Abstract
Die Differenzierung der Maus Spermatiden eines kritischen Verfahren zur Herstellung einer funktionellen männlichen Keimzellen mit intakter Genoms auf die nächste Generation übertragen werden. Bisher wurden molekulare Studien dieser morphologischen Übergang durch das Fehlen eines Verfahrens ermöglicht eine angemessene Trennung dieser wichtigen Schritte spermatid Differenzierung für nachfolgende Analysen behindert. Frühere Versuche zur richtigen Gating dieser Zellen mittels Durchflusszytometrie kann schwierig gewesen, weil der eine eigentümliche Steigerung der DNA-Fluoreszenz in Spermatiden unterziehen Chromatin-Remodeling. Basierend auf dieser Beobachtung, bieten wir die Details eines einfachen Durchflusszytometrie Schema, wodurch reproduzierbare Reinigung von vier Populationen mit Ethanol fixiert Maus Spermatiden, die jeweils einen anderen Zustand in der Kernumbauprozess. Bevölkerung Anreicherung mit Schritt-spezifische Marker und morphologischen Kriterien bestätigt. Die gereinigten Spermatiden für Genom- und Proteom verwendet werdenic-Analysen.
Protocol
Tierpflege war in Übereinstimmung mit der Université de Sherbrooke Animal Care und Verwenden Ausschuss.
1. Rohrvorbereitung
- Am Tag vor der Zellsortierung, 1-2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) zu 5 ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden und auf 15 ml und 50 ml-Polypropylen-konischen Röhrchen.
Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass jedes Rohr in der Protokoll ist beschichtet.
Hinweis: FBS Beschichtung verhindert Keimzellen vom Kleben an Rohrwänden. - Langsam Einmischen O / N durch Inversion bei 4 ° C zur Beschichtung der Rohre gleichförmig unter Verwendung eines Rotators.
- Am nächsten Tag, entfernen FBS aus beschichteten Röhrchen durch Dekantieren.
- * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen.
- Lassen Sie eine kleine Restvolumen von FBS (etwa 100-200 & mgr; l) in der 5 ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen zum Sammeln gereinigten Zellen verwendet.
- * Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die 5-ml-Polypropylenrundrohre und die 15 und 50-ml-Röhrchen für Zellzubereitung verwendet (Protokoll Schritte 2,1-2,11) vollständig von FBS zu entleeren, um Fanning (dh ungenaue Abweichung der Seitenströme) zu verhindern. Verwenden Sie ein P200-Pipette, um die FBS zu entfernen.
2. Zellpräparation
- Opfern eine männliche Maus unter Narkose mit O 2 / Isofluran (Induktion bei 5% dann bei 2% gehalten), gefolgt von CO 2 Ersticken.
- Verbrauchsteuern und decapsulate beide Hoden und Hackfleisch mit einer kleinen Schere in 500 ul Sortierpuffer in ein 1,5-ml-Tube.
- Flush Keimzellen aus Samenleiter durch leichtes nach oben und unten Pipettieren in der 1,5-ml-Röhrchen, zuerst mit einer abgeschnittenen 100-1000 ul Spitze, und dann mit einem intakten 100-1000 ul Spitze.
- Entfernen Sie die Ablagerungen und Klumpen von einem Filtrationsschritt unter Verwendung eines 40 & mgr; m Zellsieb und sammeln Filtrat in das 50 ml konischen Röhrchen zurückiously mit FBS in Schritt 1 überzogen.
- Das Filter einmal zu waschen mit Sortierpuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 3 ml und Transfer Filtrat in 15 ml konischen Röhrchen zuvor in Schritt 1 beschichtet.
- 16 ul 50 mM EDTA pH 8 pro ml Zellsuspension (48 & mgr; l für 3 ml), um eine Endkonzentration von 0,8 mM EDTA erhalten.
- Um dies zu beheben Keimzellen, langsam 3 Volumina eiskaltem 100% Ethanol mit einem 10-ml-Pipette unter leichtem Schütteln (Vortex bei niedriger Geschwindigkeit), die eine milchige Suspension erzeugt.
