Abstract
De differentiatie van muis spermatiden is een kritisch proces voor de productie van een functionele mannelijke gameet een intact genoom aan de volgende generatie over te dragen. Tot nu toe zijn moleculaire studies van deze morfologische overgang belemmerd door het ontbreken van een methode waarmee een goede scheiding van deze belangrijke stappen spermatide differentiatie voor latere analyses. Eerdere pogingen tot goede gating van deze cellen via flowcytometrie kan moeilijk zijn omdat een bijzondere toename DNA fluorescentie in spermatiden ondergaan chromatine hermodellering. Op basis van deze waarneming, geven we gegevens van een eenvoudige flowcytometrie regeling, waardoor reproduceerbare zuivering van vier populaties van muis met ethanol vaste spermatiden, die elk een andere toestand in het vernieuwingsproces kern. Bevolking verrijking wordt bevestigd met behulp van stap-specifieke merkers en morfologische criteria. Het gezuiverde spermatiden kan worden gebruikt voor genomische en proteomic analyses.
Protocol
Animal Care in overeenstemming was met de Université de Sherbrooke dier zorg en gebruik Comite.
1. Tube Voorbereiding
- De dag voor celsortering, voeg 1-2 ml warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en met 15 ml en 50 ml polypropyleen conische buizen.
Kritische stap: Zorg ervoor dat elke buis gebruikt in het protocol is gecoat.
Opmerking: FBS coating voorkomt kiemcellen van het vasthouden aan de buis muren. - Langzaam mix O / N geroteerde bij 4 ° C te bekleden de buizen gelijkmatig met een rotator.
- De volgende dag, verwijder FBS uit gecoate buizen door decanteren.
- * Kritische stap: Zorg ervoor dat de 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen en de 15 en 50 ml buizen gebruikt voor celpreparaat (protocol stappen 2,1-2,11) volledig ontdaan van FBS te waaieren (dwz, onnauwkeurig afwijking van de kant stromen) te voorkomen. Gebruik een P200 pipet aan de FBS te verwijderen.
- Laat een klein resterend volume van FBS (ongeveer 100-200 pi) in de polypropyleen 5 ml ronde bodem buizen gebruikt voor het verzamelen van gezuiverde cellen.
- * Kritische stap: Zorg ervoor dat de 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen en de 15 en 50 ml buizen gebruikt voor celpreparaat (protocol stappen 2,1-2,11) volledig ontdaan van FBS te waaieren (dwz, onnauwkeurig afwijking van de kant stromen) te voorkomen. Gebruik een P200 pipet aan de FBS te verwijderen.
2. Celbereiding
- Offeren een mannetje muis onder verdoving met behulp van O 2 / isofluraan (inductie bij 5% dan gehandhaafd op 2%), gevolgd door CO 2 stikken.
- Accijnzen en decapsulate beide testes en gehakt met een klein schaartje in 500 ul van het sorteren van buffer in een 1,5 ml buis.
- Flush kiemcellen van testes door zachtjes op en neer pipetteren in de 1,5 ml buis, eerst met een afgeknotte 100-1000 ul tip, en daarna met een intacte 100-1000 ul tip.
- Verwijder puin en bosjes door een filtratie stap met behulp van een 40 um cel zeef en verzamel filtraat in de 50 ml conische buis previously bekleed met FBS in stap 1.
- Was het filter eenmaal met sortering buffer tot een totaal volume van 3 ml en overdracht filtraat in de 15 ml conische buis vooraf bekleed in stap 1.
- Voeg 16 ul van 50 mM EDTA pH 8 per milliliter celsuspensie (48 pi 3 ml) teneinde een uiteindelijke concentratie van 0,8 mM EDTA verkrijgen.
- Om kiemcellen lossen, voeg langzaam 3 volumes ijskoude 100% ethanol met behulp van een 10 ml pipet zacht schudden (vortex bij lage snelheid), waarbij een melkachtige suspensie te produceren.
Kritische stappen: langzaam toevoegen van ethanol essentieel en belangrijk voor de integriteit van het celpreparaat behouden. We merkten dat de snelle toevoeging van ethanol veroorzaakt cellysis resulteert in een belangrijke vermindering van sorteerefficiëntie. Voor een 3 ml celsuspensie moet 9 ml ethanol toegevoegd in ongeveer 1 minuut. - Incubeer cellen op ijs gedurende 15 minuten met af en toe mengen door inversie.
