Abstract
Дифференцировка сперматидах мыши один важный процесс для производства функциональной мужской гаметы с интактным геном в который должен быть передан следующему поколению. Пока, молекулярные исследования этого морфологического перехода были затруднены из-за отсутствия метод, позволяющий достаточное разделение этих важных шагов сперматид дифференциации для последующих анализов. Ранее попытки правильного стробирования этих клеток с использованием проточной цитометрии, возможно, было трудно из-за своеобразного увеличению флуоресценции ДНК в сперматидах проходящих ремоделирование хроматина. Основываясь на этом наблюдении, мы предоставляем подробную информацию о простой проточной цитометрии схеме, что позволяет воспроизводимое очищение четырех популяций мыши сперматидах фиксированных этанолом, каждый из которых представляет различные состояния в процессе ядерного ремоделирования. Обогащение населения подтверждается с помощью ступенчатых конкретных маркеров и морфологических критерии. Очищенные Сперматиды могут быть использованы для геномных и протеомныеIC анализов.
Protocol
Уход за животными было в соответствии с ухода за животными и использование комитета Шербрукский университет.
1. Подготовка трубки
- За день до сортировки клеток, добавить 1-2 мл инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) до 5 мл полипропиленовые с круглым дном труб и 15 мл и 50 мл конические пробирки из полипропилена.
Критический шаг: Убедитесь, что каждый трубки используется в протоколе является покрытием.
Примечание: ФБС покрытие предотвращает зародышевые клетки от прилипания к стенок трубки. - Медленно перемешать O / N инверсией при 4 ° С для покрытия трубки равномерно с помощью поворотного устройства.
- На следующий день, удалить FBS из труб с покрытием путем декантации.
- * Критический шаг: Убедитесь, что в 5 мл полипропиленовые круглым дном трубы и трубки, используемые для клеточного препарата 15 и 50 мл (протокол шаги 2.1 до 2.11) полностью очищена от FBS, чтобы предотвратить раздувание (т.е. неточное отклонение боковых потоков). Используйте P200 пипетки, чтобы удалить FBS.
- Оставьте небольшой остаточный объем FBS (100-200 мкл) в полипропилена 5 мл с круглым дном и труб, используемых для сбора очищенных клеток.
- * Критический шаг: Убедитесь, что в 5 мл полипропиленовые круглым дном трубы и трубки, используемые для клеточного препарата 15 и 50 мл (протокол шаги 2.1 до 2.11) полностью очищена от FBS, чтобы предотвратить раздувание (т.е. неточное отклонение боковых потоков). Используйте P200 пипетки, чтобы удалить FBS.
2. Подготовка сотового
- Жертвоприношение один мужчина мышь под наркозом с помощью O 2 / изофлуран (индукция в 5%, то поддерживается на уровне 2%), а затем СО 2 удушья.
- Акциз и decapsulate оба яички и пропустить через мясорубку с маленькими ножницами в 500 мкл буфера сортировки в 1,5 мл трубки.
- Флеш зародышевые клетки семенных канальцев по нежным вверх и вниз пипеткой в 1,5 мл трубки, впервые с усеченной 100-1000 мкл кончика, а затем с неповрежденной наконечником 100-1000 мкл.
- Удалите мусор и комья по шаге фильтрации с использованием фильтр 40 мкм клеток и собрать фильтрат в 50 мл конических труб предiously покрыты FBS в шаге 1.
- Промойте фильтр один раз с сортировкой буфер до общего объема 3 мл и передачи фильтрата в 15 мл коническую трубку, ранее покрытой в шаге 1.
- Добавить 16 мкл 50 мМ ЭДТА, рН 8 на миллилитр суспензии клеток (48 мкл в течение 3 мл), чтобы получить конечную концентрацию 0,8 мМ ЭДТА.
- Чтобы исправить зародышевые клетки, постепенно добавить 3 объема ледяной 100% этанола с помощью 10 мл пипетки при осторожном перемешивании (вихревую при низкой скорости), который будет производить молочный подвески.
