Abstract
Differensiering av mus spermatider er en viktig fremgangsmåte for fremstilling av et funksjonelt hannkjønnscelle med en intakt genomet til å bli overført til neste generasjon. Så langt har molekylære studier av dette morfologiske overgangen vært hemmet av mangel på en metode som tillater tilstrekkelig separasjon av disse viktige trinnene spermatid differensiering for senere analyser. Tidligere forsøk på riktig separasjon av disse celler ved hjelp av strømningscytometri kan ha vært vanskelig på grunn av en spesiell økning av DNA fluorescens i spermatider som gjennomgår kromatin remodeling. Basert på denne observasjonen, gir vi opplysninger om en enkel flowcytometri ordningen, slik at reproduserbar rensing av fire bestander av mus spermatider fast med etanol, som hver representerer en annen stat i den kjernefysiske ombygging prosessen. Befolknings berikelse er bekreftet ved hjelp av step-spesifikke markører og morfologiske kriterier. De rensede spermatider kan benyttes for genomisk og proteomic analyser.
Protocol
Dyr omsorg var i samsvar med Université de Sherbrooke dyr omsorg og bruk komité.
1. Tube Forberedelse
- Dagen før cellesortering, tilsett 1-2 ml varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) til 5 ml polypropylen rund bunn rør, og til 15 ml og 50 ml koniske rør polypropylen.
Kritisk trinn: Sørg for at alle rør som brukes i protokollen er belagt.
Merk: FBS belegg hindrer kjønnsceller fester seg til rørveggene. - Sakte blande O / N ved inversjon ved 4 ° C for å belegge rørene jevnt ved hjelp av en rotator.
- Neste dag, fjerne FBS fra belagte rør ved dekantering.
- * Kritisk trinn: Pass på at de 5 ml polypropylen rund bunn rør og de 15 og 50 ml rør som brukes til cellepreparat (protokoll skritt 02.01 til 02.11) er helt tømt for FBS å hindre Fanning (dvs. upresis avvik av sidebekker). Bruk en P200 pipette for å fjerne FBS.
- La et lite restvolum av FBS (ca. 100-200 ul) i 5 ml polypropylen-rundbunnede rør som benyttes for innsamling av rensede celler.
- * Kritisk trinn: Pass på at de 5 ml polypropylen rund bunn rør og de 15 og 50 ml rør som brukes til cellepreparat (protokoll skritt 02.01 til 02.11) er helt tømt for FBS å hindre Fanning (dvs. upresis avvik av sidebekker). Bruk en P200 pipette for å fjerne FBS.
2. Cell Forberedelse
- Ofre en hannmus under narkose bruker O 2 / isofluran (induksjon på 5% så opprettholdes på 2%), etterfulgt av CO 2 kvelning.
- Avgiftsdirektoratet og decapsulate både testikler og kjøttdeig med liten saks i 500 mL av sortering buffer i en 1,5 ml tube.
- Skyll kjønnsceller fra sædkanaler ved forsiktig opp og ned pipettering i 1,5 ml tube, først med en avkortet 100-1.000 mL tips, og deretter med en intakt 100-1.000 ul tips.
- Fjern rusk og klumper av en filtreringstrinn ved hjelp av en 40 mikrometer celle sil og samle filtratet i 50 ml koniske rør previously belagt med FBS i trinn en.
- Vask filteret en gang med sortering buffer opp til et totalt volum på 3 ml og overføre filtrat inn i 15 ml konisk rør på forhånd er belagt i trinn en.
- Legg 16 ul av 50 mM EDTA pH 8 per milliliter av cellesuspensjonen (48 ul i 3 ml) slik at det oppnås en sluttkonsentrasjon på 0,8 mM EDTA.
- For å reparere kimceller Tilsett langsomt 3 volumdeler iskald 100% etanol under anvendelse av en 10 ml pipette med forsiktig omrøring (vortex ved lav hastighet), som vil gi en melkeaktig suspensjon.