- Centrifugeer celsuspensie op 800 g gedurende 5 minuten en verwijder de duidelijkesupernatant.
- Voorzichtig resuspendeer de vaste kiemcellen in 2 ml buffer sorteren.
- Voeg 4 pi SYTO16 DNA kleurstof (1 mM oplossing in DMSO) en incubeer gedurende ten minste 30 min (beschermd tegen licht).
Opmerking: De beste resultaten worden verkregen sortering gebruikt SYTO16 omdat het een permeabele DNA kleurstof die gemakkelijk wordt opgenomen in de sterk verdichte kernen van spermatiden.
3. Cell Sorter Set Up
Opmerking: Hier, een 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - blauw, 561 nm - geel-groen, 633 nm - red) 20-parameter BDFACSAria III celsorteerder wordt gebruikt. De BD FACSDiva 6.1.3 software wordt gebruikt voor het visualiseren en analyseren van de data. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van het type sorteerder gebruikt.
- Steriliseer de FACS sorter door het uitvoeren 70% ethanol als mantelvloeistof tijdens het fluidics afsluitprocedure (menu "Cytometer" in de software) voorafgaand aan sortering. Selecteer "Cytometer" in de werkbalk van de software en kies "Fluidic shutdown ". Volg de door de processen genoemde stappen.
- Bereiden en filter 1x PBS met een 0,22 urn filter om eventuele kristallen en verontreinigingen elimineren. Vul het omhulsel tank naar de bovenste lasnaad aan de binnenzijde van de tank.
- Start de software en loggen. Start de FACS sorter opwarmen van de lasers ten minste 30 min voor het sorteren. Lopen twee fluïde startup processen voor het spoelen van de ethanol uit de fluïdica. Selecteer "Cytometer" in de werkbalk van de software en kies "Fluidic opstarten". Volg de met de werkwijzen genoemde stappen.
Opmerking: Dit herstelt fluïdica normale mantelvloeistof (1x PBS). - Reinig de sortering blok en de afbuigplaten met gedestilleerd water en droog ze goed af. Sonificeer een 100 urn spuitmond geplaatst in een buis gedestilleerd water gedurende 2 min in een bad ultrasoonapparaat. Veeg het mondstuk grondig.
- Plaats de 100 micrometer mondstuk in de stroom cel en draai de nozzle-vergrendeling met de klok mee naar de 12hr positie. Stel de huls druk tot 20 psi.
- Schakel de stroom en de amplitude aan te passen aan streefwaarden verkrijgen van de frequentie (ongeveer 30), Drop 1 (ongeveer 150) en Gap (ongeveer 12) en een stabiele druppel breakoff patroon (enkele satelliet druppels) vast. Schakel demping.
- Zorg ervoor dat de stroom is recht en raakt het midden van het afval aspirator door het veranderen van de hoek van het soort blok. Opmerking: Een 130 micrometer mondstuk bij 10 psi werd ook getest en geen duidelijke verschil werd gevonden.
- Stel laser vertraging op 0 voor de blauwe, -77,39 voor de rode, 37,33 voor de violette en -39,85 voor de geel-groene lasers.
- Set gebieden schalen om 1.14 voor de blauwe, 1.0 voor de rode, 0,75 voor de violette en 0.96 voor de geel-groene lasers.
- Met behulp van een Test sorteren (in het venster "zijstroom" van de software), ervoor zorgen dat zij stromen worden niet waaieren. In het venster "Side Stream", stel de spanning schuifregelaars van elke zijde stroom, zodat ze op de middle test collectie buis. Als het centrum stroom is niet strak, pas de 2 e, 3 e en 4 e daling instellingen naar het centrum stroom beperken.
- Start de Cytometer Setup en Tracking (CS & T) toepassing in de software (menu "Cytometer").
- Gebruik de cytometer opstelling en het bijhouden van kralen aan 1 druppel per 350 pi tot de karakterisering en het volgen van de cytometer prestaties met instructies van de fabrikant te automatiseren.
- Stoppen met de toepassing CS & T. Solliciteer CS & T instelling, zorg ervoor dat de parameters stroom nog steeds mogelijk een stabiel druppel breakoff patroon, en zet de Sweet Spot knop zoals beschreven in de instructies van de fabrikant (in de "breakoff venster").