Критический шаг: Медленно добавлением этанола важно и важно сохранить целостность клеточного препарата. Мы отметили, что быстрое добавление этанола вызывает лизис клеток в результате крупного снижения сортировки эффективности. Для 3 мл клеточной суспензии, должны быть добавлены 9 мл этанола примерно 1 мин. - Инкубируйте клетки на льду в течение 15 мин с периодическим перемешиванием инверсией.
- Центрифуга клеточной суспензии при 800 мкг в течение 5 мин и снять ясносупернатант.
- Аккуратно ресуспендирования фиксированные половых клеток в 2 мл буфера сортировки.
- Добавьте 4 мкл красителя SYTO16 ДНК (1 мМ раствора в ДМСО) и инкубировать в течение не менее 30 мин (в защищенном от света).
Примечание: Лучшие сортировки результаты получаются при использовании SYTO16, так как это проницаемой краситель ДНК, который легко включены в очень уплотненных ядер сперматидах.
3. Клеточный сортер Настройка
Примечание: Здесь, 4-Laser (405 нм - фиолетовый, 488 нм - синий, 561 нм - желто-зеленый, 633 нм - красный) 20-параметр BDFACSAria III клеток сортировщик используется. 6.1.3 Программное обеспечение BD FACSDiva используется для визуализации и анализа данных. Параметры могут различаться в зависимости от типа используемого сортировщика.
- Стерилизовать сортировщик FACS, запустив 70% этанола в качестве оболочки жидкости во время процедуры струйная отключения (меню "Цитометр" в программном обеспечении) до сортировки. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "жидкостный шutdown ". Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
- Подготовка и фильтровать 1X PBS с 0,22 мкм фильтр таким образом, чтобы устранить любые кристаллы и примеси. Заполните оболочки бака к верхней линии шва на внутренней стороне резервуара.
- Запустите программу и войти. Запустите сортировщик FACS, чтобы согреться лазеров, по крайней мере 30 мин до сортировки. Запустите два жидкостных процессов запуска, чтобы спугнуть этанола из струйной. Выберите "цитометром" на панели инструментов программного обеспечения и выберите "текучей" запуск. Следуйте инструкциям, упомянутые процессы.
Примечание: Эта восстанавливает струйной оболочки с нормальной жидкости (1x PBS). - Очистите блок сортировки и отклоняющие пластины с дистиллированной водой и высушите их полностью. Разрушать ультразвуком сопло 100 мкм, помещенный в трубку дистиллированной воды в течение 2 мин в ультразвуковой в ванне. Протрите сопла тщательно.
- Вставьте сопло 100 мкм в проточную кювету и повернуть насадку-фиксирующий рычаг по часовой стрелке в 12Положение ч. Установите давление оболочка 20 фунтов на квадратный дюйм в.
- Включите потока и регулировки амплитуды, чтобы получить целевые значения для частоты (около 30), падение 1 (около 150) и Gap (около 12) и создать стабильную капель отрыва шаблон (несколько капель спутниковое). Выключите ослабление.
- Убедитесь, что поток прямо и попадает в центр аспиратора отходов путем изменения угла сортировки блока. Примечание: Насадка 130 мкм в 10 фунтов на квадратный дюйм также была протестирована и не очевидная разница не было найдено.
- Установите лазер задержка 0 для синего, -77.39 на красный, 37.33 для фиолетового и -39.85 для желто-зеленых лазеров.
- Установить области масштабирования до 1,14 для синего, 1,0 для красного, 0,75 для фиолетовых и 0,96 для желто-зеленых лазеров.
- Использование теста Сортировать (в окне "Сторона поток" программного обеспечения), чтобы убедиться, что боковые потоки не раздувая. В окне "Сторона поток", отрегулируйте ползунки напряжения каждого бокового потока, так что они попали в middlе сбора пробирку. Если центр поток не плотно, отрегулировать 2-й, 3-й и 4-й параметры, чтобы ограничить падение центральную поток.
- Начните цитометра настройки и применения слежения (CS & T) в программном обеспечении (меню "Цитометр").
- Используйте цитометра настройки и слежения бусы на 1 капле на 350 мкл для автоматизации характеристика и отслеживание цитометра производительности, используя инструкции производителя.
