Sherbrooke.
1. Preparación del tubo
- El día antes de la clasificación de células, añadir 1-2 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo, y a 15 ml y 50 ml tubos cónicos de polipropileno.
Paso crítico: Asegúrese de que todos los tubos utilizados en el protocolo es revestido.
Nota: recubrimiento FBS evita que las células germinales se pegue a las paredes del tubo. - Poco a poco la mezcla de O / N por inversión a 4 ° C para revestir usando los tubos de manera uniforme un rotador.
- El día siguiente, eliminar FBS a partir de tubos recubiertos por decantación.
- * Paso crítico: Asegúrese de que los 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo y los 15 y 50 ml tubos utilizados para la preparación de células (protocolo de los pasos 2.1 a 2.11) están completamente vacíos de FBS para evitar Fanning (es decir, la desviación imprecisa de las corrientes laterales). Utilice una pipeta P200 para eliminar las FBS.
- Deja un pequeño volumen residual de FBS (alrededor de 100 a 200 l) en el 5 ml de polipropileno ronda tubos de fondo utilizados para la recolección de células purificadas.
- * Paso crítico: Asegúrese de que los 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo y los 15 y 50 ml tubos utilizados para la preparación de células (protocolo de los pasos 2.1 a 2.11) están completamente vacíos de FBS para evitar Fanning (es decir, la desviación imprecisa de las corrientes laterales). Utilice una pipeta P200 para eliminar las FBS.
2. Preparación de la célula
- Sacrificar uno ratón macho bajo anestesia usando O 2 / isoflurano (inducción al 5% después se mantuvo a 2%), seguido por asfixia con CO2.
- Impuestos Especiales y desencapsulan ambos testículos y picar con pequeñas tijeras en 500 l de tampón de clasificación en un tubo de 1,5 ml.
- Células germinales rasantes de túbulos seminíferos de suave pipeteo hacia arriba y abajo en el tubo de 1,5 ml, primero con un tronco de 100-1.000 l punta, y luego con una punta de 100-1.000 l intacta.
- Retirar los escombros y matas por el paso uno de filtración usando un filtro de células de 40 micras y recoger filtrado en los 50 ml prev tubo cónicoiamente recubierto con FBS en el paso 1.
- Lavar el filtro una vez con tampón de clasificación hasta un volumen total de 3 ml y la transferencia de filtrado en el tubo cónico de 15 ml previamente recubierto en el paso 1.
- Añadir 16 l de EDTA 50 mM pH 8 por mililitro de suspensión celular (48 l para 3 ml) para obtener una concentración final de EDTA 0,8 mM.
- Para fijar las células germinales, se añade lentamente 3 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo utilizando una pipeta de 10 ml con agitación suave (vórtice a baja velocidad), que producirá una suspensión lechosa.
Paso crítico: añadiendo lentamente etanol es crucial e importante para preservar la integridad de la preparación celular. Hemos observado que la adición rápida de etanol provoca la lisis celular que resulta en una disminución importante de la clasificación eficiencia. Para obtener una suspensión de células 3 ml, se deben añadir 9 ml de etanol en aproximadamente 1 min. - Se incuban las células en hielo durante 15 min con mezcla ocasional por inversión.
- Suspensión de células Centrifugar a 800 xg durante 5 min y retirar la claraflotante.
- Resuspender suavemente las células germinales fijos en 2 ml de tampón de clasificación.
- Añadir 4 l de tinte de ADN SYTO16 (solución 1 mM en DMSO) y se incuba durante al menos 30 min (protegido de la luz).
Nota: Los mejores resultados de clasificación se obtienen utilizando SYTO16 ya que es un tinte de ADN permeable que se incorpora fácilmente en los núcleos altamente compactadas de espermátidas.
Clasificador 3. Cell Set Up
Se utiliza 20-parámetro clasificador celular BDFACSAria III Aquí, un 4-láser (rojo 405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - - amarillo-verde, 633 nm): Nota. El software BD FACSDiva 6.1.3 se utiliza para visualizar y analizar los datos. Los ajustes pueden variar en función del tipo de clasificador utilizado.
