Introduction
Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é amplamente utilizado para obter uma melhor compreensão das funções celulares em células vivas com alta resolução temporal e espacial 1. Na FRET, a energia a partir de um fluoróforo dador animado é transferido para um fluoróforo aceitador. Eficiência de TERF é fortemente dependente da distância entre o fluoróforo dador e o aceitador e a sua orientação e é, por conseguinte, um visor sensível de mudanças conformacionais que afectam os dois fluoróforos. Este fenômeno é explorada para gerar biosensores baseados em FRET para a imagem de pequenas moléculas. Alterações na sua concentração pode ser monitorado à medida que aumenta / diminui na proporção de intensidade de emissão do aceitador em relação ao fluoróforo dador 2. Por exemplo, os biossensores de cálcio baseados em FRET permite a detecção rápida e estável de concentrações de cálcio livres nas células 3 viva. Outras vantagens de biosensores baseados em FRET são imagem latente em células vivas individuais, therdeiro não-invasivo, sua capacidade de ser direcionados para diferentes tipos de células e compartimentos celulares 4.
Muitos aspectos da dinâmica de ácidos biliares intracelular ainda são pouco conhecidos. Por exemplo, pouco se sabe sobre o mecanismo de regulação subjacente de transporte de ácido biliar conjugado e não conjugado. Técnicas existentes para monitorar este transporte fazer uso principalmente de repórteres à base de luciferase, ácidos biliares radiomarcados, ou fluorescentes análogos de ácidos biliares. O último requer a modificação de ácidos biliares, possivelmente afetando suas propriedades. Repórteres à base de luciferase tem resolução de tempo pobre. Além disso, estas técnicas de resultar em perda da amostra e não são aplicáveis para a imagem latente em células individuais. Por isso, seria benéfico utilizar métodos que permitem a imagiologia de célula única ao vivo da actividade de transporte de FRET utilizando biossensores, especialmente uma vez que inclui a vantagem de a detecção raciométrica 5, 6. Embora variantes de CFP / YFP forma mais frequentemente utilizada pares FRET, novas estratégias usando Morange e mCherry transportando mutações auto-associação indutores levaram a uma expansão da caixa de ferramentas FRET com novos sensores, incluindo um sensor de ácido biliar vermelho-deslocada 7.
Nós previamente criado um FRET do sensor geneticamente codificado ácido biliar (BAS), que consiste de um fluoróforo dador (azul celeste) e um fluoróforo aceitador (citrino) que estão fundidos com o receptor X farnesoid (FXR) ligando de domínio de ligação (FXR-LBD) e um péptido que contém um motivo LXXLL 8. Este péptido associados com o FXR-LBD de um modo dependente-ácidos biliares. Após a activação FXR, a distância entre o citrino e azul celeste irá alterar devido a uma alteração conformacional. Em linhas celulares de mamíferos, FXR resultados da activação de um aumento claramente detectável na relação de citrino / azul celeste, enquanto o sensor purificada funciona no sentido oposto e leva a uma diminuição do rácio de FRET após activação FXR. Este sensor (CytoBAS)permite o monitoramento da dinâmica dos ácidos biliares citosólicas. Através da adição do terminal carboxilo de motivos alvo subcelulares, a construção pode ser BAS encaminhada para o núcleo (NucleoBAS) e peroxissomas (PeroxiBAS), permitindo medições de concentrações de ácidos biliares em diferentes compartimentos celulares. Embora a adição do motivo de direccionamento peroxissomal não prejudicar a sua capacidade de resposta aos ácidos biliares, células permeáveis FXR-ligandos não induziu qualquer alteração de FRET PeroxiBAS dentro peroxissomas 8. Como a natureza dessa discrepância é desconhecida, o protocolo abaixo está focada em CytoBAS e NucleoBAS.
A utilização deste sensor de FRET geneticamente codificado foi recentemente demonstrada em células contendo os transportadores de ácido biliar hepáticas Na + / taurocolato de co-transporte polipéptido (NTCP) e soluto orgânico alfa / beta transportador (8) OSTαβ. PNCT é o principal importador de ácido biliar hepática e OSTαβ é um bile intestinal basolateraltransportador de ácido que pode funcionar tanto como um importador e exportador dependente do gradiente de concentração de ácido biliar eletroquímica 9, 10. Dados recentes mostraram que mediante transporte de ácido biliar por NTCP e / ou OSTαβ, respostas rápidas e robustas em relação FRET como um resultado da interacção ligando-FXR-LBD pode ser observada.