- Optimaliseren van de Drop Delay waarde met fluorescerende kralen (zie tabel van Materialen).
- Installeer de collectie buizen in de houder. Open het soort blok deur. In het venster "Side Stream", schakel de spanning vervolgens selecteer "Test soort "en klik op de aanzuiger lade knop om de lade te openen en hebben toegang tot de collectie buizen.
- Optimaliseer de kant stromen, zodat zij in het midden van de buis. Waarden en sliders aanpassen als dat nodig is.
- Sluit het soort blok deur en zorg ervoor dat de meetklokje aan te passen aan de helderste kraal plek in het centrum te krijgen. Unselect afval lade, testen sorteren en spanning. Verwijder de verzamelbuizen.
- Optimaliseren van de drop delay volgens de instructies van de fabrikant.
- In het kort, schud krachtig kralen flesje en verdun 1 druppel kralen in 0,5 ml PBS.
- Met behulp van instructies van de fabrikant, zet de daling vertraging met de Drop Delay experiment sjabloon beschikbaar zijn in de software. U kunt ook de functie Auto Drop Vertraging de daling vertraging instellen.
- Laad de buis van fluorescerende kralen en stel het debiet tot de drempel bedraagt ~ 3000 tot 4000 events / seconde. Stel het soort precisie "Initial" en de uiteindelijkely naar "Fijnafstemming" in het venster "Sort layout". Selecteer het optische filter en sorteren kralen. Pas de Drop Vertraging tot ~ 100% zijn gesorteerd naar links.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen van belang soort in een zijstroom. De korrels en het optische filter worden gebruikt nabij een 100% druppeltje afwijking te bereiken.
- Plaats een FSC 1.5 ND (neutrale dichtheid) filter aan de linkerkant van het FSC-detector blok. Stel het venster uitbreiding tot 2,00 microseconden en de FSC Area scaling tot 1,00 (in het tabblad "Laser" in het venster "Cytometer").
- Voordat u steekproef buis, plaats een steekproef filter lijn van 50 pm aan het einde van het monster lijn om klonteren te voorkomen. Om dit te doen, selecteer "Wijzig Sample Filter" in het menu "Cytometer".
- Test de samenstelling van het fluïdummonster om een goede scheiding te bereiken zonder fanning tussen zijstroom en te voorkomen dat de cellen te plakken aan de Polypropylene buizen.
- Laad de steekproef buis, zet de afbuigplaten en selecteer "Test soort" met de lade gesloten. Kijk naar kant stromen als scheiding gebeurt zonder al te veel waaien.
Opmerking: Fanning is waarschijnlijk te wijten aan een hoge eiwitconcentratie in het monster buffer.
- Laad de steekproef buis, zet de afbuigplaten en selecteer "Test soort" met de lade gesloten. Kijk naar kant stromen als scheiding gebeurt zonder al te veel waaien.
- Laad het monster buis in de FACS instrument. Selecteer een monster roeren van 300 opm en een monstertemperatuur van 4 ° C. Selecteer "Data Acquire" in de "Acquisitie Dashboard".
- Eventueel Verdun het monster met een geschikte incidentie maximaal 5000 events / sec bereikt (met een maximale stroomsnelheid van 3,0). Strikt aan deze grenzen teneinde de zuiverheid van de gesorteerde cellen te behouden.
- Te analyseren en sorteren van de cellen, het optimaliseren van de FSC drempelwaarde om vuil te verwijderen zonder zich te bemoeien met de bevolking van belang. In logaritmische schaal, stel de spanning van de foto-multiplier tube (PMT) detector met de 530/30-filter om ervoor teervoor dat het fluorescentiesignaal van de totale bevolking past binnen de schaal en de poort van de positieve populatie (Figuur 1, poort 1).
- Maak een Forward Scatter-gebied (FSC-A) / Side Scatter-gebied (SSC-A) plot van de SYTO16 positieve populatie en pas het FSC-A tot ongeveer 110 V in lineaire schaal, en het SSC-A tot ongeveer 150 V in logaritmische schaal te visualiseren alle gebeurtenissen onder uitsluiting zeer grote cellen en celaggregaten.
- In de "Sort Layout" venster, zet de "Sort Precision Mode" tot "4-way zuiverheid '(Opbrengst masker: 0, zuiverheid Masker: 32, Phase Mask: 0). Selecteer "Continuous" in het menu "Doel Events" voor continue sorteren.