- Esterilizar el clasificador FACS mediante la ejecución de 70% de etanol como fluido envolvente durante el procedimiento de fluidos de apagado (menú "citómetro" en el software) antes de la clasificación. Seleccione "citómetro" en la barra de herramientas del software y elija "sh neumáticoutdown ". Siga los pasos mencionados por los procesos.
- Preparar y filtrar 1x PBS con un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier cristal y contaminantes. Llenar el depósito de la vaina a la línea de soldadura superior en el interior del tanque.
- Inicie el software e ingrese. Inicie el clasificador FACS para calentar el láser durante al menos 30 minutos antes de la clasificación. Ejecutar dos procesos de inicio de fluidos para eliminar el etanol a partir de los fluidos. Seleccione "citómetro" en la barra de herramientas del software y elija "arranque neumático". Siga los pasos mencionados por los procesos.
Nota: Esto restaura fluidos con fluido envolvente normal (1x PBS). - Limpie el bloque de clasificación y las placas de deflexión con agua destilada y secar a fondo. Sonicar una boquilla de 100 micras colocó en un tubo de agua destilada durante 2 min en un baño de sonicación. Limpie la boquilla a fondo.
- Inserte la boquilla de 100 micras en la celda de flujo y gire la palanca de la boquilla de bloqueo de las agujas del reloj a la 12posición h. Ajuste la presión de funda a 20 psi.
- Encienda la corriente y ajustar la amplitud de obtener valores objetivo para la frecuencia (alrededor de 30), la gota 1 (alrededor de 150) y Gap (alrededor de 12) y establecer un patrón breakoff gotita estable (gotas pocos satélite). Apague la atenuación.
- Asegúrese de que la corriente es recta y golpea el centro del aspirador de residuos cambiando el ángulo del bloque tipo. Nota: Una boquilla de 130 micras, con 10 psi también se ensayó y no se encontró ninguna diferencia obvia.
- Establecer retraso láser a 0 para el -77,39 azul, para el rojo, 37,33 para el violeta y -39.85 por los láseres de color amarillo-verde.
- Establecer zonas de escala a 1,14 para el 1.0 azul, para el rojo, 0,75 para el violeta y 0,96 para los láseres de color amarillo-verde.
- El uso de un Ordenar de prueba (en la ventana de "Side Stream" del software), asegúrese de que las corrientes laterales no están Fanning. En la ventana "Side Stream", ajuste los controles deslizantes de tensión de cada corriente lateral para que lleguen al middle de tubo de recogida de prueba. Si la corriente de centro no es apretado, ajustar el 2º, 3º y 4 º ajustes de caída para limitar la corriente central.
- Inicie el programa de instalación citómetro y Seguimiento (CS & T) aplicación en el (menú "citómetro") de software.
- Utilice la configuración y el seguimiento de cuentas de citómetro a 1 gota por cada 350 l para automatizar la caracterización y el seguimiento de la actuación citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Salga de la aplicación CS & T. Aplicar configuración de CS & T, asegúrese de que los parámetros de la corriente todavía permiten un patrón breakoff gotita estable, y encienda el botón de Sweet Spot como se describe en las instrucciones del fabricante (en la "ventana Breakoff").
- Optimizar el valor gota Delay usando perlas fluorescentes (véase la Tabla de Materiales).
- Instale los tubos de recogida en el soporte. Abra la puerta del bloque de tipo. En la ventana "Side Stream", active la tensión a continuación, seleccione "Prueba de tipo "y haga clic en el botón aspirador cajón para abrir el cajón y tener acceso a los tubos de recogida.
- Optimizar las corrientes laterales así que van hacia el centro del tubo. Ajustar valores y deslizadores, según sea necesario.
- Cierre la puerta del bloque de clase y asegúrese de ajustar el micrómetro para obtener el punto de perlas más brillantes en el centro. Cajón de residuos Deseleccionar, prueba de tipo y la tensión. Retire los tubos de recogida.
