Abstract
Differentieringen af mus spermatider er én kritisk proces til fremstilling af en funktionel mandlig gamet med en intakt genom, der skal sendes til den næste generation. Hidtil har molekylære studier af denne morfologiske overgang blevet vanskeliggjort af manglen på en metode muliggør passende adskillelse af disse vigtige trin i sædcelleantal differentiering for efterfølgende analyser. Tidligere forsøg på korrekt gating af disse celler ved anvendelse af flowcytometri kan have været vanskelig på grund af en ejendommelig stigning i DNA fluorescens i spermatider gennemgår kromatin remodeling. Baseret på denne observation, giver vi oplysninger om en simpel flowcytometri ordningen, så reproducerbar oprensning af fire populationer af mus spermatider faste med ethanol, der hver repræsenterer en anden stat i den nukleare remodeling proces. Befolkning berigelse bekræftes ved hjælp af step-specifikke markører og morfologiske criterions. De oprensede spermatider kan anvendes til genomisk og proteomic analyser.
Protocol
Animal Care var i overensstemmelse med Université de Sherbrooke Dyrepleje og brug udvalg.
1. Rør Forberedelse
- Dagen før cellesortering, tilsættes 1-2 ml varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS) til 5 ml polypropylen rundbundede rør, og til 15 ml og 50 ml koniske polypropylencentrifugeglas.
Afgørende skridt: Sørg for, at hver rør, der anvendes i protokollen er overtrukket.
Bemærk: FBS belægning forhindrer kimceller klistrer til rør vægge. - Bland langsomt O / N ved inversion ved 4 ° C til coate rør ensartet ved hjælp af en rotator.
- Den næste dag, fjern FBS fra coatede rør ved dekantering.
- * Kritisk trin: Sørg for, at de 5 ml polypropylen runde bund rør og de 15 og 50 ml rør, der anvendes til fremstilling celle (protokol trin 2,1-2,11) er fuldstændig tømt for FBS at forhindre Fanning (dvs. upræcise afvigelse af side streams). Brug en P200 pipette til fjernelse af FBS.
- Efterlade et lille restvolumen af FBS (ca. 100-200 ml) i 5 ml polypropylen rundbundede rør, der anvendes til opsamling af oprensede celler.
- * Kritisk trin: Sørg for, at de 5 ml polypropylen runde bund rør og de 15 og 50 ml rør, der anvendes til fremstilling celle (protokol trin 2,1-2,11) er fuldstændig tømt for FBS at forhindre Fanning (dvs. upræcise afvigelse af side streams). Brug en P200 pipette til fjernelse af FBS.
2. Cell Fremstilling
- Ofre en hanmus under anæstesi ved anvendelse af O 2 / isofluran (induktion ved 5%, så holdt ved 2%) efterfulgt af CO 2 kvælning.
- Punktafgifter og decapsulate både testikler og hakkekød med en lille saks i 500 pi sortering buffer ind i et 1,5 ml rør.
- Skyl kønsceller fra sædkanalerne ved forsigtig op og ned pipettering i 1,5 ml rør, først med en afkortet 100-1.000 pi spids, og derefter med en intakt 100-1.000 pi spids.
- Fjerne snavs og klumper af et filtreringstrin under anvendelse af en 40 um cellefilter og indsamle filtratet i 50 ml koniske rør previously belagt med FBS i trin 1.
- Vask filteret gang med sortering buffer op til et samlet volumen på 3 ml og overførsel filtrat i 15 ml konisk rør tidligere belagt i trin 1.
- Tilføj 16 pi 50 mM EDTA, pH 8 per milliliter cellesuspension (48 pi for 3 ml), således at der opnås en slutkoncentration på 0,8 mM EDTA.
- At fastsætte kimceller, tilsættes langsomt 3 volumener iskold 100% ethanol under anvendelse af en 10 ml pipette under forsigtig omrøring (vortex ved lav hastighed), som vil frembringe en mælkeagtig suspension.