Aqui, descrevemos protocolos detalhados para métodos para medir FRET como a análise microscópica confocal e de células activada por fluorescência (FACS), realce passos críticos, face a eventuais problemas e discutir métodos alternativos. Usando este sensor de FRET geneticamente codificado, interacção de ácidos biliares com FXR-LBD pode ser quantificado e monitorada directamente em células vivas e proporciona um método rápido e simples de visualizar transporte de ácido biliar e dinâmica em tempo real. Plasmídeos de expressão de mamífero que codifica CytoBAS NucleoBAS e estão comercialmente disponíveis. Portanto, esse biosensor pode contribuir ainda mais para ocompreensão dos transportadores de ácidos biliares ou compostos que ativam FXR e fornecem uma visão mais profunda da biologia ácido biliar e sinalização.
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Protocol
1. Transient Transfection
Nota: CytoBAS e NucleoBAS (Por favor veja Materiais Tabela) são utilizados com sucesso em vários tipos de células, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e células HEK293T). O principal requisito para utilizar o sensor é que ele tem de ser expresso, requer a ADN que codifica para entrar na célula.
- Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir as células em meio de cultura completo adequados para a linha celular específica (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7).
- As células em placas a densidade desejada para uma estéril 8 bem compartimentado tampa de vidro (0,8 cm 2). Alvo para uma sub-confluentes (60-80% de confluência) camada de células no dia da experiência, embora isso não seja essencial.
- Adicionar meio de cultura completo para um volume final de 400 ul por poço. Permitir que as células aderir durante 24 horas.
- Preparar a mistura de transfecção em um tubo estéril por adição de 0,5 ng de NucleoBASou DNA CytoBAS para 100 ul de meio de cultura (soro / antibiótico livre). Vortex bem. Adicionar um reagente de transfecção e misture por vórtex. Reagentes de transfecção que dão máxima eficiência são tipo de célula dependente e pode exigir testes antes.
- Por exemplo, usar 2,5 ul de 1 mg / mL de polietilenimina (PEI) e incuba-se o ADN / PEI misturar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar a mistura de transfecção em gotas para misturar as células e agitando suavemente a placa bem à mão. Adicionar 100 ul da mistura para um poço de 9,6 cm ~ 2. Utilizar 10 ul da mistura de transfecção para câmaras de imagem individuais para as células transf ectadas transitoriamente.
Nota: Após 24-48 horas, as células irão expressar o sensor de ácidos biliares e pode ser utilizado para experiências.
2. Transfecção Estável
- Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir sedimento em meio de cultura completo adequado para a linha celular específica (10% Fetal Bovino Serum, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7) a uma concentração de 150.000 células por ml e adicionar cerca de 300.000 células por cavidade em uma placa de cultura de 6 poços (2 ml de volume final).
- Permitir que as células aderir durante 24 horas.
- Preparar a mistura de transfecção em um tubo estéril por adição de 0,5 ug de ADN ou CytoBAS NucleoBAS (Por favor ver Materiais Tabela) a 100 ul de meio de cultura (de soro / livre antibiótico). Vortex bem. Adicionar um reagente de transfecção e misture por vórtex.
- Por exemplo, usar 2,5 ul de 1 mg / mL de polietilenimina (PEI) e incuba-se o ADN / PEI misturar durante 15 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 100 ul da mistura de transfecção em gotas para misturar as células e agitando suavemente a placa bem à mão. Sempre inclua um controle não transfectada ao criar uma linha celular estável.
- Cultivar células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Tripsinizar as células de acordo com o protocolo do fabricante (Incubar as células a 37 ° C wom 1,5 ml pré-aquecido de tripsina por 25 de 2 cm de cultura de células) e colocá-los para baixo a 250 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Remover as células e ressuspender em sobrenadante 13 ml de meio de cultura completo. Divida as células através de várias placas de cultura de 10 cm de diâmetro: 0,5 ml (baixa densidade), 1,5 ml (de média densidade), e 4,5 ml (alta densidade). Faça o mesmo para os restantes 6,5 ml.
- Adicionar meio de cultura a um volume final de 10 ml. Para células U2OS, utilizar 800 ug / ml de G418 para plasmídeos com a cassete de resistência à neomicina, tal como os CytoBAS e NucleoBAS constrói para seleccionar células positivas. Este tipo de célula concentrações é dependente e pode ser determinado pela selecção do menor antibióticos (G418) de concentração onde não transfectadas células morreram dentro de 2 dias a 10 (800 ug / ml de G418 para células U2OS).
- Atualizar o meio de cultura com o antibiótico adequado (G418) a cada 72 horas até que as células não transfectadas estão mortos.
- Examinar a placa de cultura sob o microscópio com uma objectiva de 20x decolónias positivas (fluorescência pode ser monitorado usando a maioria dos conjuntos de filtros usados para verde, ciano ou fluorescência amarela).