Kritischer Schritt: Langsame Zugabe Ethanol ist entscheidend und wichtig, um die Integrität der Zellpräparation zu erhalten. Wir haben festgestellt, dass eine schnelle Zugabe von Ethanol verursacht Zelllyse was zu einer großen Abnahme der Sortiereffizienz. Für einen 3 ml Zellsuspension sollte 9 ml Ethanol in ca. 1 min zugefügt werden. - Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min unter gelegentlichem Mischen durch Umdrehen.
- Centrifuge Zellsuspension bei 800 xg für 5 min und entfernen Sie die klareÜberstand.
- Vorsichtig resuspendieren festen Keimzellen in 2 ml Sortierpuffer.
- In 4 ul SYTO16 DNA-Farbstoff (1 mM Lösung in DMSO) und Inkubation für mindestens 30 min (lichtgeschützt).
Hinweis: Die besten Ergebnisse werden mit Sortier SYTO16 da es eine durchlässige DNA-Farbstoff, der leicht in die stark verdichteten Kerne von Spermatiden eingebaut erhalten.
3. Cell Sorter einrichten
Hinweis: Hier ein 4-Laser (405 nm - violett, 488 nm - blau, 561 nm - gelb-grün, 633 nm - rot) 20-Parameter BDFACSAria III Zellsortierer verwendet. Der BD FACSDiva 6.1.3 Software dient zur Visualisierung und Analyse der Daten. Die Einstellungen können abhängig von der Art von Sortierer variieren.
- Sterilisieren Sie die FACS-Sorter, indem Sie 70% Ethanol als Mantelflüssigkeit während der Fluidik Shutdown-Vorgang (Menü "Cytometer" in der Software) vor der Sortierung. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic shutdown ". Folgen Sie den durch die Prozesse genannten Schritte.
- Vorzubereiten und zu filtern 1x PBS mit einem 0,22 um-Filter, um jegliche Kristalle und Verunreinigungen zu beseitigen. Füllen der Hülle mit dem oberen Tank Schweißlinie auf der Innenseite des Tanks.
- Starten Sie die Software und melden Sie sich an. Starten Sie den FACS-Sorter, um vor der Sortierung Aufwärmen der Laser für mindestens 30 min. Führen Sie zwei fluidische Startprozesse von den Fluidik spülen, die Ethanol. Wählen Sie "Cytometer" in der Werkzeugleiste der Software und wählen Sie "Fluidic startup". Befolgen Sie die von den Prozessen genannten Schritte.
Hinweis: Diese stellt Fluidik mit normaler Hüllflüssigkeit (1x PBS). - Reinigen Sie die Sortierblock und die Ablenkplatten mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie gründlich. Beschallen eine 100 & mgr; m Düse in einem Rohr aus destilliertem Wasser für 2 Minuten in einem Ultraschallbad gestellt. Wischen Sie die Düse gründlich.
- Legen Sie die 100 & mgr; m Düse in die Durchflusszelle und drehen Sie die Düse-Verriegelungshebel im Uhrzeigersinn, um die 12-hr Position. Stellen Sie den Mantel Druck auf 20 psi.
- Schalten Sie den Strom und stellen Sie die Amplitude, um Zielwerte für Frequenz (rund 30) zu erhalten, Tropfen 1 (um 150) und Gap (rund 12) und um eine stabile Tröpfchenabbruchmuster (einige Satellitentropfen) zu etablieren. Schalten Sie Dämpfung.
- Stellen Sie sicher, dass der Strom ist gerade und mittig auf dem Abfall Absauger durch Veränderung des Winkels der Art Block. Hinweis: Eine 130 & mgr; m Düse bei 10 psi wurde ebenfalls getestet und kein offensichtlicher Unterschied gefunden wurde.
- Set Laserverzögerung auf 0 für den blauen, -77,39 für den roten, 37,33 für die violetten und -39,85 für die gelb-grünen Lasern.
- Set Bereichen Skalierung auf 1,14 für die blaue, 1,0 für den roten, 0,75 für die violetten und 0,96 für die gelb-grünen Lasern.