Kritisk trinn: sakte tilsetning av etanol er avgjørende og viktig for å bevare integriteten av cellepreparat. Vi bemerket at hurtig tilsetning av etanol fører til cellelyse som resulterer i en større reduksjon av sorteringseffektiviteten. For en 3 ml cellesuspensjon, bør 9 ml etanol tilsettes i omtrent 1 min. - Inkuber cellene på is i 15 minutter med leilighetsvis blanding ved inversjon.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 800 xg i 5 minutter og fjerne den klaresupernatant.
- Forsiktig resuspender de faste kjønnsceller i 2 ml buffer sortering.
- Tilsett 4 mL av SYTO16 DNA-fargestoff (1 mM oppløsning i DMSO) og inkuberes i minst 30 min (beskyttet mot lys).
Merk: De beste sorteringsresultater oppnås ved anvendelse av SYTO16 siden det er en permeabel DNA-fargestoff som lett kan inkorporeres i meget komprimerte kjerner av spermatider.
3. Cell Sorter Konfigurer
Merk: Her, en 4-Laser (405 nm - fiolett, 488 nm - blå, 561 nm - gul-grønn, 633 nm - red) 20-parameter BDFACSAria III celle sorter er brukt. BD FACSDiva 6.1.3 programvare brukes til å visualisere og analysere dataene. Innstillingene kan variere avhengig av typen av sorter som brukes.
- Steriliser FACS sorter ved å kjøre 70% etanol som skjede væske under fluidics avslutningsprosedyren ("cytometer" menyen i programmet) før sortering. Velg "cytometeret" på verktøylinjen i programvaren og velg "Fluidic shutdown ". Følg trinnene nevnt av prosessene.
- Forbered og filter 1 x PBS med et 0,22 um filter for å eliminere eventuelle krystaller og forurensninger. Fyll kappen tanken til den øvre sveiselinjen på innsiden av tanken.
- Start programmet og logge inn. Start FACS sorter å varme opp lasere i minst 30 min før sortering. Kjør to fluidic oppstartsprosesser for å skylle ut etanolen fra fluidics. Velg "cytometeret" på verktøylinjen i programvaren og velg "Fluidic oppstart". Følg trinnene nevnt av prosessene.
Merk: Dette gjenoppretter fluidics med normal skjede væske (1x PBS). - Rengjør sortering blokk og avbøyningsplater med destillert vann og tørk dem godt. Sonikere en 100 pm dyse plassert i et rør med destillert vann i 2 minutter i et bad sonikering. Tørk av munnstykket grundig.
- Sett 100 mikrometer dyse i flyten cellen og skru dysen vippe klokken til 12hr posisjon. Sett skjede trykket til 20 psi.
- Slå på strømmen og justere amplitude å oppnå ønskede verdier for frekvens (rundt 30), Drop 1 (rundt 150) og Gap (rundt 12) og å etablere et stabilt dråpe avgrening mønster (få satellitt dråper). Slå av demping.
- Pass på at strømmen er rett og treffer midten av avløpet aspirator ved å endre vinkelen på sorterings blokken. Merk: En 130 mikrometer dyse på 10 psi ble også testet, og ingen åpenbare forskjellen ble funnet.
- Still laser forsinkelse til 0 for det blå, -77,39 for den røde, 37,33 for den fiolette og -39,85 for de gul-grønne lasere.
- Set områder skalering til 1,14 for det blå, 1.0 for den røde, 0,75 for fiolett og 0,96 for de gul-grønne lasere.
- Ved hjelp av en test Sorter (i "Side Stream" vindu av programvaren), sørg for at sidebekker er ikke Fanning. I "Side Stream" vindu, justere spennings glidere på hver side stream slik at de treffer middle av test samling rør. Dersom senteret stream er ikke tett, justere 2., 3., og 4. slipp innstillinger for å begrense sentrum stream.
- Start cytometeret Setup og Tracking (CS & T) program i programvaren ("cytometer" -menyen).
- Bruk cytometer oppsett og sporing perler på en dråpe per 350 mL å automatisere karakterisering og sporing av cytometeret ytelsen med produsentens instruksjoner.