Afgørende skridt: Langsomt tilsætning af ethanol er afgørende og vigtigt at bevare integriteten af præparatet celle. Vi bemærkede, at hurtig tilsætning af ethanol forårsager cellelyse resulterer i en større nedgang i sorteringseffektivitet. For et 3 ml cellesuspension, bør 9 ml ethanol tilsættes i ca. 1 min. - Cellerne inkuberes på is i 15 minutter med lejlighedsvis blanding ved inversion.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 800 xg i 5 minutter og fjern den klaresupernatant.
- Forsigtigt resuspender de faste kønsceller i 2 ml sortering buffer.
- Tilføj 4 pi SYTO16 DNA farvestof (1 mM opløsning i DMSO) og inkuberes i mindst 30 min (beskyttet mod lys).
Bemærk: Best sortering resultater opnås ved anvendelse SYTO16 da det er en permeabel DNA farvestof, der let inkorporeres i de stærkt komprimerede kerner af spermatider.
3. Cell Sorter Set Up
Bemærk: Her, en 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - blå, 561 nm - gul-grøn, 633 nm - rød) 20-parameter BDFACSAria III cellesorteringsapparat bruges. BD FACSDiva 6.1.3 software anvendes til at visualisere og analysere dataene. Indstillingerne kan variere afhængigt af typen af sortereren anvendes.
- Sterilisere FACS sorteringsanlæg ved at køre 70% ethanol som sheathvæske under fluidik shutdown procedure ("Cytometer" menuen i softwaren) forud for sortering. Vælg "Cytometer" i værktøjslinjen af softwaren og vælg "Fluidic shutdown ". Følg trinene nævnt af processerne.
- Forberede og foretage 1x PBS med et 0,22 um filter for at fjerne eventuelle krystaller og forurenende stoffer. Fyld kappe tanken til den øvre svejsesøm på indersiden af tanken.
- Start softwaren og log ind. Start FACS sorteringsanlæg at varme op lasere i mindst 30 minutter før sortering. Kør to fluide start processer til at skylle ud af ethanol fra fluidik. Vælg "Cytometer" i værktøjslinjen af softwaren og vælg "Fluidic opstart". Følg trinene nævnt af processerne.
Bemærk: Dette gendanner fluidics med normal sheathvæske (1x PBS). - Rengør sortering klodsen og afbøjningsplader med destilleret vand og tør dem grundigt. Sonikeres en 100 um dyse anbragt i et rør med destilleret vand i 2 minutter i en lydbehandlingsbad. Tør dysen grundigt.
- Sæt 100 um dyse ind i strømmen celle og drej dysen-låsehåndtag uret til 12HR position. Sæt kappen tryk til 20 psi.
- Tænd for strømmen og justere amplituden for at opnå målværdier for frekvens (ca. 30), Drop 1 (ca. 150) og Gap (ca. 12), og at etablere en stabil dråbe breakoff mønster (få satellit dråber). Sluk dæmpning.
- Sørg for at strømmen er lige og rammer midten af afløbet aspirator ved at ændre vinklen af den slags blok. Bemærk: En 130 um dyse ved 10 psi blev også testet, og ingen tydelig forskel blev fundet.
- Indstil laser forsinkelse til 0 for det blå, -77,39 for rød, 37.33 til violet og -39,85 for gul-grønne lasere.
- Set områder skalering til 1,14 for det blå, 1,0 for de røde, 0,75 for den violette og 0,96 for de gul-grønne lasere.
- Ved hjælp af en test Sortér (i "Side Stream" vindue af softwaren), sørg for den side streams ikke lufte. I "Side Stream" vinduet, justere spænding skydere i hver side stream, så de ramte Middle test opsamlingsrøret. Hvis centret stream er ikke stram, justere 2., 3., og 4. th drop-indstillinger til at begrænse center stream.
- Start cytometeret opsætning og Sporing (CS & T) ansøgning i softwaren ("Cytometer" menuen).
- Brug cytometeret setup og sporing perler 1 dråbe pr 350 pi at automatisere karakterisering og sporing af cytometret ydelse med producentens anvisninger.
- Afslut CS & T ansøgning. Anvend CS & T indstilling, skal du sørge for stream parametre tillader stadig en stabil dråbe breakoff mønster, og tænd knappen Sweet Spot, som beskrevet i producentens anvisninger (i "Breakoff vindue").
