Abstract
マウスの精子細胞の分化は、無傷のゲノムと機能的雄性配偶子の製造のための1つの重要なプロセスは、次の世代に伝達されます。これまでのところ、この形態転移の分子研究はその後の分析のために精子細胞分化のこれらの重要なステップの適切な分離を可能にする方法の欠如によって妨げられてきました。フローサイトメトリーを使用して、これらの細胞の適切なゲーティングでの初期の試みが原因クロマチンリモデリングを受けて精子細胞におけるDNA蛍光の独特の増加のために困難であったかもしれません。この観察に基づいて、我々は、エタノールで固定したマウス精子の4集団、核リモデリングプロセスに異なる状態を表す各の再現性精製を可能にする、シンプルなフローサイトメトリー方式の詳細を提供します。人口濃縮は段階特異的なマーカーおよび形態学的規準を用いて確認されています。精製された精子細胞は、ゲノムやプロテオームのために使用することができますIC分析します。
Protocol
動物のケアは、シャーブルック大学の動物の管理と使用委員会に従いました。
1.チューブの準備
- 細胞選別の前日には、5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブに熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）1〜2mlのを追加し、15ミリリットル、50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに。
重要なステップ：プロトコルで使用されるすべてのチューブが被覆されていることを確認してください。
注意：FBSコーティングは、管壁に付着する生殖細胞を防ぐことができます。 - ゆっくりとチューブが均一に回転子を使用して被覆するために4℃での反転により、O / Nを混ぜます。
- 翌日、デカントすることにより、コーティングされたチューブからFBSを削除します。
- *重要なステップ：5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブおよび細胞調製のために使用される15、50 mlチューブは、（プロトコルは2.11から2.1ステップ）完全にファニング（サイドストリームのすなわち、不正確な偏差）を防止するために、FBSを空にしていることを確認します。 FBSを削除するには、P200のピペットを使用してください。
- 精製された細胞を収集するために使用される下部チューブラウンド5ミリリットルポリプロピレンでFBSの小残留量（約100〜200μl）を残して下さい。
- *重要なステップ：5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブおよび細胞調製のために使用される15、50 mlチューブは、（プロトコルは2.11から2.1ステップ）完全にファニング（サイドストリームのすなわち、不正確な偏差）を防止するために、FBSを空にしていることを確認します。 FBSを削除するには、P200のピペットを使用してください。
2.細胞調製
- CO 2窒息続く（5％誘導はその後、2％に維持）、O 2 /イソフルランを使用して麻酔下で1人の男性にマウスを生け贄に捧げます。
- 消費税及び1.5ミリリットルチューブにバッファをソートする500μlの小さなハサミでカプセル開放を行う両方の精巣およびミンチ。
- フラッシュ生殖最初切り捨て100-1,000μlの先端で1.5ミリリットルチューブで優しく上下にピペッティングにより精細管からの細胞、およびその後そのまま100-1,000μlの先端で。
- 40μmのセルストレーナーを使用して、1つの濾過工程によって破片や塊を取り除き、50mlのコニカルチューブの前にろ液を集めますiouslyステップ1でFBSをコーティングしました。
- 以前手順1でコーティングされた15ミリリットルコニカルチューブに合計3 mlの容量と転送ろ液までのバッファを並べ替えて、フィルタを1回洗浄します。
- 0.8 mMのEDTAの最終濃度を得るために、細胞懸濁液（3ミリリットル48μl）を1ミリリットル当たり50ミリモルのEDTA pHが8の16μLを追加します。
- 生殖細胞を固定するために、ゆっくりと乳白色の懸濁液が生成される穏やかな撹拌（低速でボルテックス）で10mlのピペットを使用して、氷冷100％エタノール3容量を追加します。