- Avslutt CS & T søknad. Påfør CS & T innstillingen, må du kontrollere at strømmen parametere likevel tillate en stabil dråpe avgrening mønster, og slå på Sweet Spot-knappen som beskrevet i produsentens instruksjoner (i "avgrening vinduet").
- Optimalisere Drop Delay verdien med fluoriserende perler (se tabell for material).
- Installer samling rør i holderen. Åpne slags blokk døren. I "Side Stream" vinduet, slå på spenning og velg deretter "Test sort "og klikk på Aspirator skuffknappen for å åpne skuffen og har tilgang på oppsamlingsrørene.
- Optimalsidestrømmer slik at de går inn i midten av røret. Juster verdiene og glidere som trengs.
- Lukk slags blokk døra og sørg for å justere måleuret å oppnå den smarteste perle sted i sentrum. Opphev avfall skuff, test sortere og spenning. Fjern oppsamlingsrørene.
- Optimalisere dråpe forsinkelse i henhold til produsentens instruksjoner.
- I korthet rist kraftig vulst ampulle og fortynne en dråpe av kuler i 0,5 ml PBS.
- Ved hjelp av produsentens instruksjoner, satt i rulle forsinkelse bruker Drop Delay eksperiment mal tilgjengelig i programvaren. Alternativt kan du bruke Auto Drop Delay funksjonen til å sette rulle forsinkelse.
- Installering av rør av fluorescerende kuler og justere strømningshastigheten inntil terskelhastigheten er ~ 3000 til 4000 hendelser / sekund. Sett slags presisjon til "Initial" og avsluttendely til "Fine tune" i "Sort layout" vinduet. Velg optisk filter og sortere perler. Juster Drop Delay til ~ 100% er sortert til venstre.
Merk: Dette trinnet er avgjørende for å sørge for at celler av interesse liksom inn i en sidestrøm. Kulene og det optiske filter brukes for å oppnå en nær 100% dråpe avvik.
- Plasser et ND (nøytral tetthet) filter FSC 1.5 i venstre ende av FSC detektoren blokken. Sette vinduet utvidelse til 2,00 mikrosekunder og FSC-området skalering til 1,00 (i "Laser" kategorien i "cytometeret" vinduet).
- Før lasting prøverør, plassere en prøve filter linje på 50 mikron ved slutten av prøveledningen for å unngå klumpdannelse. For å gjøre dette, velger du "Endre Sample Filter" i "cytometeret" -menyen.
- Test sammensetningen av prøvefluid for å oppnå god separasjon uten å lufte mellom sidestrømmen og for å hindre at cellene fester seg til Polypropylene rør.
- Laste prøverøret, slå på avbøyningsplater og velg "Test sort" med skuffen lukket. Se på sidebekker om separasjon skjer uten for mye vifting.
Merk: Fanning er sannsynlig på grunn av en høy proteinkonsentrasjon i prøvebufferen.
- Laste prøverøret, slå på avbøyningsplater og velg "Test sort" med skuffen lukket. Se på sidebekker om separasjon skjer uten for mye vifting.
- Installering av prøverøret inn i FACS instrumentet. Velge en prøve omrøring på 300 opm og en prøvetemperatur på 4 ° C. Velg "Hent data" i "Acquisition Dashboard".
- Hvis det er nødvendig, fortynne prøven for å oppnå en passende hendelse hastigheten til et maksimum på 5000 hendelser / sek (ved en maksimal strømningshastighet på 3,0). Strengt respekterer disse grensene for derved å opprettholde renheten av de sorterte cellene.
- Å analysere og sortere cellene, optimalisere FSC terskelverdien for å fjerne rusk uten å forstyrre befolkningen av interesse. I logaritmisk skala, justere spenningen av fotomultiplikatorrør (PMT) detektor med 530/30 filter for å gjøreat fluorescens-signalet av den totale populasjonen passer inn i skalaen, og porten på den positive populasjon (figur 1, Gate 1).
- Lag en Forward Scatter-området (FSC-A) / Side Scatter-området (SSC-A) plott av SYTO16 positive befolkningen og justere FSC-A til rundt 110 V i lineær skala, og SSC-A til rundt 150 V i logaritmisk skala for å visualisere alle hendelsene mens unntatt svært store celler og celle aggregater.