- Optimer Drop Delay værdi ved hjælp fluorescerende kugler (se tabel of Materials).
- Installer rørene indsamling i holderen. Åbn slags blok døren. I "Side Stream" vinduet, tænd spænding derefter vælge "Test sortere ", og klik på knappen Aspirator Skuffe at åbne skuffen og har adgang til rørene indsamling.
- Optimere sidestrømme så de går ind i midten af røret. Juster værdier og skydere efter behov.
- Luk den slags blok døren og sørg for at justere mikrometer drejeknappen for at opnå den lyseste perle plet i midten. Fravælg affald skuffe, test sortere og spænding. Fjern rørene indsamling.
- Optimer drop forsinkelse i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Kort fortalt ryst perle hætteglasset kraftigt og fortyndes 1 dråbe perler i 0,5 ml PBS.
- Brug producentens anvisninger, skal du indstille drop forsinkelsen ved hjælp af Drop Delay eksperimentet skabelon tilgængelige i softwaren. Alternativt kan du bruge Auto Drop Delay funktion til at indstille drop forsinkelse.
- Læg røret af fluorescerende perler og justere flowet, indtil tærsklen sats er ~ 3.000 til 4.000 hændelser / sekund. Indstil den slags præcision til "Initial", og endeligly til "Fin tune" i "Sort layout" vinduet. Vælg det optiske filter og sortere perler. Juster Drop Forsinkelse indtil ~ 100% sorteres til venstre.
Bemærk: Dette trin er afgørende at sikre, at celler af interesse slags i en side stream. Perlerne og det optiske filter bruges til at opnå tæt på 100% dråbe afvigelse.
- Placer en FSC 1.5 ND (neutral tæthed) filter ved den venstre ende af FSC detektorblokken. Indstil vinduet udvidelse til 2,00 mikrosekunder og FSC-området skalering til 1,00 (i fanebladet "Laser" i "Cytometer" vindue).
- Før prøveglas lastning, placere en prøve filter linje af 50 pm i slutningen af prøven linje for at undgå sammenklumpning. For at gøre dette, skal du vælge "Skift Sample Filter" i "Cytometeret" menuen.
- Test sammensætningen af væskeprøven for at opnå god adskillelse uden lufte mellem sidestrøm og for at forhindre cellerne i at klæbe til polypropylene rør.
- Indlæse prøveglasset, tænde afbøjningsplader og vælg "Test slags" med skuffen lukket. Kig på side streams, hvis adskillelsen sker uden for meget Fanning.
Bemærk: Fanning skyldes sandsynligvis en høj proteinkoncentration i prøven buffer.
- Indlæse prøveglasset, tænde afbøjningsplader og vælg "Test slags" med skuffen lukket. Kig på side streams, hvis adskillelsen sker uden for meget Fanning.
- Læg prøverøret i FACS instrumentet. Vælg en prøve omrøring af 300 rpm og en prøve temperatur på 4 ° C. Vælg "Acquire data" i "Acquisition Dashboard".
- Hvis det er nødvendigt, fortyndes prøven for at opnå en passende begivenhed sats til et maksimum på 5.000 hændelser / sek (med en maksimal flowhastighed på 3,0). Nøje at respektere disse grænser for således at opretholde renheden af de sorterede celler.
- At analysere og sortere celler, optimere FSC tærskelværdien at fjerne snavs uden at forstyrre med befolkningen i interesse. I logaritmisk skala, justere spændingen i fotomultiplikatoren rør (PMT) detektor med 530/30 filter for at gøresikker på, at fluorescenssignal af den samlede befolkning passer ind i skalaen, og gate på den positive population (Figur 1, Gate 1).
- Fremstil en Forward Scatter-området (FSC-A) / Side Scatter-området (SSC-A) plot af SYTO16 positive population og juster FSC-A til omkring 110 V i lineær skala, og SSC-A til omkring 150 V i logaritmisk skala til at visualisere alle de begivenheder, mens udelukke meget store celler og celleaggregater.