重要なステップ：ゆっくりとエタノールを加え細胞調製物の完全性を維持することが重要と重要です。私たちは、エタノールの急速な添加は効率をソートの主な減少で得られた細胞溶解を引き起こすことを指摘しました。 3ミリリットルの細胞懸濁液は、エタノール9mlを約1分で添加されるべきです。 - 反転による時々混合しながら氷上で15分間細胞をインキュベートします。
- 5分間800×gで遠心し細胞懸濁液とクリアを削除上清。
- 静かにバッファをソート2ml中の固定された生殖細胞を再懸濁します。
- SYTO16 DNA色素（DMSO中の1 mM溶液）の4μlを添加して、（光から保護）は、少なくとも30分間インキュベートします。
注：これは容易に精子細胞の高度に圧縮された核内に組み込まれる透過性DNA色素であるため、最高のソート結果をSYTO16を用いて得られます。
3.セルソーターを設定
注：ここでは、4-レーザー（405nmの - 紫、488nmの - 青、561 nmの - 黄緑色、633nmの - 赤）20パラメータBDFACSAria IIIセルソーターを用いています。 BD FACSDiva 6.1.3ソフトウェアは、データを視覚化し、分析するために使用されます。設定が使用ソータの種類に応じて変えることができます。
- 選別前に流体のシャットダウン手順（ソフトウェアで「サイトメーター」メニュー）の間にシース液として70％エタノールを実行して、FACSソーターを滅菌します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体のshを選択。 "をutdownプロセスで述べた手順に従ってください。
- 準備し、任意の結晶および汚染物質を除去するように、0.22μmのフィルターを用いて1×PBSをフィルタリングします。タンク内の上側の溶接線にシースタンクを埋めます。
- ソフトウェアを起動し、ログインします。選別前に少なくとも30分間レーザーを温めるために、FACSソーターを開始します。流体工学からエタノールを洗い流すために、2つの流体起動プロセスを実行します。ソフトウェアのツールバーにある「サイトメーター」を選択し、「流体の起動」を選択します。プロセスで述べた手順に従ってください。
注意：これは、通常のシース液（1×PBS）で流体工学を復元します。 - ブロックソート、蒸留水で偏向板をきれいにし、それらを徹底的に乾燥させます。超音波処理浴中で2分間蒸留水管に入れ100μmのノズルを超音波処理します。徹底的にノズルを拭きます。
- フローセルに100μmのノズルを挿入し、12にノズルロックレバーを時計回りに回します時間位置。 20 PSIにシース圧を設定します。
- ストリームをオンにして、周波数の目標値を取得するために振幅を調整（30前後）、ドロップ1（150前後）とギャップ（12前後）、安定した液滴切り離しパターン（数サテライト滴）を確立します。減衰をオフにします。
- ストリームがストレートで、ソートブロックの角度を変更することにより、廃棄物の吸引器の中心に当たることを確認します。注：10 psiで130μmのノズルも試験したと明らかな差は見られませんでした。
- 黄緑色レーザ用、青紫、赤のため-77.39、37.33および-39.85 0に設定レーザー遅延。
- 黄緑色レーザ用、青紫赤1.0、0.75と0.96のための1.14へのスケーリング設定の領域。
- （ソフトウェアの「サイドストリーム」ウィンドウ内の）試験ソートを使用して、サイドストリームがファニングされていないことを確認してください。彼らはmiddlを打つように、「サイドストリーム」ウィンドウでは、各副流の電圧スライダーを調整テストコレクションチューブのE。中央ストリームが固まっていない場合は、中央の流れを制限するために、2位、3位、および4 番目のドロップ設定を調整します。
- サイトメーターのセットアップとソフトウェアの追跡（CS＆T）アプリケーション（「サイトメーター」メニュー）を起動します。
- 製造元の指示を使用して、サイトメーターの性能の特徴付けおよび追跡を自動化するために、350μlのあたり1滴でサイトメーターセットアップおよび追跡ビーズを使用してください。
- CS＆Tのアプリケーションを終了します。 CS＆Tの設定を適用し、ストリーム・パラメータがまだ安定した液滴切離しパターンを可能にし、（「切り離しウィンドウ」で）を、製造業者の説明書に記載されているようにスイートスポットボタンをオンにしてください。