- I "Sort Layout" vindu, sett "Sort Precision Mode" til "4-veis renhet" (Yield maske: 0, Purity Mask: 32, Phase Mask: 0). Velg "Kontinuerlig" fra "Target Events" menyen for kontinuerlig sortering.
- Legg populasjoner for å sortere i feltet tilsvarer rørene (i "Sort Layout" vindu). Plasser populasjoner med høyere frekvenser i midten og de med lavere frekvenser i endene. Still spennings platene til 2500 V. Under sortering, holde prøvetaking tUBE'er på is.
4. Cell Sorting
- Umiddelbart før sortering, filtrer celler ved hjelp av et 50 um filter i en på forhånd er belagt 5 ml polypropylen rundbunnet rør.
- Vask filter utstrakt med 1-2 ml sortering buffer.
- Sorter faste kjønnsceller ved hjelp av en 488 nm laser-utstyrt celle sorter etter gating ordningen beskrevet i figur 1. Samle rensede fraksjoner i 5 ml polypropylen runde bunn rør tidligere malte i § 1 på is.
- Pass på at 100-200 ul FBS er holdt i samlingen rør for å unngå stikker av de sorterte celler til rørveggen.
- Sørg for at konsentrasjonen av SYTO16 er mette å unngå svingninger fluorescens under sortering perioden. SYTO16 blir metning når det ikke er noen ytterligere variasjon av cellefargeintensitet ved Alexa Fluor 488 parameter (DNA-farging) i sorterings grafikk. Om nødvendig, tilsett 1 mL avSYTO16 til sortering røret for å nå metning.
- Vise total hendelser på en grafisk visning av følgende parametere: antall hendelser vs Alexa Fluor 488-A.
- Velg de positive DNA-farging celler med porten 1, som vist i figur 1.
- Skjerm celler fra gate 1 på en grafisk ved hjelp av SSC-A vs FSC-A som parametere
- Velg cellene med Gate 2, som viste i figur 1.
- Skjerm celler fra Gate 2 på en grafisk ved hjelp av FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Velg celler med Gate 5 og Gate 6 på Gate 2 grafikken, som viste i figur 1.
- Vise seg Gate 5 og Gate 6 på grafikk ved hjelp Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Velg spermiogenesen trinn 1-9 spermatider på Gate 5 grafisk og spermiogenesen trinn 10-12 spermatider på gate 6 grafikk, som viste i figur 1.
- Utstillingceller fra gate 1 på en grafisk ved hjelp av FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametere
- Velg celler med Gate 3 og Gate 4, som viste i figur 1.
- Vise seg Gate 3 og Gate 4 på grafikk ved hjelp Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Velg spermiogenesen trinn 13-14 spermatider på Gate 3 grafisk og spermiogenesen trinn 15-16 spermatider på Gate 4 grafikken, som viste i figur 1.
- Skjerm celler fra gate 1 på en grafisk ved hjelp av SSC-A vs FSC-A som parametere
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating strategien brukes med flowcytometri
Figur 1 representerer gating strategi som brukes i flowcytometri for å sortere fire høyrene spermatid populasjoner. Kort, celler med positiv DNA farging (Alexa Fluor 488-A) er valgt først med Gate 1. spermatider fra spermiogenesen skritt 1-12 er valgt (Gate 2) på et prikkplott som viser granulosity (SSC-A) vs størrelse (FSC -A) fra Gate 1. Deretter, trinn spermatider fra spermiogenesen 1-9 og spermiogenesen trinn 10-12 kan separeres fra hverandre i henhold til variasjonen av DNA fargeintensitet (Porter 5 og 6). Spermatider fra spermiogenesen trinn 13-14 og 15-16 er direkte valgt fra positivt fargede celler på et dot plot som viser størrelsen (FSC-A) vs DNA-farging (Alexa Fluor 488-A) (porter 3 og 4). Alle sortert populasjoner er omdefinert med Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A dot blotter å øke ir renhet.