- Optimizar el retraso caída de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- En pocas palabras, agitar vigorosamente el vial de cuentas y diluir 1 gota de los granos en 0,5 ml de PBS.
- Usando las instrucciones del fabricante, establecer el retraso gota usando la plantilla experimento de la gota de retardo disponibles en el software. También puede utilizar la función Auto gota retardo para ajustar el retardo de caída.
- Cargar el tubo de perlas fluorescentes y ajustar la velocidad de flujo hasta que la tasa de umbral es de ~ 3.000 a 4.000 acontecimientos / segundo. Establecer la precisión de clasificación para "Inicial" y últimamente a "Sintonía fina" en la ventana "Ordenar diseño". Seleccione el filtro óptico y clasificar los granos. Ajuste el retardo gota hasta ~ 100% están ordenadas a la izquierda.
Nota: Este paso es crítico para asegurarse de que las células de interés especie en una corriente lateral. Las perlas y el filtro óptico se utilizan para lograr cerca de una desviación de gotas 100%.
- Coloque un filtro ND (densidad neutra) FSC 1.5 en el extremo izquierdo del bloque detector FSC. Establecer la extensión ventana al 2,00 microsegundo y el escalado FSC Área de 1.00 (en la pestaña de "láser" en la ventana "citómetro").
- Antes de cargar el tubo de la muestra, coloque una línea de filtro de muestra de 50 micras, con el final de la línea de muestreo para evitar la formación de grumos. Para ello, seleccione "Cambiar Filtro de ejemplo" en el menú "citómetro".
- Prueba de la composición de la muestra de fluido para lograr una buena separación entre avivar sin corriente lateral y para evitar que las células se peguen a la polypropyletubos ne.
- Cargue el tubo de la muestra, encender las placas de deflexión y seleccione "prueba tipo" con el cajón cerrado. Mira arroyos secundarios si se produce la separación sin demasiado Fanning.
Nota: Fanning es probablemente debido a una alta concentración de proteína en el tampón de muestra.
- Cargue el tubo de la muestra, encender las placas de deflexión y seleccione "prueba tipo" con el cajón cerrado. Mira arroyos secundarios si se produce la separación sin demasiado Fanning.
- Cargar el tubo de muestra en el instrumento FACS. Seleccionar una muestra de agitación 300 rpm y una temperatura de muestra de 4 ° C. Seleccione "Adquirir de datos" en la "Adquisición Dashboard".
- Si es necesario, diluir la muestra para lograr una tasa de eventos apropiado para un máximo de 5.000 eventos / seg (con un caudal máximo de 3,0). Estrictamente respetar estos límites con el fin de mantener la pureza de las células clasificadas.
- Para analizar y clasificar las células, optimizar el valor umbral de FSC para eliminar los escombros sin interferir en la población de interés. En escala logarítmica, ajustar el voltaje del detector de tubo fotomultiplicador (PMT) con el filtro de 530/30 a fin de hacerasegurarse de que la señal de fluorescencia de la población total se ajusta dentro de la escala, y la puerta en la población positiva (Figura 1, puerta 1).
- Producir un Forward Scatter-zona (FSC-A) / dispersión lateral del área (SSC-A) parcela de la población positiva SYTO16 y ajustar el FSC-A a alrededor de 110 V en la escala lineal y la SSC-A a alrededor de 150 V en escala logarítmica para visualizar todos los eventos excluyendo muy grandes células y agregados de células.
- En la ventana "Ordenar Diseño", establecer el "modo de ordenación de precisión" a "4 vías pureza" (máscara Rendimiento: 0, Pureza Máscara: 32, Máscara Fase: 0). Seleccione "Continuo" en el menú "Eventos objetivo" para la clasificación continua.
- Añadir poblaciones para ordenar en el campo correspondiente a los tubos (en la ventana "Ordenar Layout"). Coloque las poblaciones con frecuencias más altas en el centro y los que tienen frecuencias más bajas en los extremos. Establecer las placas de voltaje a 2500 V. Durante la clasificación, mantener la recolección de la muestra tUBE en el hielo.