- I "Sort layout" vinduet, skal du indstille "Sort Precision Mode" til "4-vejs renhed" (Udbytte maske: 0, Renhed Mask: 32, Fase Mask: 0). Vælg "Kontinuerlig" fra "Target Events" menuen for kontinuerlig sortering.
- Tilføj populationer for at sortere i marken svarende til rørene (i "Sortering Layout" vindue). Placer populationer med højere frekvenser i midten og dem med lavere frekvenser i enderne. Indstil spændingen plader til 2.500 V. Under sortering, holde prøvetagningen tUBE'er på is.
4. Cell Sortering
- Umiddelbart før sortering, filtrer celler under anvendelse af en 50 um filter i en tidligere belagt 5 ml polypropylen rundbundet rør.
- Vask filteret grundigt med 1-2 ml sortering buffer.
- Sorter faste kimceller under anvendelse af en 488 nm laser-udstyret cellesorterer efter gating ordning vist detaljeret i figur 1. Saml oprensede fraktioner i 5 ml polypropylen rundbundede rør tidligere belagt i afsnit 1 på is.
- Sørge for, at 100-200 ml FBS holdes i opsamlingsrør for at undgå klæbning af de sorterede celler til rørvæggen.
- Sørg for, at koncentrationen af SYTO16 er mætte at undgå fluorescens udsving i den sortering periode. SYTO16 er mætte når der ikke er yderligere variation af cellefarvning intensitet på Alexa Fluor 488 parameter (DNA farvning) i sortering grafik. Om nødvendigt tilsættes 1 ml afSYTO16 til sortering røret for at nå mætning.
- Vise de samlede begivenheder på en grafisk visning af følgende parametre: antal hændelser vs Alexa Fluor 488-A.
- Vælg de positive DNA farvning af celler med Gate 1, som vist i figur 1.
- Display celler fra gate 1 på en grafisk ved hjælp af SSC-A vs FSC-A som parametre
- Vælg cellerne med Gate 2, som vist i figur 1.
- Display celler fra Gate 2 på en grafisk hjælp FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Vælg celler med Gate 5 og gate 6 på Gate 2 grafik, som vist i figur 1.
- Display separat Gate 5 og Gate 6 om grafik ved hjælp Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Vælg sædcelledannelse trin 1-9 spermatider på porten 5 grafiske og sædcelledannelse trin 10-12 spermatider på porten 6 grafik, som vist i figur 1.
- Viseceller fra gate 1 på en grafisk ved hjælp af FSC-A vs Alexa Fluor 488-A som parametre
- Vælg celler med Gate 3 og Gate 4, som vist i figur 1.
- Display separat Gate 3 og Gate 4 om grafik ved hjælp Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A som parametre.
- Vælg sædcelledannelse trin 13-14 spermatider på Gate 3 grafiske og sædcelledannelse trin 15-16 spermatider på Gate 4 grafisk, som vist i figur 1.
- Display celler fra gate 1 på en grafisk ved hjælp af SSC-A vs FSC-A som parametre
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating anvendte strategi med flowcytometri
Figur 1 repræsenterer gating der er anvendt ved flowcytometri at sortere fire meget rene sædcelleantal populationer. Kort fortalt, celler med positiv DNA-farvning (Alexa Fluor 488-A) udvælges først med Gate 1. spermatider fra sædcelledannelse skridt 1-12 er valgt (Gate 2) på en dot-plot, der viser granulosity (SSC-A) vs størrelse (FSC -A) fra Gate 1. Derefter spermatider fra sædcelledannelse trin 1-9 og sædcelledannelse trin 10-12 kan adskilles fra hinanden i henhold til variationen af DNA farvning intensitet (Gates 5 og 6). Spermatider fra sædcelledannelse trin 13-14 og 15-16 er direkte valgt blandt positivt farvede celler på en dot-plot, der viser størrelsen (FSC-A) vs DNA-farvning (Alexa Fluor 488-A) (Gates 3 og 4). Alle sorteret befolkninger omdefineres med Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A dot blots for at øge ir renhed.