- Verwendung eines Test Sort (im Fenster "Nebenstrom" der Software), stellen Sie sicher, dass die Nebenströme nicht schüren. Im Fenster "Nebenstrom", passen Sie die Schieberegler, Spannungs jeder Nebenstrom, so dass sie die middl getroffene von Testsammelröhrchen. Wenn die Mitte-Stream ist nicht fest, passen Sie die 2., 3., und 4. Tropfen-Einstellungen, um das Zentrum Strom zu begrenzen.
- Starten Sie das Setup-Cytometer und Tracking (CS & T) Anwendung in der Software (Menü "Cytometer").
- Verwenden Sie die Zytometer Einrichtung und Tracking-Kügelchen bei 1 Tropfen je 350 & mgr; l, um die Charakterisierung und Verfolgung der Zytometer Leistung durch Herstellerangaben zu automatisieren.
- Beenden Sie das CS & T-Anwendung. Übernehmen CS & T-Einstellung sicher, dass die Stromparameter eine stabile Tröpfchenabbruchmuster immer noch erlauben, und schalten Sie den Sweet Spot-Taste nach Herstellerangaben (in der "Abbruchfenster").
- Optimieren Sie die Tropfen-Verzögerungswert unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen (siehe Tabelle der Materialien).
- Installieren Sie die Sammelröhrchen in den Halter. Öffnen Sie die Art Blocktür. Im Fenster "Nebenstrom", schalten Sie Spannung wählen Sie dann "Test-Art "und klicken Sie auf den Aspirator Drawer-Taste, um die Lade zu öffnen und Zugang zu den Sammelröhrchen.
- Optimieren Sie die Seitenströme, so dass sie in die Mitte des Rohres zu gehen. Einstellen von Werten und Schieberegler nach Bedarf.
- Schließen Sie die Art Blocktür und stellen Sie sicher, um die Messuhr anpassen, um die hellsten Perle Ort in der Mitte zu erhalten. Unselect Abfallschublade, Test Art und Spannung. Die Sammelröhrchen zu entfernen.
- Optimieren Sie das Drop-Verzögerung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Kurz schütteln Wulst Fläschchen kräftig und verdünnter 1 Tropfen Perlen in 0,5 ml PBS.
- Verwenden von Anweisungen des Herstellers, setzen Sie das Drop-Verzögerung mit der Tröpfchenverzögerungs Experiment Vorlage in der Software verfügbar. Alternativ können Sie die Auto-Tropfen-Verzögerungsfunktion, um die Drop Verzögerung einstellen.
- Legen Sie das Rohr des fluoreszierenden Kügelchen und stellen Sie die Durchflussrate, bis die Schwellenwertrate ist ~ 3000 bis 4000 Ereignisse / Sekunde. Legen Sie die Sortiergenauigkeit zu "Initial" und letztely zur "Feinabstimmung" im Fenster "Layout Sortieren". Wählen Sie das optische Filter und Sortier Perlen. Stellen Sie die Drop-Verzögerung, bis ~ 100% werden nach links sortiert.
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass Zellen von Interesse Art in einem Seitenstrom. Die Kügelchen und das optische Filter verwendet Nähe einer 100% Tröpfchenabweichung zu erzielen.
- Legen Sie eine FSC 1.5 ND (Neutraldichte-Filter) am linken Ende des FSC Detektorblock. Stellen Sie das Fenster-Erweiterung bis 2,00 & mgr; s und der FSC Bereich Skalierung auf 1,00 (im Register "Laser" im Fenster "Cytometer").
- Vor dem Laden Probenröhrchen, legen Sie eine Probe Filterlinie von 50 um am Ende der Probenleitung, um Klumpenbildung zu vermeiden. Um dies zu tun, wählen Sie "Ändern Probe Filter" im Menü "Cytometer".
- Testen der Zusammensetzung der Probenflüssigkeit, um eine gute Trennung ohne Auffächern zwischen den Seitenstrom zu erreichen und um die Zellen ein Anhaften an die Polypropyle verhindernne Rohre.
- Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie "Test Art" mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning.
Anmerkung: Fanning wahrscheinlich aufgrund einer hohen Proteinkonzentration in der Probenpuffer.
- Laden Sie das Probenröhrchen, schalten Sie den Ablenkplatten und wählen Sie "Test Art" mit die Schublade geschlossen ist. Schauen Sie sich Seitenströme, wenn die Trennung erfolgt, ohne zu viel Fanning.
- Laden Sie das Probenröhrchen in die FACS-Instrument. Wählen einer Probe Rühren mit 300 Umdrehungen pro Minute und einer Probentemperatur von 4ºC. Wählen Sie "Acquire Data" in der "Acquisition-Dashboard".
- Wenn nötig, verdünnen die Probe, um einen geeigneten Ereignisrate auf maximal 5.000 Veranstaltungen / s (bei einer maximalen Durchflussrate von 3,0) zu erreichen. Streng an diese Grenzen, so daß die Reinheit der sortierten Zellen aufrechtzuerhalten.
- Zu analysieren und zu sortieren, die Zellen, die Optimierung der FSC Schwellenwert, um Schmutz, ohne sich mit der Bevölkerung von Interesse zu beseitigen. Im logarithmischen Maßstab, damit Einstellung der Spannung der Photomultiplierröhre (PMT) Detektor mit dem 530/30 Filtersicher, dass das Fluoreszenzsignal der Gesamtbevölkerung passt innerhalb der Skala und Gate auf dem positiven Population (Abbildung 1, Gate 1).
- Produzieren eine Forward Scatter-Bereich (FSC-A) / Side Scatter-Bereich (SSC-A) Plot des SYTO16 positive Bevölkerung und stellen Sie die FSC-A auf etwa 110 V im linearen Skala und die SSC-A auf etwa 150 V im logarithmischen Maßstab, um alle Ereignisse zu visualisieren, während ohne sehr große Zellen und Zellaggregate.
- Im Fenster "Sortieren Layout", stellen Sie den "Sortieren Präzisionsmodus" auf "4-Wege-Reinheit" (Yield Maske: 0, Reinheit Maske: 32, Phasenmaske: 0). Wählen Sie aus dem Menü "Ziel-Events" für die kontinuierliche Sortierung "Continuous".
- Hinzufügen Populationen auf dem Gebiet entsprechend den Rohren zu sortieren (im Fenster "Sort Layout"). Stelle Populationen mit höheren Frequenzen in der Mitte und die mit niedrigeren Frequenzen an den Enden. Stellen Sie die Spannungsplatten bis 2500 V. Bei Sortierung, halten Sie die Probensammlung tUBEs auf Eis.
4. Zellsortierung
- Unmittelbar vor dem Sortieren, Filterzellen unter Verwendung eines Filters 50 & mgr; m in einem zuvor beschichteten 5 ml Polypropylen-Rundrohr.
- Den Filter ausgiebig waschen mit 1-2 ml Sortierpuffer.
- Sortieren festen Keimzellen unter Verwendung eines 488 nm-Laser ausgestattetes Zellsortierer nach dem Gating-Schema in Abbildung 1 beschrieben. Collect gereinigten Fraktionen in 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen zuvor in Abschnitt 1 auf Eis überzogen.
- Sicherstellen, dass 100-200 ul FBS in den Sammelröhrchen gehalten werden, um ein Verkleben der sortierten Zellen an der Rohrwand zu vermeiden.
- Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von SYTO16 wird sättigen, um Fluoreszenzfluktuationen während des Sortierzeit zu vermeiden. SYTO16 wird sättigt, wenn es keine weitere Veränderung der Zellfärbung Intensität am Alexa Fluor 488-Parameter (DNA-Färbung) in den Sortier Grafik. Falls erforderlich, fügen 1 ulSYTO16 zur Sortierrohr, um eine Sättigung zu erreichen.
- Zeigen Sie die Gesamt Veranstaltungen auf einer grafischen Anzeige der folgenden Parameter: Anzahl der Ereignisse vs Alexa Fluor 488-A.