4. Cell Sorting
- Inmediatamente antes de la clasificación, las células de filtro utilizando un filtro de 50 micras en un 5 ml previamente recubierto de polipropileno ronda tubo inferior.
- Lave el filtro extensamente con 1-2 ml de tampón de clasificación.
- Células germinales Ordenar fijos utilizando un 488 nm láser equipado clasificador de células siguiendo el esquema gating se detalla en la Figura 1. Recoger fracciones purificadas en 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo recubiertas previamente en la sección 1 en el hielo.
- Asegúrese de que de 100-200 l de FBS se mantiene en los tubos de recogida para evitar la adherencia de las células clasificadas a la pared del tubo.
- Asegúrese de que la concentración de SYTO16 está saturando de evitar las fluctuaciones de fluorescencia durante el período de clasificación. SYTO16 está saturando cuando no hay más variación de intensidad de la tinción de células en el parámetro 488 (tinción de ADN) Alexa Fluor en los gráficos de clasificación. Si es necesario, añadir 1 l deSYTO16 al tubo de clasificación para alcanzar la saturación.
- Mostrar los eventos totales en un gráfico que muestra los siguientes parámetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A.
- Seleccione las celdas de tinción de ADN positivos con la Puerta 1, como se muestra en la Figura 1.
- Mostrar las células de la puerta 1 en un gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parámetros
- Seleccione las celdas con la puerta 2, como se muestra en la Figura 1.
- Mostrar las células de la puerta 2 en un gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
- Seleccionar celdas con Puerta 5 y 6 en la Puerta Puerta 2 gráfico, como se muestra en la Figura 1.
- Mostrar separado Puerta 5 y 6 en la Puerta de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
- Seleccione espermiogénesis pasos 1-9 espermátidas en la Puerta 5 gráfico y espermiogénesis pasos 10-12 espermátidas en la puerta 6 gráficos, como se muestra en la Figura 1.
- Monitorlas células de la puerta 1 en un gráfico utilizando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros
- Seleccionar las células con la puerta 3 y Puerta 4, como se muestra en la Figura 1.
- Mostrar separado Puerta 3 y la puerta 4 de gráficos con Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros.
- Seleccione espermiogénesis pasos 13-14 espermátidas en el gráfico de la Puerta 3 y espermiogénesis pasos 15-16 espermátidas en el gráfico de la puerta 4, como se muestra en la Figura 1.
- Mostrar las células de la puerta 1 en un gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parámetros
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Representative Results
Estrategia de apertura de puerta se usa con citometría de flujo
La Figura 1 representa la estrategia gating utilizado en citometría de flujo para clasificar cuatro poblaciones spermatid altamente puros. Brevemente, las células con tinción de ADN positivo (Alexa Fluor 488-A) se seleccionan en primer lugar con la Puerta 1. Espermátidas de espermiogénesis pasos son seleccionados 1-12 (puerta 2) en un gráfico de puntos que muestra la granulosidad (SSC-A) vs tamaño (FSC -A) de la puerta 1. A continuación, espermátides de la espermiogénesis los pasos 1-9 y espermiogénesis los pasos 10 a 12 se pueden separar el uno del otro de acuerdo con la variación de la intensidad de la tinción de ADN (Gates, 5 y 6). Espermátidas de la espermiogénesis pasos 13-14 y 15-16 de se seleccionan directamente a partir de células teñidas positivamente en un gráfico de puntos que muestra el tamaño (FSC-A) vs tinción de ADN (Alexa Fluor 488-A) (Gates, 3 y 4). Todas las poblaciones según se redefinen con Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor borrones 488-A punto para aumentar la pureza IR.