Validering af oprensningen ordningen ved epifluorescensmikroskopi
Figur 2 repræsenterer DAPI farvning af de sorterede populationer af spermatider ved flowcytometri. Den sædcelledannelse trin 1-9 spermatider vise typiske rund kerne af de runde spermatider og ovale kerne af sædcelledannelse trin 9 spermatider. Den sædcelledannelse trin 10-12 spermatider viser en stor krogformet forlængende kernen. Sædcelledannelse trin 13-14 og 15-16 spermatider har en lignende formet kerne, men en smule forskellig i DNA farvning intensitet, som tillod deres sortering. Differentieringen trin og renheden af de forskellige sorterede populationer blev også konstateret ved hjælp af specifikke biomarkører, som beskrevet i en tidligere undersøgelse 9. Renheden af de sorterede sædcelleantal populationer er vist i tabel 1.
telt "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1. Detaljeret gating strategi at sortere ultrarent sædcelleantal populationer. Skematisk afbildning af gating anvendte strategi til at sortere sædcelledannelse trin 1-9 spermatider, trin 10-12 spermatider, trin 13-14 spermatider og trin 14-16 spermatider samtidigt med en 488 nm laser-udstyret cellesorteringsapparat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Visualisering af sorterede spermatider ved epifluorescens. Sorteret spermatider er cytospined på mikroskopobjektglas, farvet med DAPI og visualiseres ved hjælp af en epifluorescensmikroskop med de passende filtre til DAPI og er udstyret med en CCD-CAmera. Celler er vist i inverteret gråskala. Bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Celletype observeret i de fleste | Renhed | Anslået antal celler (8 timers sortering) | Forurenende stoffer | |
| Befolkning 1 | Trin 1-9 spermatider | 99-100% | 4.000.000 | Trin 10 spermatider |
| Befolkning 2 | Trin 10-12 spermatider | 95-98% | 1.000.000 | Spermatocytter |
| Population 3 | Trin 13-14 spermatider | 99-100% | 800.000 | Spermatocytter, trin 1-9 spermatider |
| Befolkning 4 | Trin 15-16 spermatider | 98-100% | 1.500.000 | Spermatocytter |
Tabel 1: Sorter sædcelleantal befolkninger og deres forurenende stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogene celler har altid været udfordrende at studere betragtning af kompleksiteten af det seminiferøse epitel, samt den begrænsede succes in vitro-dyrkning. I årenes løb, at mange tilgange oprense kimceller fra forskellige arter blev udviklet. Sedimentering teknikker, der anvender tyngdekraften rensning med Percoll eller kvægserumalbumin gradienter giver normalt et godt udbytte af intakte germinale celler, men mangler en ordentlig definition mellem visse celletyper såsom meiotiske tetraploide celler og spermatider 10. Desuden er disse teknikker kræver specielle enheder (ofte hjemmelavede), som måske ikke er let tilgængelige for mange laboratorier, hvilket gør dem vanskelige at reproducere uden besværlige trial and error. Disse metoder er også tidskrævende, meget følsom over for vibrationer og besværligt, da apparatet normalt holdes ved 4 ° C for at opretholde cellelevedygtighed. Når det lykkes, sedimentering metoder dog give flere millioner renset levende calen pr befolkningen. Men den lave celleberigelse, der kan opnås, er den største ulempe ved disse teknikker, da det sjældent når over 80-90% renhed. I visse tilfælde kan en kontaminering af 10-20% fra andre celletyper er til stede, når den måles ved hjælp af DNA, RNA eller protein indhold, hvilket udgør en væsentlig hindring for molekylære analyser.
Når søger at forbedre renheden af cellepopulationer, har nogle forskere kombineret tyngdekraft sedimentering til andre metoder. En af de mest effektive metoder er at anvende umodne mus for at begrænse antallet af forskellige cellepopulationer, der repræsenterer senere faser. Man kan drage fordel af den første bølge af spermatogenesen og opnåelse af et præparat celle indeholdende germinalceller op til en given differentiationsstadium baseret på den heraf følgende udseende efter fødslen. Denne kombinerede fremgangsmåde kræver imidlertid flere dyr for at kompensere for den begrænsede mængde af udgangsmateriale og alligevel ikke løser manglen på definition af sedimentation metoder. Desuden er en sådan tilgang kan ikke anvendes i praksis for senere celler typer såsom spermatider, men bruges hovedsageligt til spermatogonier og primær spermatocyte. Desuden er der tegn på, at den første bølge af spermatogenesen kan harbor celler med lidt forskellige egenskaber end den cykling epitel af moden mus 11,12.