- Выйти из программы CS & T. Применить настройки CS & T, убедитесь, что параметры потока по-прежнему позволяют стабильный паттерн капель отрыва, и включите кнопку Sweet Spot, как описано в инструкции производителя (в "окне" отрыва).
- Оптимизация стоимости падение задержки, используя флуоресцентные шарики (см таблицу материалов).
- Установите трубки сбора в держателе. Откройте рода блок дверь. В окне "Сторона поток», включите напряжения, затем выберите "Тест рода "и нажмите кнопку Аспиратор ящика, чтобы открыть ящик и иметь доступ к трубам сбора.
- Оптимизация боковые потоки, чтобы они идут в центре трубки. Отрегулируйте значения ползунков и по мере необходимости.
- Закройте дверь блока сортировки и убедитесь, что для регулировки микрометра диск, чтобы получить яркий шарик место в центре. Очистить отходов ящик, тест вроде и напряжения. Удалить труб сбора.
- Оптимизация задержки падение в соответствии с инструкциями производителя.
- Вкратце, пожать шарик флакон энергично и развести 1 каплю бисера в 0,5 мл PBS.
- Использование инструкции производителей, установить задержку падение, используя шаблон эксперимента падения задержки, доступные в программе. В качестве альтернативы, используйте функцию автоматического задержки падения установить задержку падение.
- Загрузите трубку флуоресцентных бисером и регулировать расход до пороговой скорости не ~ 3000 до 4000 событий / сек. Установите точность сортировки "Первоначальный" и последнийLY, чтобы "Точная настройка" в окне "Сортировать макета". Выберите оптический фильтр и сортировать шарики. Отрегулируйте задержку падения до ~ 100% не сортируются влево.
Примечание: Этот шаг является критическим, чтобы убедиться, что клетки процентной рода в виде бокового потока. Шарики и оптический фильтр используется для достижения близко к отклонению капель 100%.
- Поставьте FSC 1.5 нейтрального (ND) фильтр в левой части детектора FSC блока. Установите расширение окна до 2,00 мкс и масштабирование FSC площадь в 1,00 (на вкладке "Лазер" в окне "цитометром").
- Перед загрузкой пробирку, Поместите образец фильтра линию 50 мкм в конце линии пробы, чтобы избежать образования комков. Чтобы сделать это, выберите "Изменить Образец фильтр" в меню "цитометром".
- Испытание состава пробы жидкости, чтобы достичь хорошего разделения, не раздувают между бокового потока и предотвратить клетки от прилипания к Полипропилепе трубы.
- Загрузите пробирку, включите отклоняющих пластин и выберите "Test-то" с выдвижной ящик закрыт. Посмотрите на боковых потоков, если разделение происходит не слишком много Фаннинг.
Примечание: Раздувание вероятно из-за высокой концентрации белка в буфере выборок.
- Загрузите пробирку, включите отклоняющих пластин и выберите "Test-то" с выдвижной ящик закрыт. Посмотрите на боковых потоков, если разделение происходит не слишком много Фаннинг.
- Загрузка пробирку в прибор FACS. Выберите образец перемешивание 300 об и температуре образца 4 ° С. Выберите "Получение данных" в "Приобретение панели".
- При необходимости, разбавить образец, чтобы достичь соответствующей скорости событии, не более 5000 событий / сек (при максимальной скорости потока 3,0). Строго соблюдать эти пределы с тем, чтобы поддерживать чистоту отсортированных клеток.
- Для анализа и сортировки клеток, оптимизировать пороговое значение FSC устранить мусор, не мешая населения интерес. В логарифмической шкале, отрегулируйте напряжение фото-мультипликатор (ФЭУ) детектор с фильтром 530/30 для того, чтобы сделатьУбедитесь, что сигнал флуоресценции от общей численности населения вписывается в масштабе, и ворота на положительной популяции (рис 1, ворота 1).
- Произведите рассеяния вперед-зону (FSC-A) / бокового рассеяния-зоны (SSC-А) сюжет SYTO16 положительного населения и регулировать FSC-A около 110 В в линейном масштабе, а SSC-А около 150 V в логарифмической шкале, чтобы визуализировать все события, исключая очень крупные клетки и клеточных агрегатов.