- 蛍光ビーズを使用してドロップ遅延値を最適化（材料の表を参照のこと）。
- ホルダーに収集チューブを取り付けます。ソートブロックのドアを開きます。 「サイドストリーム」ウィンドウで、「選択した電圧をオンにしますテストソート」と引き出しを開き、コレクションチューブにアクセスできるようにアスピレーター引き出しボタンをクリックします。
- 彼らは、チューブの中央に入るように、サイドストリームを最適化します。必要に応じて値スライダを調整します。
- ソートブロックのドアを閉じて、中央に明るいビーズスポットを得るために、マイクロメーターダイヤルを調整してください。選択を解除廃棄引き出し、テストの並べ替えと電圧。コレクションチューブを外します。
- 製造者の指示に従って降下遅延を最適化します。
- 簡単に説明すると、ビーズバイアルを激しく振とうし、PBS 0.5mlのビーズの1滴を希釈します。
- 製造者の指示を使用して、ソフトウェアで使用可能なドロップディレイ実験テンプレートを使用して、ドロップ遅延を設定します。また、ドロップ遅延を設定するには、[自動ドロップ遅延機能を使用しています。
- 蛍光ビーズのチューブをロードし、しきい値率が〜3,000〜4,000のイベント/秒になるまで流量を調整します。 「初期」と最後にソート精度を設定します。LY「ソートレイアウト」ウィンドウの「微調整」します。光学フィルタを選択して、ビーズを並べ替えます。 〜100％を左にソートされるまで、ドロップディレイを調整します。
注：この手順は必ず側流への関心の種の細胞ことを確認することが重要です。ビーズと光学フィルタ100％滴偏差に近い達成するために使用されます。
- FSC検出器ブロックの左端にFSC 1.5 ND（減光）フィルターを置きます。 （「サイトメーター」ウィンドウで、「レーザー」タブで）1.00に2.00マイクロ秒とFSCエリアのスケーリングにウィンドウの拡張機能を設定します。
- サンプルチューブをロードする前に、凝集を避けるために、サンプルラインの最後に50μmのサンプルフィルタラインを配置します。これを行うには、「サイトメーター」メニューの「サンプルフィルタを変更」を選択します。
- サイドストリーム間ファニングずに良好な分離を達成するために、試料流体の組成をテストしpolypropyleに付着する細胞を防ぐためにNEチューブ。
- サンプルチューブをロードし、偏向板をオンにして引き出しを閉じた状態で「テストの並べ替え」を選択します。分離はあまりファニングせずに発生した場合、サイドストリームを見てください。
注：ファニング起因サンプル緩衝液中に高タンパク質濃度に思われます。
- サンプルチューブをロードし、偏向板をオンにして引き出しを閉じた状態で「テストの並べ替え」を選択します。分離はあまりファニングせずに発生した場合、サイドストリームを見てください。
- FACS装置にサンプルチューブをロードします。 300 rpmでのサンプルの攪拌と4℃の試料温度を選択します。 「取得ダッシュボード」の「データを取得」を選択します。
- 必要に応じて、（3.0の最大流量で）5,000イベント/秒の最大値に適切なイベント・レートを達成するために、サンプルを希釈します。選別された細胞の純度を維持するように厳密にこれらの制限を尊重しています。
- 分析し、細胞を選別するために、関心の集団に干渉することなく、破片を除去するためにFSC閾値を最適化します。対数目盛では、作るために530/30フィルタを備えた光電子増倍管（PMT）検出器の電圧を調整総人口の蛍光シグナルが陽性集団（ 図1、ゲート1）のスケールに収まると、ゲートことを確認してください。
- SYTO16陽性集団の前方散乱面積（FSC-A）/側方散乱エリア（SSC-A）のプロットを生成し、約110 VリニアスケールでにFSC-Aを調整し、SSC-A約150 Vに非常に大規模な細胞および細胞凝集体を排除しながら、対数スケールですべてのイベントを可視化しました。
- 「ソートレイアウト」ウィンドウで、「ソート精度モード」に設定」4ウェイ純度」に（収量マスク：0、純度マスク：32、位相マスク：0）。連続ソートのための「ターゲットイベント」メニューから「連続」を選択します。