- Wählen Sie die positive DNA-Färbung Zellen mit Gate 1, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter
- Markieren Sie die Zellen mit Gate 2, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Display-Zellen von Gate 2 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
- Wählen Sie Zellen mit Gate 5 und Gate 6 am Gate 2 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Separat Gate 5 und Gate 6 Anzeige auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
- Wählen Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden auf dem Gate 5 Grafik und Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden auf dem Gate 6 Grafiken, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- AnzeigenZellen von Tor 1 auf einer Grafik mit FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als Parameter
- Wählen Sie Zellen mit Tor 3 und Tor 4, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Separat Tor 3 und Tor 4 Zeigen Sie auf Grafiken mit Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als Parameter.
- Wählen Spermiogenese Schritte 13-14 Spermatiden auf dem Gate 3 Grafik und Spermiogenese Schritte 15-16 Spermatiden auf dem Gate 4 grafik, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Anzeigezellen von Tor 1 auf einer Grafik mit SSC-A vs FSC-A als Parameter
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Representative Results
Gating-Strategie mit der Durchflusszytometrie verwendet
Abbildung 1 stellt die Gating-Strategie in der Durchflusszytometrie verwendet werden, um vier hochreine spermatid Populationen zu sortieren. Kurz gesagt, Zellen mit positiven DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) zunächst mit Tor 1. Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-12 ausgewählt sind (Tor 2) auf einer Punkt-Diagramm, das die granulosity (SSC-A) vs Größe ausgewählt (FSC -A) vom Tor 1. Dann Spermatiden von Spermiogenese Schritte 1-9 und Spermiogenese Schritte 10-12 können voneinander entsprechend der Änderung der DNA-Färbungsintensität getrennt werden (Tore 5 und 6). Spermatiden von Spermiogenese Schritte 13-14 und 15-16 sind direkt von positiv gefärbten Zellen auf einer Punkt-Diagramm zeigt Größe (FSC-A) gegen DNA-Färbung (Alexa Fluor 488-A) ausgewählt (Tore 3 und 4). 488-W Alle sortiert Populationen sind mit Alexa Fluor neu definiert vs Alexa Fluor 488-A Dot-Blots, um die Zunahme ir Reinheit.
Validierung des Reinigungsschemas durch Epifluoreszenzmikroskopie
Figur 2 stellt DAPI-Färbung der sortierten Populationen von Spermatiden durch Durchflusszytometrie. Die Spermiogenese Schritte 1-9 Spermatiden zeigen den typischen rund geformten Kern der runden Spermatiden und oval geformten Kern der Spermiogenese Schritt 9 Spermatiden. Die Spermiogenese Schritte 10-12 Spermatiden zeigen eine große hakenförmigen Verlängerungs Kern. Spermiogenese Schritte 13-14 und 15-16 Spermatiden haben eine ähnliche Formkern, aber unterscheiden sich geringfügig in der DNA-Färbungsintensität, die ihre Sortierung erlaubt. Die Differenzierungsschritte und Reinheit der verschiedenen sortierten Populationen wurden auch unter Verwendung von spezifischen Biomarker in einer früheren Studie 9 beschrieben ermittelt. Die Reinheit der sortierten spermatid Populationen ist in Tabelle 1 dargestellt.
Zelt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Abbildung 1. Detaillierte Gating-Strategie, um ultrareines spermatid Populationen zu sortieren. Schematische Darstellung der Gating-Strategie zur Spermiogenese sortieren Sie die Schritte 1-9 Spermatiden, die Schritte 10-12 Spermatiden, die Schritte 13-14 Spermatiden und die Schritte 14-16 Spermatiden gleichzeitig mit einem 488 nm Laser ausgestattete Zellsortierer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Visualisierung von sortierten Spermatiden durch Epifluoreszenz. Sortiert Spermatiden sind auf Objektträgern cytospined, mit DAPI gefärbt und visualisiert mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit den entsprechenden Filtern für DAPI und mit einer CCD-ca ausgestattetmera. Die Zellen werden in umgekehrten Graustufen dargestellt. Bar = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zelltyp in Groß beobachtet | Reinheit | Ungefähre Anzahl der Zellen (8 St. Sortierung) | Verunreinigungen | |
| Bevölkerung 1 | Die Schritte 1-9 Spermatiden | 99-100% | 4.000.000 | Schritt 10 Spermatiden |
| Population 2 | Die Schritte 10-12 Spermatiden | 95-98% | 1.000.000 | Spermatozyten |
| Population 3 | Die Schritte 13-14 Spermatiden | 99-100% | 800.000 | Spermatozyten, die Schritte 1-9 Spermatiden |
| Bevölkerung 4 | Die Schritte 15-16 Spermatiden | 98-100% | 1.500.000 | Spermatozyten |
Tabelle 1: Sortiert spermatid Populationen und deren Verunreinigungen.