- Naar populaties sorteren in het veld die overeenkomt met de buizen (de "sorteren Layout" venster). Plaats populaties met hogere frequenties in het midden en met lagere frequenties aan de uiteinden. Stel de spanning platen tot 2.500 V. Tijdens het sorteren, houden het monster collectie tUbes op ijs.
4. Cell Sorting
- Onmiddellijk voor het sorteren, filter cellen met behulp van een 50 urn filter in een eerder beklede 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem.
- Was het filter uitgebreid met 1-2 ml van het sorteren buffer.
- Sorteer vaste kiemcellen met behulp van een 488 nm-laser uitgerust celsorteerder na de gating schema beschreven in figuur 1. Verzamel gezuiverde fracties in 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen eerder bekleed in paragraaf 1 op ijs.
- Zorg ervoor dat 100-200 gl FBS gehouden in de verzamelbuizen om kleven van de gesorteerde cellen naar de buiswand te voorkomen.
- Zorg ervoor dat de concentratie van SYTO16 is verzadigen met fluorescentie schommelingen tijdens het sorteren periode te voorkomen. SYTO16 wordt verzadigen wanneer er geen verdere variatie van cel kleuring intensiteit bij de Alexa Fluor 488 parameter (DNA-kleuring) in het sorteercentrum graphics. Indien nodig, voeg 1 plSYTO16 naar de sorteerruimte buis verzadiging te bereiken.
- Geef het totale events een grafische weergave van de volgende parameters: aantal gebeurtenissen vs Alexa Fluor 488-A.
- Selecteer de positieve DNA kleuring cellen met Gate 1, zie figuur 1.
- Weergave cellen van poort 1 op een afbeelding met behulp van SSC-A vs FSC-A als parameters
- Selecteer de cellen met poort 2, zoals getoond in figuur 1.
- Weergave cellen van Gate 2 op een grafische met FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
- Selecteer cellen met Gate 5 en Gate 6 op Gate 2 grafisch, zoals aangetoond in figuur 1.
- Weergeven afzonderlijk Gate 5 en Gate 6 op graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
- Selecteer spermiogenese stappen 1-9 spermatiden op de Poort 5 grafische en spermiogenese stappen 10-12 spermatiden op de Poort 6 graphics, zoals getoond in figuur 1.
- Beeldschermcellen van poort 1 een grafische behulp FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters
- Selecteer cellen met Gate 3 en Gate 4, zoals getoond in figuur 1.
- Weergeven afzonderlijk Gate 3 en Gate 4 op de graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
- Selecteer spermiogenese stappen 13-14 spermatiden op de Gate 3 grafische en spermiogenese stappen 15-16 spermatiden op de Poort 4 grafisch, zoals getoond in figuur 1.
- Weergave cellen van poort 1 op een afbeelding met behulp van SSC-A vs FSC-A als parameters
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategie gebruikt met flowcytometrie
Figuur 1 geeft de gating strategie gebruikt flowcytometrie vier zeer zuiver spermatide populaties sorteren. In het kort, cellen met positieve DNA kleuring (Alexa Fluor 488-A) worden eerst geselecteerd met Gate 1. Spermatiden van spermiogenese stappen 1-12 worden geselecteerd (Gate 2) op een dot plot die de granulosity (SSC-A) versus grootte (FSC -A) vanaf Gate 1. Vervolgens spermatiden van spermiogenese stappen 1-9 en spermiogenese stappen 10-12 kunnen worden gescheiden van elkaar afhankelijk van de schommelingen van DNA kleurintensiteit (Gates 5 en 6). Spermatiden van spermiogenese stappen 13-14 en 15-16 rechtstreeks gekozen uit positief gekleurde cellen op een punt grafiek die grootte (FSC-A) versus DNA kleuring (Alexa Fluor 488-A) (Gates 3 en 4). Alle naargelang populaties worden geherdefinieerd met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A punt blots aan de verhoging ir zuiverheid.