Vitamin A synkronisering af spermatogenesen blev også anvendt til at forbedre germinale celle oprensning som denne procedure indsnævrer antallet af trin til stede i testiklerne af behandlede dyr. Men denne fremgangsmåde anvendes hovedsageligt til at synkronisere spermatogenese hos rotter, med en vis succes rapporteret i mus 13,14. Fra vores egen erfaring, vitamin A synkronisering i mus er tidskrævende, giver sjældent reproducerbare resultater og producerer skadelige bivirkninger hæve bekymring over den cellulære integritet seminiferøse epitel.
OtheR-grupper med held anvendt flowcytometri til at oprense kimceller fra muse 15-18. Men ingen af dem rapporterede rensning af sædcelleantal befolkninger forbi de runde spermatider trin. Vores gating strategi gør det muligt at oprense fire højtoprensede haploide cellepopulationer repræsenterer vigtige differentiering trin kan underkastes molekylære undersøgelser. Den største hindring for fremgangsmåden beskrevet i dette dokument metode kan være den begrænsede udbyttet af sorterede celler. Den højt renhedsniveau er noget opnås på bekostning af antallet af sorterede celler. Men for at være sikker på, at sortering betingelser er optimale, vi tilføjet nogle kritiske råd til protokollen. Alle disse tekniske råd til formål at øge enten nummer eller renheden af sorteret spermatider. For eksempel brugen af FBS belagt rør under sortering i høj grad mindsker tabet af celler, der klæber til rørene. Også ved hjælp af mættende koncentration af SYTO16 hjælper med at reducere variationerne i DNA farvningsintensitet resulterer i mere stabile populationer som ses på FACS plots og et bedre udbytte og renhed af sorterede spermatider over en 8 timers sortering periode. Desuden leveres tekniske råd til FACS sorteringsanlæg set-up helt sikkert bidrage til at øge den samlede effektivitet af sortering ved at undgå celle træsko eller krydskontaminering i at indsamle rør. Alternativt kan porte udvides til at øge antallet af sorterede celler, i sidste instans med et lille fald i befolkningen renhed, som kan være acceptabelt for nogle undersøgelser. Endvidere ethanol-fikserede kimceller farvet med SYTO16 er meget stabile ved 4 ° C og kan sorteres i mere end 8 timer med begrænset gating justeringer og overvågning. I sidste ende, kan flere dages sortering samles for at opnå et tilstrækkeligt antal celler til enhver applikation.
Flow sorteret spermatider opnået som beskrevet her kan anvendes til en række eksperimenter. DNA fra disse celler kan let ekstraheres under anvendelse af kommercielle genomisk DNA oprensningskit og demonstreretat være af passende kvalitet til PCR-analyser 9 og næste generation sequencing (data ikke vist). Weaver spermatider kan også anvendes til proteinanalyser 9 hvor vi udført flere immunblots mod stage-markører for at bekræfte den høje renhed af de sorterede spermatider. Vi verificerede cellulære integritet sorterede spermatider og fandt, at kernen og cytoplasmaet i alle populationer forbliver intakt. Vi fandt imidlertid en del af trin 13-14 spermatider og en mindre andel af trin 15-16 spermatider, der mangler deres flagel (data ikke vist). Derfor, meget rene kim cellepopulationer sorteret bruge denne fremgangsmåde er egnede til proteom og genomiske analyser, samt andre anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Leonid Volkov og Éric Bouchard for deres tekniske rådgivning vedrørende epifluorescens mikroskopi.
Finansiel støtte
Finansieret af den canadiske Institutes of Health Research (tilskud # MOP-93781) til GB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