Validación del esquema de purificación por microscopía de epifluorescencia
La Figura 2 representa la tinción DAPI de las poblaciones clasificadas de espermátidas por citometría de flujo. La espermiogénesis pasos 1-9 espermátidas muestran el núcleo en forma típica ronda de las espermátidas redondas y núcleo de forma ovalada de la etapa de la espermiogénesis 9 espermátidas. La espermiogénesis pasos 10-12 espermátidas muestran una gran elongación núcleo en forma de gancho. Espermiogénesis pasos 13-14 y 15-16 espermátides tienen un núcleo en forma similar, pero difieren ligeramente en intensidad de la tinción de ADN, lo que permitió su clasificación. Los pasos de diferenciación y la pureza de las diferentes poblaciones clasificadas también se determinaron utilizando biomarcadores específicos como se describe en un estudio anterior 9. La pureza de las poblaciones spermatid ordenados se representa en la Tabla 1.
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Figura 1. Estrategia detallada gating para ordenar las poblaciones spermatid ultrapura. Representación esquemática de la estrategia de gating utilizado para ordenar la espermiogénesis los pasos 1-9 espermátidas, los pasos 10-12 espermátidas, los pasos 13-14 espermátidas y los pasos 14-16 espermátidas simultáneamente con un 488 nm equipado con láser de clasificador de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Visualización de espermátidas ordenados por epifluorescencia. Espermátidas muestras ordenadas se cytospined en portaobjetos de microscopio, se tiñeron con DAPI y se visualizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia con los filtros adecuados para DAPI y equipadas con una ca CCDMera. Las células se muestran en escala de grises invertida. Bar = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tipo de la célula observada en la mayoría | Pureza | Número aproximado de células (8 horas de clasificación) | Contaminantes | |
| Población 1 | Pasos 1-9 espermátidas | 99-100% | 4000000 | Paso 10 espermátidas |
| Población 2 | Pasos 10-12 espermátidas | 95-98% | 1000000 | Espermatocitos |
| Población 3 | Pasos 13-14 espermátidas | 99-100% | 800000 | Espermatocitos, espermátidas pasos 1-9 |
| Población 4 | Pasos 15-16 espermátidas | 98-100% | 1500000 | Espermatocitos |
Tabla 1: Ordenado poblaciones spermatid y sus contaminantes.
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Discussion
Células de espermatogénesis siempre han sido difíciles de estudiar debido a la complejidad del epitelio seminífero, así como el éxito limitado de cultivo in vitro. A través de los años, muchos enfoques para purificar se desarrollaron las células germinales a partir de diversas especies. Utilizando técnicas de sedimentación de purificación de la gravedad con Percoll o gradientes de albúmina de suero bovino por lo general proporcionan un buen rendimiento de células germinales intactas, pero carecen de definición adecuada entre algunos tipos de células tales como las células y espermátidas 10 tetraploides meióticas. Además, estas técnicas requieren dispositivos especiales (a menudo caseros) que pueden no ser fácilmente disponible para muchos laboratorios, lo que los hace difíciles de reproducir sin juicio engorroso y error. Estos métodos son también consume mucho tiempo, muy sensible a las vibraciones e inconveniente como el aparato generalmente se mantiene a 4 ° C para mantener la viabilidad celular. Cuando tiene éxito, los métodos de sedimentación sin embargo proporcionan varios millones c vivo purificadaells por población. Sin embargo, el bajo nivel de enriquecimiento de células que se puede lograr es el principal inconveniente de estas técnicas, ya que rara vez se llega a más de un 80-90% de pureza. En ciertos casos, una contaminación de 10-20% de otros tipos de células está presente cuando se mide por ADN, ARN o el contenido de proteína, lo que representa un obstáculo importante para los análisis moleculares.
Cuando se trata de mejorar la pureza de las poblaciones celulares, algunos investigadores han combinado sedimentación por gravedad a otros métodos. Uno de los enfoques más efectivos es el uso de ratones inmaduros para limitar el número de diferentes poblaciones de células que representan etapas posteriores. Uno puede tomar ventaja de la primera ola de espermatogénesis y obtener una preparación celular que contiene células germinales hasta un etapa de diferenciación dado basándose en su apariencia secuencial después del nacimiento. Sin embargo, este enfoque combinado requiere más animales para compensar la cantidad limitada de material de partida y, sin embargo no resuelve la falta de definition de los métodos de sedimentación. Además, un enfoque de este tipo no puede ser aplicado prácticamente para posteriores tipos de células tales como espermátides, pero se utiliza principalmente para espermatogonias y espermatocitos primarios. Por otra parte, existe alguna evidencia de que la primera ola de la espermatogénesis puede albergar células con propiedades ligeramente diferentes a la del ciclo del epitelio de los ratones maduros 11,12.