Validatie van de zuivering regeling door epifluorescentiemicroscopie
Figuur 2 geeft DAPI kleuring van de gesorteerde populaties van spermatiden door flowcytometrie. De spermiogenese stappen 1-9 spermatiden weer de typische ronde kern van de ronde spermatiden en ovale kern van de spermiogenese stap 9 spermatiden. De spermiogenese stappen 10-12 spermatiden tonen een grote haakvormige verlengende kern. Spermiogenese stappen 13-14 en 15-16 spermatiden een gelijkvormige nucleus, maar verschillen enigszins in DNA kleurintensiteit, die hun sortering toegestaan. De differentiatiestappen en de zuiverheid van de gesorteerde verschillende populaties werden vastgesteld met behulp van specifieke biomarkers, zoals beschreven in een eerdere studie 9. De zuiverheid van de gesorteerde populaties spermatide is weergegeven in tabel 1.
tent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1. Gedetailleerde gating strategie om ultrapuur spermatide populatie afstand. Schematische weergave van de gating strategie gebruikt om spermiogenese sorteren stappen 1-9 spermatiden, stappen 10-12 spermatiden, stappen 13-14 spermatiden en stappen 14-16 spermatiden gelijktijdig met een 488 nm laser uitgerust celsorteerder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Visualisatie gesorteerde spermatiden door epifluorescentie. Gesorteerde spermatiden worden cytospined op microscoopglaasjes, gekleurd met DAPI en gevisualiseerd met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met de juiste filters voor DAPI en voorzien van een CCD camera. Cellen worden weergegeven in omgekeerde grijswaarden. Bar = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Celtype waargenomen bij meerderheid | Zuiverheid | Geschatte aantal cellen (8 uur sortering) | Verontreinigingen | |
| Bevolking 1 | Stappen 1-9 spermatiden | 99-100% | 4.000.000 | Stap 10 spermatiden |
| Populatie 2 | Stappen 10-12 spermatiden | 95-98% | 1.000.000 | Spermatocyten |
| Population 3 | Stappen 13-14 spermatiden | 99-100% | 800.000 | Spermatocyten, stappen 1-9 spermatiden |
| Bevolking 4 | Stappen 15-16 spermatiden | 98-100% | 1.500.000 | Spermatocyten |
Tabel 1: Gesorteerd spermatide bevolking en hun verontreinigingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogenese cellen altijd uitdagend om te studeren gezien de complexiteit van de seminiferus epitheel, en het beperkte succes van in vitro kweek. In de loop der jaren vele benaderingen zuiveren kiemcellen van verschillende species ontwikkeld. Sedimentatie technieken met behulp van de zwaartekracht zuiveren met Percoll of runderserumalbumine hellingen bieden meestal een goede opbrengst van intacte kiemcellen, maar gebrek aan een goede definitie tussen sommige celtypen, zoals de meiose tetraploïde cellen en spermatiden 10. Bovendien zijn deze technieken vereisen speciale inrichtingen (vaak zelfgemaakte) die niet gemakkelijk beschikbaar voor vele laboratoria, waardoor ze moeilijk te reproduceren zonder omslachtige proefondervindelijk maakt mogelijk. Deze werkwijzen zijn ook tijdrovend, zeer gevoelig voor trillingen en onhandig als de inrichting gewoonlijk wordt bewaard bij 4 ° C levensvatbaarheid van de cellen te handhaven. Bij succes, sedimentatie methoden geven echter enkele miljoenen gezuiverd live-cells per bevolking. De lage cel verrijking kan worden bereikt, is het grootste nadeel van deze technieken zelden meer dan 80-90% zuiverheid bereikt. In sommige gevallen, een contaminatie van 10-20% uit andere celtypen aanwezig is gemeten door DNA, RNA of eiwitten, die een belangrijke belemmering voor moleculaire analyses vertegenwoordigt.
Bij een goede zuiverheid van celpopulaties te verbeteren, hebben sommige onderzoekers zwaartekracht sedimentatie andere methoden gecombineerd. Een van de meest effectieve manieren is om onrijpe muizen gebruiken om het aantal verschillende celpopulaties die later stadium te beperken. Men kan gebruik maken van de eerste golf van spermatogenese en een cel preparaat dat kiemcellen tot een bepaald differentiatiestadiumspecifieke basis van hun sequentiële uiterlijk na de geboorte krijgen. Echter, deze gecombineerde aanpak vereist meer dieren ter compensatie van de beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal en toch niet het gebrek aan defin lossenvulle van de sedimentatie methode. Bovendien zijn dergelijke benadering niet praktisch toegepast latere celtypen zoals spermatiden, maar wordt voornamelijk gebruikt voor spermatogonia en primaire spermatocyte. Bovendien zijn er aanwijzingen dat de eerste golf van spermatogenese cellen met iets andere eigenschappen dan die van de cyclus epitheel van volwassen muizen 11,12 kan herbergen.