- （「ソートレイアウト」ウィンドウ）のチューブに対応するフィールドでソートする集団を追加します。高い真ん中の周波数と端部で低い周波数を持つものと集団を置きます。 、並べ替え中に2,500 Vに電圧プレートを設定し、サンプル収集トンを保ちます氷上ubes。
4.セルソーティング
- すぐにソートする前に、丸底チューブを先にコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン50μmのフィルターを用いてフィルタセル。
- バッファをソート1-2 mlの広範囲にフィルターを洗ってください。
- 図1に詳述ゲーティング方式以下の488 nmレーザーを搭載したセルソーターを使用してソート固定生殖細胞は、以前に氷の上のセクション1でコーティングされた5ミリリットルポリプロピレン丸底チューブ内の精製画分を収集します。
- FBSの100〜200μlのが管壁に選別された細胞の付着を回避するために、コレクションチューブに保たれていることを確認します。
- SYTO16の濃度が仕分け期間中に蛍光の変動を回避するために飽和していることを確認します。仕分けグラフィックでアレクサフルオロ488パラメータ（DNA染色）での細胞染色強度のさらなる変化がない場合SYTO16が飽和しています。必要に応じて、1μlを添加します飽和状態に達するまでの仕分けチューブにSYTO16。
- アレクサフルオロ488-A VSイベントの数：次のパラメータを表示し、グラフィック上の総イベントを表示します。
- 図1に示すように、ゲート1の正DNA染色細胞を選択します。
- パラメータとしてFSC-A対SSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1から表示セル
- 図1に示したように、ゲート2でセルを選択します。
- パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート2から表示セル。
- 図1に示したように、ゲート2のグラフィックの上にゲート5とゲート6とセルを選択します。
- パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックに表示され、別々にゲート5及びゲート6。
- 選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート5グラフィックと精子は、ゲート6グラフィックスに10-12精子細胞をステップに1-9精子細胞を繰り返します。
- 表示パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対FSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1からの細胞
- 図1に示したように、ゲート3とゲート4とのセルを選択します。
- パラメータとしてアレクサフルオロ488-A対アレクサフルオロ488-Wを使用してグラフィックスの表示を別々ゲート3とゲート4。
- 選択して精子形成は、図1に示したように、ゲート3のグラフィックと精子は、ゲート4のグラフィックに15-16精子細胞を、手順に13-14精子細胞を繰り返します。
- パラメータとしてFSC-A対SSC-Aを使用してグラフィック上にゲート1から表示セル
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Representative Results
フローサイトメトリーで使用されるゲーティング戦略
図1は、4つの高純度の精子細胞集団をソートするフローサイトメトリーに使用されるゲート戦略を表します。簡単に言うと、正のDNA染色を有する細胞（アレクサフルオロ488-A）が第1のサイズ対granulosity（SSC-A）を示すドットプロットで精子から1精子細胞は、1〜12が選択されている手順門（ゲート2）で選択されている（FSCゲート1から-A）次に、精子の精子細胞は、1-9ステップと精子形成は10-12がDNA染色強度の変化に応じて互いに分離することができ、ステップ（ゲート5及び6）。精子から精子細胞は、13〜14のステップと15〜16は、直接DNA染色（アレクサフルオロ488-A）対ドットプロットを示すサイズ（FSC-A）で陽性に染色された細胞から選択される（ゲイツ3および4）。すべてのソートされた集団が増加するアレクサフルオロ488ドットブロット対アレクサフルオロ488-Wで再定義されています IR純度。