- В окне "Layout" Сортировать установите "режим сортировки Precision" на "4-полосная чистота" (Выход маска: 0, чистота Маска: 32 Фаза Маска: 0). Выберите "Непрерывный" в меню "События" Целевые непрерывного сортировки.
- Добавить населения для сортировки в области, соответствующей труб (в окне "Layout" Сортировать). Место населения с более высокими частотами в середине и с более низкими частотами на концах. Установите пластины напряжения до 2500 В. При сортировке, держать сбора образец Тмассовые рассылки по льду.
4. Сотовый Сортировка
- Непосредственно перед сортировка, клетки фильтр, использующий фильтр 50 мкм в ранее покрытой 5 мл полипропилен круглый нижний трубку.
- Промойте фильтр широко 1-2 мл буфера сортировки.
- Сортировать неподвижные половые клетки, используя 488 нм лазерный оборудованный сортировщик клеток следующую схему стробирования, изображенной на рисунке 1. Соберите очищенные фракции в 5 мл полипропиленовые пробирки с круглым дном, предварительно покрытые в разделе 1 на льду.
- Убедитесь, что 100-200 мкл FBS хранится в трубах, чтобы избежать сбора налипание отсортированных клеток в стенке трубы.
- Убедитесь, что концентрация SYTO16 насыщается, чтобы избежать колебания флуоресценции во время сортировки периода. SYTO16 насыщается, когда нет еще вариация интенсивности окрашивания клеток на 488 параметров (окрашивания ДНК) Alexa Fluor сортировочных графики. Если необходимо, добавьте 1 мклSYTO16 в сортировочный трубки для достижения насыщения.
- Отображает общее события на графическом отображаются следующие параметры: количество событий VS Alexa Fluor 488-A.
- Выберите положительное окрашивание ДНК клетки ворота 1, как показано на рисунке 1.
- Показать клетки ворот 1 на графике с использованием SSC-A против FSC-A в качестве параметров
- Выделите ячейки с Gate 2, как показано на рисунке 1.
- Показать клетки от ворот 2 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
- Выберите ячейки с воротами 5 и 6 на ворота Ворота 2 графика, как показано на рисунке 1.
- Дисплей отдельно ворота 5 и 6 на ворота графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
- Выберите спермиогенез шаги 1-9 сперматид на графическом ворота 5 и спермиогенез шаги 10-12 сперматид на воротах 6 графики, как показано на рисунке 1.
- Дисплейклетки из ворот 1 на графике с использованием FSC-A против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров
- Выберите ячейки с ворот 3 и 4 ворот, как показано на рисунке 1.
- Дисплей отдельно ворота 3 и 4 ворот на графики с использованием Alexa Fluor 488-W против Alexa Fluor 488-А в качестве параметров.
- Выберите спермиогенез шаги 13-14 сперматид на ворота 3 графических и спермиогенез шаги 15-16 сперматид на ворота 4 графика, как показано на рисунке 1.
- Показать клетки ворот 1 на графике с использованием SSC-A против FSC-A в качестве параметров
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стратегия Память используется с проточной цитометрии
Рисунок 1 представляет собой стратегию стробирования используется в проточной цитометрии для сортировки четыре высокой чистоты популяции сперматид. Вкратце, клетки с окрашиванием положительной ДНК (Alexa Fluor 488-А) сначала выбирается ворота 1. сперматидах от сперматогенеза шаги 1-12 выбранной (Gate 2) на точечной график, показывающий зернистости (SSC-A) относительно размера (FSC -A) от ворот 1. Затем Сперматиды от сперматогенеза шаги 1-9 и 10-12 спермиогенез шаги могут быть отделены друг от друга в соответствии с изменением интенсивности окрашивания в ДНК (Ворота 5 и 6). Сперматидах от сперматогенеза шаги 13-14 и 15-16 непосредственно выбран из положительно окрашенных клеток на дот график, показывающий размер (FSC-A) против окрашивания ДНК (Alexa Fluor 488-А) (вентили 3 и 4). Все отсортировано популяции пересмотрены с Alexa Fluor 488-Вт против Alexa Fluor 488-точка пятна для увеличения ИК чистота.