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Discussion
Spermatogenen Zellen waren schon immer eine Herausforderung, angesichts der Komplexität der Keimepithel sowie den begrenzten Erfolg der In-vitro-Kultur zu studieren. Im Laufe der Jahre sind viele Ansätze zur Reinigung von Keimzellen aus verschiedenen Spezies entwickelt. Sedimentation Techniken unter Verwendung von Schwerkraftaufbereitung mit Percoll oder Rinderserumalbumin Gradienten bieten in der Regel eine gute Ausbeute an intakten Keimzellen, aber nicht über angemessene Definition zwischen einigen Zelltypen wie meiotischen tetraploiden Zellen und Spermatiden 10. Darüber hinaus erfordern diese Techniken spezielle Geräte (oft hausgemacht), die nicht leicht zugänglich für viele Labors, die sie schwierig, ohne umständlich Versuch und Fehler zu reproduzieren macht sein können. Auch diese Verfahren sind zeitaufwendig, sehr empfindlich gegenüber Vibrationen und unbequem, wenn die Vorrichtung in der Regel bei 4 ° C gehalten, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten. Wenn erfolgreich, Sedimentationsverfahren jedoch bieten mehrere Millionen gereinigten Live-cEllen pro Bevölkerung. Allerdings ist der niedrige Pegel des Zellanreicherung, die erreicht werden kann der Hauptnachteil dieser Techniken, wie sie selten mehr als 80-90% Reinheit reicht. In bestimmten Fällen kann eine Kontamination von 10-20% aus anderen Zelltypen vorhanden ist, wenn von DNA, RNA oder Proteingehalt, der ein wesentliches Hindernis für molekulare Analysen darstellt, gemessen.
Wenn sie versuchen, die Reinheit der Zellpopulationen zu verbessern, haben einige Forscher Schwerkraftsedimentation zu anderen Verfahren kombiniert werden. Einer der wirksamsten Ansätze zu unreifen Mäusen zu verwenden, um die Anzahl der verschiedenen Zellpopulationen, welche späteren Stufen zu begrenzen. Man kann den Vorteil der ersten Welle der Spermatogenese zu nehmen und erhalten eine Zellzubereitung, enthaltend Keimzellen bis zu einer bestimmten Differenzierungsstadium auf der Grundlage ihrer sequentiellen Erscheinungsbild nach der Geburt. Dieser kombinierte Ansatz erfordert jedoch mehr Tiere für die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial zu kompensieren und dennoch nicht den Mangel an defin lösenition der Sedimentation Methoden. Darüber hinaus kann ein solcher Ansatz praktisch nicht zur späteren Zelltypen wie Spermatiden angewendet werden, ist aber vor allem für Spermatogonien und primären Spermatozyten verwendet. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass die erste Welle der Spermatogenese können Zellen mit leicht unterschiedlichen Eigenschaften als die der Fahrrad Epithel reifen Mäusen 11,12 beherbergen.