落射蛍光顕微鏡による精製スキームの検証
図2は、フローサイトメトリーによる精子細胞のソートされた集団のDAPI染色を表します。精子は1-9精子細胞が丸い精子細胞および精子ステップ9精子細胞の楕円形核の典型的な丸い形の核を表示する手順。精子形成は10-12精子が大きいフック状伸長核を示す手順。精子形成は13-14と15-16精子細胞は、同様の形状の核を持っていますが、それらのソートを許可されたDNAの染色強度に若干異なる手順。以前の研究9で説明したように種々のソートされた集団の分化段階および純度は、特定のバイオマーカーを用いて確認しました。ソートされた精子細胞集団の純度は、 表1に示されています。
1 ">：" =キープtogether.withinページFO」10トン
超高純度の精子細胞集団をソートする図1.詳細なゲーティング戦略。精子をソートするために使用されるゲート戦略の概略図は、1-9精子細胞を、手順10〜12精子細胞を、手順、13-14精子細胞を段階的に説明し、488 nmのと同時に14-16精子ステップレーザーを装備したセルソーター。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2落射蛍光によってソートされた精子細胞の可視化。ソート精子細胞をDAPIで染色し、顕微鏡スライド上cytospinedおよびDAPIに適したフィルターを備えたエピ蛍光顕微鏡を用いて可視化し、CCDのCAが装備されていますメラ。細胞は、反転グレースケールで示されています。バー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| セルタイプが大多数で観察されました | 純度 | 細胞のおおよその数（8時間の並べ替え） | 汚染物質 | |
| 人口1 | 1-9精子細胞を手順 | 九十九から百% | 4,000,000 | 10精子ステップ |
| 人口2 | 10-12精子細胞を手順 | 95から98までパーセント | 1,000,000 | 精母細胞 |
| Population 3 | 13-14精子細胞を手順 | 九十九から百% | 80万 | 精母細胞、精子細胞1-9ステップ |
| 人口4 | 15-16精子細胞を手順 | 98から100パーセント | 150万 | 精母細胞 |
表1：選別精子細胞集団およびそれらの汚染物質。
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Discussion
精子形成細胞は常に精上皮の複雑さだけでなく、in vitro培養の限られた成功を与えて研究する挑戦されています。長年にわたり、様々な種から生殖細胞を精製するための多くの手法が開発されました。パーコールまたはウシ血清アルブミン勾配で重力を用いて沈降精製技術は通常、無傷の胚細胞の良好な収率を提供するが、このような減数分裂四倍体細胞および精子細胞10のようないくつかの細胞型の間の適切な定義を欠いています。また、これらの技術は、面倒な試行錯誤なしに再現することがそれらを困難にする、多くの研究室に容易に利用できない場合があり、特殊なデバイス（多くの場合、自家製）が必要です。装置は、通常、細胞の生存を維持するために4℃に保たれるように、これらの方法は、時間がかかり、振動に非常に敏感でかつ不便です。成功した場合、沈降法は、しかし、数百万の精製ライブCを提供人口あたりells。しかし、達成することができる細胞濃縮の低レベルは、めったに以上の80〜90％の純度に達しないようにこれらの技術の主な欠点です。分子分析の主要な障害を表すDNA、RNAまたはタンパク質含有量によって測定した場合、特定の場合には、他の細胞型から10-20％の汚染が存在します。
細胞集団の純度を改善しようと、一部の研究者は、他の方法と重力沈降を組み合わせています。最も効果的なアプローチの一つは、後の段階を示す異なる細胞集団の数を制限するために、未成熟マウスを使用することです。一つは、精子形成の最初の波を利用して、出産後の彼らのシーケンシャルな外観に基づいて、指定された分化段階までの胚細胞を含む細胞調製物を得ることができます。しかし、この組み合わせアプローチはdefinの欠如を解決しない、まだ出発物質の限られた量を補償するために、より多くの動物を必要とし、沈降法のition。また、このようなアプローチは、実際に、そのような精子細胞のような後の細胞型に適用することはできないが、精原細胞および一次精母細胞のために主に使用されます。また、精子形成の最初の波は、成熟マウス11,12の循環上皮のそれよりもわずかに異なる特性を有する細胞を抱く可能性があること、いくつかの証拠があります。