Проверка схемы очистки с помощью микроскопии эпифлуоресцентной
Рисунок 2 представляет DAPI окрашивание отсортированных популяций сперматидах с помощью проточной цитометрии. Спермиогенез шаги 1-9 Сперматиды отображения типичный круглые ядра круглых сперматид и овальной формы ядра спермиогенез шаг 9 сперматидах. Спермиогенез шаги 10-12 Сперматиды показать большой форме крюка элонгации ядро. Спермиогенез шаги 13-14 и 15-16 Сперматиды имеют аналогичную профилированного ядро, но немного отличаются по интенсивности окрашивания ДНК, что позволило их сортировку. Шаги дифференциации и чистоты различных популяций отсортированных также определить с помощью конкретных биомаркеров, как описано в предыдущем исследовании 9. Чистоту отсортированных популяций сперматид изображен в таблице 1.
Палатка "FO: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рисунок 1. Подробная стратегия стробирования для сортировки населения сверхчистых сперматид. Схематическое представление стратегии стробирования, используемой для сортировки спермиогенез шаги 1-9 сперматид, шаги 10-12 сперматид, шаги 13-14 сперматид и шаги 14-16 Сперматиды одновременно с 488 нм лазерной оборудованы ячейки сортировщик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Визуализация отсортированных по сперматидах эпифлуоресцентной. Сорт Сперматиды которые cytospined на предметных стеклах, окрашивают DAPI и визуализировали с помощью микроскопа эпифлуоресцентной с соответствующими фильтрами для DAPI и оснащены ПЗС окрой. Клетки показывают в перевернутой шкале серого. Бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Тип клетки наблюдается в большинстве | Чистота | Приблизительное количество клеток (8 ч сортировка) | Загрязняющие вещества | |
| Население 1 | Шаги 1-9 сперматид | 99-100% | 4000000 | Шаг 10 сперматид |
| Население 2 | Шаги 10-12 сперматид | 95-98% | 1000000 | Сперматоциты |
| пopulation 3 | Шаги 13-14 сперматид | 99-100% | 800000 | Сперматоциты, шаги 1-9 сперматид |
| Население 4 | Шаги 15-16 сперматид | 98-100% | 1500000 | Сперматоциты |
Таблица 1: Сортировать населения сперматид и их загрязнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сперматогенного клетки всегда был сложным для изучения, учитывая сложность семенных эпителия, а также ограниченный успех культуры в пробирке. На протяжении многих лет, многие методы, чтобы очистить разработаны зародышевые клетки из различных видов. Методы очистки с использованием седиментационных гравитации с перколлом или бычьим альбумином сыворотки градиентов обычно обеспечивают хороший выход интактных клеток зародышевых, но не имеют соответствующего определения между некоторыми типами клеток, таких как мейоза тетраплоидного клеток и сперматидах 10. Кроме того, эти методы требуют специальных устройств (часто самодельные), которые не могут быть легко доступны для многих лабораторий, которые оказывает им трудно воспроизвести без громоздкого проб и ошибок. Эти методы также много времени, очень чувствительны к вибрации и неудобно, так как устройство, как правило, хранили при 4 ° С для поддержания жизнеспособности клеток. При успешном методы осаждения, однако обеспечить несколько миллионов очищенный живой грлоктей в популяции. Тем не менее, низкий уровень обогащения клеток, что может быть достигнуто является основным недостатком этих методов, как это редко достигает более 80-90% чистоты. В некоторых случаях, загрязнение 10-20% от других типов клеток присутствует при измерении ДНК, РНК или белка, который представляет собой серьезное препятствие для молекулярных анализов.
При поиске, чтобы улучшить чистоту клеточных популяций, некоторые исследователи в сочетании свободное осаждение с другими методами. Одним из наиболее эффективных подходов состоит в использовании незрелым мышам, чтобы ограничить количество различных клеточных популяций, представляющих более поздних этапах. Можно воспользоваться первой волны сперматогенеза и получить препарат, содержащий клетки зародышевые клетки до данной стадии дифференцировки, основанной на их последовательного появления после рождения. Тем не менее, это в сочетании подход требует больше животных, чтобы компенсировать ограниченное количество исходного материала, и все же не решает отсутствие definition методов седиментации. Кроме того, такой подход не может быть применен на практике для более поздних типов клеток, таких как сперматидах, но используется в основном для сперматогониев и первичной сперматоцит. Кроме того, есть некоторые доказательства, что первая волна сперматогенеза может питать клетки со слегка различными свойствами, чем езда на велосипеде эпителия зрелого мышей 11,12.