Validering av rensing ordningen ved epifluorescence mikros
Figur 2 representerer DAPI farging av de sorterte populasjonene av spermatider ved flowcytometri. Den spermiogenesen trinn 1-9 spermatider vise den typiske runde formet kjernen av de runde spermatider og oval formet kjernen av spermiogenesen trinn 9 spermatider. Den spermiogenesen trinn 10-12 spermatider viser en stor krok-formet elongating kjernen. Spermiogenesen trinn 13-14 og 15-16 spermatider har en lignende formet kjerne, men litt annerledes i DNA fargeintensitet, som tillot deres sortering. Differensieringen trinn og renhet av de ulike sorterte populasjoner ble også konstatert bruke spesifikke biomarkører som beskrevet i en tidligere studie 9. Renheten av de sorterte populasjonene spermatid er vist i tabell 1.
telt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. Detaljert gating strategi for å sortere ultra spermatid populasjoner. Skjematisk fremstilling av gating strategien brukes til å sortere spermiogenesen trinn 1-9 spermatider, trinn 10-12 spermatider trinn 13-14 spermatider og trinn 14-16 spermatider samtidig med en 488 nm laser-utstyrt celle sorter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Visualisering av sorterte spermatider etter epifluorescence. Sortert spermatider er cytospined på objektglass, farget med DAPI og visualiseres ved hjelp av en epifluorescence mikroskop med riktige filtre for DAPI og utstyrt med en CCD camera. Celler er vist i invertert gråtoner. Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Celletype observert i flertall | Purity | Omtrentlig antall celler (8 timers sortering) | Forurensninger | |
| Befolkning 1 | Trinn 1-9 spermatider | 99-100% | 4000000 | Trinn 10 spermatider |
| Befolknings 2 | Trinn 10-12 spermatider | 95-98% | 1000000 | Spermatocytter |
| Population 3 | Trinn 13-14 spermatider | 99-100% | 800.000 | Spermatocytter trinn 1-9 spermatider |
| Befolkning 4 | Trinn 15-16 spermatider | 98-100% | 1500000 | Spermatocytter |
Tabell 1: Sortert spermatid populasjoner og deres forurensninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogenese celler har alltid vært vanskelig å studere gitt kompleksiteten seminiferøst epitel, så vel som den begrensede suksess for in vitro kultur. Gjennom årene, mange tilnærminger rense kjønnsceller fra ulike arter ble utviklet. Sedimenteringsteknikker ved bruk av tyngdekraft rensing med Percoll® eller kvegserumalbumin gradienter som regel gi et godt utbytte av intakte germinale celler, men mangler skikkelig definisjon mellom enkelte celletyper som meiotisk tetraploide celler og spermatider 10. Videre disse teknikkene krever spesielle enheter (ofte hjemmelaget) som kanskje ikke er lett tilgjengelig for mange laboratorier, som gjør dem vanskelige å reprodusere uten tungvint prøving og feiling. Disse metodene er også tidkrevende, svært følsomme for vibrasjoner og upraktisk når anordningen blir vanligvis oppbevart ved 4 ° C for å opprettholde cellenes levedyktighet. Når vellykket, sedimenteringsmetoder imidlertid gi flere millioner renset levende calen pr befolkningen. Imidlertid er det lave nivået av celle berikelse man kan oppnå den største ulempen med disse teknikkene som det sjelden når mer enn 80-90% renhet. I visse tilfeller er en forurensning av 10-20% i forhold til andre celletyper tilstede når målt ved hjelp av DNA, RNA eller proteininnhold, hvilket representerer et stort hinder for molekylære analyser.
Når søker å forbedre renheten av cellepopulasjoner, har noen forskere kombinert tyngdekraft sedimentering til andre metoder. En av de mest effektive metoder er å bruke umodne mus for å begrense antall forskjellige cellepopulasjoner som representerer senere stadier. Man kan dra fordel av den første bølgen av spermatogenesen og oppnå et cellepreparat inneholdende germinalceller opp til en gitt differensiering scenen basert på sekvensiell utseende etter fødselen. Dette krever imidlertid kombinert tilnærming flere dyr for å kompensere for den begrensede mengden av utgangsmaterialet og likevel ikke klarer å løse mangelen på definition av sedimenteringsmetoder. I tillegg, en slik tilnærming kan ikke praktiseres for senere celletyper som spermatider, men brukes hovedsakelig for spermatogoniene og primær spermatocyte. Videre er det noen bevis for at den første bølgen av spermatogenesen kan havnen celler med litt forskjellige egenskaper enn at av sykkel epitel av modne mus 11,12.