Vitamine A synchronisatie van spermatogenese werd ook gebruikt om kiemcel zuivering verbeteren procedure verkleint het aantal trappen in de testes van een behandeld dier. Echter werd deze procedure voornamelijk gebruikt om spermatogenese te synchroniseren bij ratten, met enig succes gemeld bij muizen 13,14. Uit onze eigen ervaring, vitamine A synchronisatie in muizen is tijdrovend, geeft weinig reproduceerbare resultaten produceert en schadelijke bijwerkingen verhogen bezorgdheid over de cellulaire integriteit van de seminiferus epitheel.
Other groepen met succes gebruikt flowcytometrie om geslachtscellen te zuiveren van de muis 15-18. Echter, geen van hen gemelde zuivering van spermatide populaties langs de ronde spermatiden stappen. Onze gating strategie biedt vier haploïde sterk gezuiverde celpopulaties die belangrijke differentiatiestappen vatbaar moleculaire studies zuiveren. De belangrijkste beperking van de in dit document beschreven werkwijze kan de beperkte opbrengst aan cellen gesorteerd. De hoge zuiverheid verkregen enigszins ten koste van het aantal cellen gesorteerd. Echter, om ervoor te zorgen dat het sorteren omstandigheden optimaal zijn, we enkele kritische adviezen toegevoegd aan het protocol. Al deze technische adviezen bedoeld om het aantal of de zuiverheid van gesorteerd spermatiden verhogen. Bijvoorbeeld, het gebruik van FBS gecoate buizen tijdens het sorteren aanzienlijk vermindert het verlies van cellen die zich aan de buizen. Ook het gebruik verzadigende concentratie SYTO16 helpt variaties van DNA kleurintensiteit waardoor stabielere populat verminderenionen zoals te zien op FACS plots en een betere opbrengst en zuiverheid van de gesorteerde spermatiden gedurende een 8 uur periode sortering. Daarnaast is het voorzien van technische adviezen voor de FACS sorter set-up helpt zeker om de algehele efficiëntie van het sorteren door het vermijden cel klompen of kruisbesmetting in het verzamelen van buizen te verhogen. Alternatief kunnen poorten worden uitgebreid om het aantal gesorteerde cellen verhogen, uiteindelijk resulterend in een kleine afname van de populatie zuiverheid, die aanvaardbaar is voor sommige studies kan worden. Bovendien-ethanol gefixeerd kiemcellen gekleurd met SYTO16 zijn zeer stabiel bij 4 ° C en kan worden gesorteerd langer dan 8 uur met beperkte gating aanpassingen en supervisie. Uiteindelijk kan enkele dagen sortering worden samengevoegd om voldoende cellen te verkrijgen voor elke toepassing.
Flow gesorteerd spermatiden verkregen zoals hier beschreven kan worden gebruikt voor verschillende experimenten. DNA van deze cellen kunnen gemakkelijk worden geëxtraheerd door gebruik commerciële genomisch DNA zuivering kits en gedemonstreerdvan goede kwaliteit zijn voor PCR-analyses 9 en next generation sequencing (gegevens niet getoond). Gesorteerd spermatiden kan ook worden gebruikt voor protelnenanalyses 9 waarin voerden wij verschillende immunoblots tegen podium-specifieke markers om de hoge zuiverheid van de gesorteerde spermatiden bevestigen. We verifieerde de cellulaire integriteit van de gesorteerde spermatiden en vond dat de kern en cytoplasma van alle populaties intact blijft. We vonden echter een deel van de stappen 13-14 spermatiden en een kleiner deel van stappen 15-16 spermatiden die ontbreken hun flagellum (gegevens niet getoond). Vandaar hoogzuivere kiemcel populaties naargelang deze aanpak geschikt voor proteomics en genomische analyses, en andere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen dr Leonid Volkov en Éric Bouchard bedanken voor hun technisch advies over epifluorescentiemicroscopie.
Financiële steun
Gefinancierd door de Canadian Institutes of Health Research (subsidie # MOP-93781) naar GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