Витамин А синхронизация сперматогенеза также используются для улучшения очистки клеток зародышевого так как эта процедура сужает число стадий, присутствующих в семенниках обработанных животных. Тем не менее, эта процедура в основном используется для синхронизации сперматогенез у крыс, с некоторым успехом сообщили в мышей 13,14. Из нашего собственного опыта, витамин А синхронизации у мышей отнимает много времени, редко дает воспроизводимые результаты и производит вредные побочные эффекты вызывает озабоченность о сотовой целостности эпителия семенных.
Otheг группы успешно используется проточной цитометрии, чтобы очистить зародышевые клетки от мыши 15-18. Тем не менее, ни один из них не сообщил очистку сперматид населения последние шаги круглые сперматидах. Наша стратегия стробирования позволяет очистить четыре высокоочищенные населения гаплоидных клеток, представляющих важные шаги дифференциации поддающиеся молекулярных исследований. Основным ограничением метода, описанного в этой статье, может быть ограниченным выход отсортированных клеток. Высокий уровень чистоты, полученный несколько за счет количества отсортированных клеток. Тем не менее, чтобы убедиться, что условия сортировки являются оптимальными, мы добавили несколько важных советов к протоколу. Все эти технические советы направлены на повышение либо номер или чистоту, отсортированных сперматидах. Например, использование FBS покрытием трубки во многом уменьшает сортировки потерю клеток, которые прилипают к трубам. Кроме того, с помощью насыщения концентрация SYTO16 помогает уменьшить вариации интенсивности окрашивания ДНК, приводящие к более стабильной populatионы, как видно на FACS участков и с более высоким выходом и чистотой отсортированных сперматидах над сортировки период 8 ч. Кроме того, предлагаемые технические советы для FACS сортировщик настройке, безусловно, поможет увеличить общую эффективность сортировки, избегая клеток сабо или перекрестного загрязнения в сборе трубы. Кроме того, ворота могут быть расширены, чтобы увеличить количество отсортированных клеток, в конечном счете, приводит к небольшому уменьшению чистоты популяции, которая может быть приемлемым для некоторых исследований. Кроме того, этанол фиксированной зародышевые клетки, окрашенные SYTO16 очень стабильны при 4 ° С и может быть отсортирован в течение более 8 часов с ограниченными корректировки литниковых и наблюдением. В конечном счете, через несколько дней сортировки может быть объединены, чтобы получить достаточное количество клеток для любого применения.
Поток сортируются Сперматиды полученные, как описано здесь, может быть использован для различных экспериментов. ДНК из этих клеток могут быть легко извлечены с использованием коммерческих наборов геномных ДНК очистки и продемонстрировалчтобы быть надлежащего качества для ПЦР анализ 9 и следующего поколения секвенирования (данные не показаны). Сортировка Сперматиды также могут быть использованы для анализа белка 9, где мы провели несколько иммуноблоттинга против стадии конкретных маркеров для подтверждения высокую чистоту, отсортированных сперматидах. Мы проверили клеточную целостность отсортированных сперматидах и обнаружили, что ядро и цитоплазма всех групп населения остаются нетронутыми. Тем не менее, мы нашли часть шагов 13-14 сперматидах и меньшую долю шагов 15-16 сперматидах, которые отсутствуют их жгутик (данные не показаны). Следовательно, высокой чистоты популяции клеток сортируются зародышей с использованием этого подхода являются подходящими для протеомическим и геномных анализов, а также других применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Леонид Волков и Эрик Бушар их технической консультации по эпифлуоресцентной микроскопии.
Финансовая поддержка
Финансируемого Канадским институтом медицинских исследований (грант № СС-93781) в ГБ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