La vitamina A la sincronización de la espermatogénesis también se utilizó para mejorar la purificación de células germinales ya que este procedimiento limita el número de etapas presentes en los testículos de un animal tratado. Sin embargo, este procedimiento se utiliza principalmente para sincronizar la espermatogénesis en ratas, con cierto éxito reportado en ratones 13,14. A partir de nuestra propia experiencia, de vitamina A de sincronización en los ratones es mucho tiempo, rara vez da resultados reproducibles y produce efectos secundarios dañinos que crían preocupación por la integridad celular del epitelio seminífero.
Other grupos utilizan con éxito citometría de flujo para purificar las células germinales de ratón 15-18 de. Sin embargo, ninguno de ellos informó purificación de poblaciones spermatid últimos los pasos espermátidas redondas. Nuestra estrategia gating permite purificar cuatro poblaciones de células haploides altamente purificadas que representan importantes etapas de diferenciación susceptibles de estudios moleculares. La principal limitación del método descrito en este documento puede ser la limitada producción de células clasificadas. El alto nivel de pureza se obtiene algo a expensas del número de células clasificadas. Sin embargo, para asegurarse de que las condiciones de clasificación son óptimos, hemos añadido unos consejos fundamentales para el protocolo. Todos estos consejos técnicos tienen como objetivo aumentar el número o la pureza de espermátidas ordenados. Por ejemplo, el uso de tubos recubiertos con FBS durante la clasificación en gran medida disminuye la pérdida de las células que se adhieren a los tubos. Además, el uso saturando concentración de SYTO16 ayuda a reducir las variaciones de intensidad de la tinción de ADN resultantes en populat más estableiones como se ve en las parcelas FACS y un mejor rendimiento y pureza de espermátidas ordenados en un período de clasificación 8 hr. Además, los consejos técnicos proporcionados para el clasificador FACS configuración definitivamente ayudan a aumentar la eficiencia global de la clasificación al evitar obstrucciones celulares o la contaminación cruzada en la recogida de los tubos. Alternativamente, las puertas se pueden ampliar para aumentar el número de células clasificadas, resultando eventualmente en una pequeña disminución en la pureza de la población, que puede ser aceptable para algunos estudios. Además, las células germinales fijados con etanol teñidas con SYTO16 son muy estable a 4 ° C y pueden ser ordenadas por más de 8 horas con ajustes de compuerta limitados y supervisión. En última instancia, de varios días de clasificación pueden ser combinados para obtener un número suficiente de células para cualquier aplicación.
Espermátidas de flujo ordenados obtenidos como se describe aquí pueden ser utilizados para una variedad de experimentos. ADN de estas células puede ser fácilmente extraído por medio de kits de purificación de ADN genómico comerciales y demostróa ser de calidad adecuada para los análisis de PCR y secuenciación 9 próxima generación (datos no mostrados). Espermátidas Sorted también pueden ser utilizadas para análisis de proteínas 9 donde hemos realizado varios inmunotransferencias contra marcadores específicos de fase para confirmar la alta pureza de las espermátidas clasificadas. Verificamos la integridad celular de las espermátidas ordenados y encontramos que el núcleo y el citoplasma de todas las poblaciones se mantienen intactos. Sin embargo, encontramos una proporción de pasos 13-14 espermátidas y una proporción menor de pasos 15-16 espermátidas que faltan su flagelo (datos no mostrados). Por lo tanto, las poblaciones de células germinales altamente puras ordenadas uso de este enfoque son adecuados para los análisis proteómicos y genómicos, así como otras aplicaciones.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Leonid Volkov y Éric Bouchard por su asesoramiento técnico en relación con la microscopía de epifluorescencia.
Apoyo financiero
Financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención # MOP-93781) de GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
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