Vitamin A Synchronisation der Spermatogenese wurde auch zur Verbesserung der Keimzellreinigung da dieses Verfahren schränkt die Zahl der in den Testikeln eines behandelten Tieres vorliegenden Phasen. Jedoch wurde dieses Verfahren hauptsächlich verwendet, um die Spermatogenese bei Ratten zu synchronisieren, mit einigem Erfolg bei Mäusen 13,14 gemeldet. Aus eigener Erfahrung, Vitamin A-Synchronisation bei Mäusen ist zeitaufwendig, gibt selten reproduzierbare Ergebnisse und produziert schädliche Nebenwirkungen erhöhen Besorgnis über die zelluläre Integrität der Keimepithel.
OtheR-Gruppen erfolgreich Flow-Zytometrie verwendet, um Keimzellen von der Maus 15-18 reinigen. Keines von ihnen berichteten Aufreinigung spermatid Populationen an den runden Spermatiden Schritten. Unsere Gating-Strategie erlaubt es, vier hochgereinigten haploiden Zellpopulationen, die wichtige Differenzierungsschritte zugänglich molekulare Studien zu reinigen. Das Haupthindernis der in diesem Dokument beschriebenen Verfahren kann die begrenzte Ausbeute von sortierten Zellen sein. Der hohe Reinheitsgrad ist etwas auf Kosten der Anzahl der sortierten Zellen erhalten. Um jedoch sicherzustellen, dass Sortierbedingungen optimal sind, haben wir einige kritische Hinweise auf das Protokoll. All diese technischen Ratschläge zielen darauf ab, entweder die Anzahl oder die Reinheit sortiert Spermatiden zu erhöhen. Beispielsweise die Verwendung von FBS während stark Sortier beschichteten Röhrchen vermindert den Verlust von Zellen, die mit den Rohren zu halten. Auch mit sättigenden Konzentration von SYTO16 hilft, die Variationen der DNA Färbeintensität was zu stabileren populat reduzierenIonen wie auf FACS Plots und eine bessere Ausbeute und Reinheit des sortierten Spermatiden über einen 8 h Sortierzeit zu sehen. Darüber hinaus sind die vorgesehenen technischen Ratschläge für die FACS-Sorter Set-up auf jeden Fall helfen, die Gesamteffizienz der Sortierung durch die Vermeidung von Zell Clogs oder Kreuzkontamination in Sammelrohre zu erhöhen. Alternativ kann Gates erweitert, um die Anzahl der sortierten Zellen zu erhöhen, was schließlich zu einer geringen Abnahme der Population Reinheit, die für einige Untersuchungen akzeptabel sein kann. Weiterhin ethanolfixierten Keimzellen mit SYTO16 gefärbt sind bei 4 ° C stabil und kann für mehr als 8 Stunden mit begrenzter Gating Anpassungen und Überwachung sortiert werden. Letztlich kann mehrere Tage Sortier gepoolt werden, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für jede Anwendung zu erhalten.
Strömungs sortiert Spermatiden wie hier beschrieben erhalten wird, kann für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden. DNA aus diesen Zellen können leicht mit handelsüblichen genomischen DNA-Reinigungs-Kits extrahiert und nachgewiesen werdenzu der richtigen Qualität für PCR-Analysen 9 und Next Generation Sequencing (Daten nicht gezeigt). Sortiert Spermatiden kann auch für Protein-Analysen 9 wo wir führten mehrere Immunoblots gegen Bühne spezifische Marker, die hohe Reinheit der nach Spermatiden bestätigen. Wir überprüfte die zelluläre Integrität der sortierten Spermatiden und festgestellt, dass der Zellkern und Zytoplasma aller Bevölkerungsgruppen intakt bleiben. Allerdings fanden wir einen Anteil von 13 bis 14 Schritte Spermatiden und einen geringeren Anteil von Schritten 15-16 Spermatiden, die ihre Geißel fehlen (Daten nicht gezeigt). Daher sortiert hochreinen Keimzellpopulationen unter Verwendung dieses Ansatzes sind für Proteomics und genomische Analysen sowie anderen Anwendungen.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Leonid Volkov und Éric Bouchard für ihre anwendungstechnische Beratung über Epifluoreszenzmikroskopie danken.
Finanzielle Unterstützung
Finanziert von der kanadischen Institutes of Health Research (Zuschuss # MOP-93781) zu GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
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