精子形成のビタミンAの同期は、この手順は、処理された動物の精巣に存在する段の数を絞り込むような胚芽細胞精製を改善するために使用しました。しかし、この手順は、主にマウス13,14に報告いくつかの成功を収めて、ラットにおける精子形成を同期させるために使用されました。私たち自身の経験から、マウスでの同期をビタミンAには時間がかかり、まれに再現可能な結果を与えないし、精上皮の細胞の完全性についての懸念を高め、有害な副作用を生成します。
パーソナルプラグインR基は、正常マウス15-18から生殖細胞を精製するために、フローサイトメトリーを使用します。しかし、それらのどれも円形精子細胞のステップ過去精細胞集団の精製を報告しませんでした。当社のゲーティング戦略は、分子の研究に適し重要な分化段階を表す4つの高度に精製された一倍体細胞集団を精製することができます。この論文に記載された方法の主な制約は、選別された細胞の限られた収量であってもよいです。純度の高いレベルは幾分選別された細胞の数を犠牲にして得られます。しかし、ソート条件が最適であることを確認するために、我々はプロトコルにいくつかの重要なアドバイスを追加しました。これらすべての技術的なアドバイスは、番号またはソートされた精子細胞の純度のいずれかを増加させることを目指しています。例えば、非常に並べ替え中にチューブを被覆したFBSの使用は、チューブに固執する細胞の損失を減少させます。また、SYTO16の飽和濃度を使用することで、より安定したpopulatで得られたDNA染色強度のばらつきを低減するのに役立ちますイオンFACSプロットと8時間仕分け期間にわたって優れた収率およびソートされた精子細胞の純度に見られるように。また、FACSソーターセットアップのため提供される技術のアドバイスは間違い管を収集する際に、セル詰まりや交差汚染を回避することによってソートの全体の効率を高めるのに役立ちます。代替的に、ゲートがいくつかの研究のために許容されることができ、最終的に集団の純度におけるわずかな減少をもたらし、選別された細胞の数を増加させるために拡張することができます。また、SYTO16で染色し、エタノールで固定し、生殖細胞を4℃で非常に安定であり、制限されたゲーティング調整および監視に以上8時間選別することができます。最終的に、仕分けの数日間は、任意のアプリケーションのために十分な数の細胞を得るためにプールすることができます。
ここで説明するようにして得られたフローソートされた精子細胞は、種々の実験のために使用することができます。これらの細胞からのDNAは容易に商業的なゲノムDNA精製キットを用いて抽出し、証明することができますPCRのための適切な品質であるとすると、9、次世代シークエンシング（データは示していない）を解析します。タンパク質は私たちがソートされた精子細胞の高純度を確認するために、段階特異的マーカーに対するいくつかのイムノブロットを行った9を分析するためにソートされた精子細胞も使用することができます。私たちは、ソートされた精子細胞の細胞の完全性を検証し、すべての集団の核と細胞質が無傷のままであることがわかりました。しかし、我々は13-14精子細胞段階の割合とその鞭毛含まれていないステップ15-16精子細胞の小さい割合を発見した（データは示さず）。したがって、高純度の生殖細胞集団は、このアプローチを用いて選別プロテオミクスおよびゲノム分析に適しているだけでなく、他のアプリケーション。
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Acknowledgments
著者は、落射蛍光顕微鏡に関する技術的助言のための博士レオニードボルコフとEricブシャールに感謝したいです。
財政的援助
GBに（＃1 MOP-93781を付与）カナダ衛生研究所によって資金を供給
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
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