Vitamin A synkronisering av spermatogenesen ble også brukt til å forbedre germinalcellerense som denne fremgangsmåten begrenser det antall trinn som er tilstede i prøvene av et behandlet dyr. Men denne prosedyren ble i hovedsak brukt til å synkronisere spermatogenesis hos rotter, med en viss suksess rapportert hos mus 13,14. Fra vår egen erfaring, vitamin A synkronisering i mus er tidkrevende, gir sjelden reproduserbare resultater og produserer skadelige bivirkninger heve bekymring for cellulær integritet seminiferous epitel.
Other grupper med hell brukes flowcytometri for å rense kjønnsceller fra mus 15-18. Men ingen av dem rapporterte rensing av spermatid populasjoner siste runde spermatider trinn. Vår gating strategien gjør det mulig å rense fire høyrensede haploide cellepopulasjoner som representerer viktige differensierings skritt mottagelig til molekylære studier. Den viktigste begrensning for fremgangsmåten beskrevet i dette dokumentet kan være begrenset utbyttet av sorterte cellene. Den høye renhetsnivå er noe oppnås på bekostning av antallet sorterte cellene. Men for å være sikker på at sorterings forholdene er optimale, vi har lagt noen kritiske merknader til protokollen. Alle disse tekniske råd som mål å øke enten antall eller renheten av sortert spermatider. For eksempel, bruken av FBS belagte rør under sortering i stor grad reduserer tapet av celler som kleber til rørene. Dessuten hjelper ved hjelp mette konsentrasjon av SYTO16 redusere variasjonene av DNA fargeintensitet resulterer i mer stabil populationer som sett på FACS plott og et bedre utbytte og renhet av sorterte spermatider over en 8 timers sortering perioden. I tillegg har de angitte tekniske råd for FACS sorter satt opp definitivt bidra til å øke den totale effektiviteten av sortering ved å unngå celle tresko eller kryssforurensning i å samle rør. Alternativt kan porter utvides for å øke antall sorterte cellene, til slutt resulterer i en liten reduksjon i populasjonen renhet, som kan være akseptable for noen studier. Videre etanol-fikserte bakterieceller farget med SYTO16 er meget stabile ved 4 ° C, og kan sorteres i mer enn 8 timer med begrensede lede justeringer og tilsyn. I siste instans kan flere dager med sortering bli slått sammen for å oppnå et tilstrekkelig antall celler for alle bruksområder.
Strømnings sortert spermatider oppnådd som beskrevet her kan brukes til en lang rekke eksperimenter. DNA fra disse cellene kan enkelt hentes ut ved hjelp av kommersielle genomisk DNA rensing kits og demonstrertå være av riktig kvalitet for PCR-analyser 9 og neste generasjons sekvensering (data ikke vist). Dårlig spermatider kan også anvendes for proteinanalyser 9 hvor vi utført flere immunoblot mot stadium-spesifikke markører for å bekrefte den høye renhet av de sorterte spermatider. Vi bekreftet den cellulære integriteten av de sorterte spermatider og fant at kjernen og cytoplasmaet i alle populasjoner forblir intakt. Men vi fant en del av trinnene 13-14 spermatider og en mindre andel av trinnene 15-16 spermatider som mangler sin flagellen (data ikke vist). Derfor høyrene bakterie-cellepopulasjoner, sortert ved hjelp av denne metode er egnet for proteomic og genomiske analyser, så vel som andre anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Leonid Volkov og Éric Bouchard for deres tekniske råd om epifluorescence mikroskopi.
Økonomisk støtte
Finansiert av den kanadiske Institutes of Health Research (tilskuddet # MOP-93781) for å GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