- Marque as colónias positivas que estão isoladas de outras colônias com uma caneta na parte inferior exterior da placa de cultura.
- Lava-se a placa duas vezes com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e aspira-lo. Tome cerca de 15 cilindros de clonagem estéreis e mergulhá-los em silicone estéril. Aplique-os em torno das colônias selecionados pressionando levemente a placa de petri e certifique-se que não mais de uma colônia está incluído no anel de clonagem.
- Pipetar 20 ul de tripsina pré-aquecido (1x, 0,25%) no cilindro de clonagem e incubar a 37 ° C até que a maioria das células foram arredondados para cima (observar com um microscópio).
- Adicionar 150 ul de meio de cultura com soro e o antibiótico adequado (FBS a 10% e 800 ug / ml de G418 para células U2OS e Huh7) no cilindro de clonagem e pipetar para cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender as células e transferir para um 96-bem placa. Actualizar médio após 4-24 h e permitir que as células crescem confluente nos próximos dias (37 ° C, 5% de CO 2 por células U2OS e Huh7).
- Atualizar meio com antibiótico a cada 3 ou 4 dias. Quando as células cresceram confluentes, transferi-los para uma placa de maior. Repita este passo até que a cultura é grande o suficiente para experimentos. Criopreservar alguns frascos para backup. Meio de criopreservação consiste em 20% de FBS e 20% de DMSO em meio (DMEM) sem suplementos.
Nota: Agora, a linha celular monoclonal e é considerada estável para expressar o sensor de ácidos biliares. Metade da concentração do antibiótico G418 (400 ug / ml) é agora suficiente para manter a expressão na linha de células estável.
3. Transdução Lentivirus
Nota: Alguns linhas de células são consideradas difíceis de transfectar por métodos mais tradicionais, tais como o método de polietilenimina (PEI). Transdução viral das células é uma ferramenta alternativa eficiente fou de administração de genes e expressão do transgene estável.
- Células colheita de uma confluência de 80% 25 cm2 balão. Diluir as células em meio de cultura completo, adequado para a linha celular específica (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de pen / strep para as células U2OS e Huh7) e adicionar cerca de 200.000 células por poço numa placa de cultura de 6 poços.
- Adicionar meio de cultura a um volume final de 2 ml por poço. Permitir que as células aderir durante 24 horas.
- Execute transduções virais por células incubação durante 4-6 horas com 500 ul CytoBAS lentivírus contendo meio (disponível mediante solicitação) cheia até um montante total de 1 ml com meio de cultura completo contendo 10 ug / ml de dietilaminoetilo (DEAE) -dextrano ou outro lentiviral intensificador de transdução. Não se esqueça de incluir um poço com células de controlo não transduzidas.
- Remover o meio e adicionar 2 ml de meio de cultura completo contendo o antibiótico desejado (500 ug / ml de higromicina). Utilize uma construção de lentivírus para CytoBAS transdução que fornecems às células resistência a higromicina. Cultivar células sob condições desejadas.
- Actualizar meio com (500 ug / ml de higromicina) antibiótico a cada 3 dias e dividir as células quando 80% confluentes, até que todas as células de controlo negativo são mortos (leva cerca de 1-2 semanas para a maioria das linhas de células). A linha de células é agora considerada estável para expressar o sensor de ácidos biliares.
- Em alternativa, utilize células para experiências de 1-3 dias após a transdução viral. Como o vírus vivo pode estar presente, isso requer equipamentos FRET-leitura em quartos com o nível de segurança adequado.
- Alternativamente, para rápido isolamento de linhas celulares estáveis, executar fluorescência de células activadas (FACS).
- Células colheita de um confluente 160 centímetros 2 balão.
- Diluir as células em meio de cultura de Leibovitz (meio L-15), com <5% de soro a uma concentração de no máximo 5 x 10 6 células por ml
- Para a coleta de células separadas, preencher tubos de FACS com 1 ml de meio de recolha (L-15 médio + 1,5% pen / strep, 1% de L-excesso e 20% de soro).
- Classificar células para citrino (520-580 nm) ou cerúleo (450-520 nm), excitados com 405 laser.
- Após a separação de aproximadamente 500.000 células, girar as células (5 min, 250 x g) e ressuspender-los em 5 ml de meio normal de cultura completo (10% de FBS, 250 ug / ml de higromicina para as células U2OS e Huh7 CytoBAS) e placa-los em uma cultura T25 Garrafa. Cultivar células sob condições desejadas (37 ° C, 5% de CO 2 por células U2OS e Huh7).
4. Imagens de células vivas do Sensor Ácido Bile
Nota: As células que contêm transportadores dos ácidos biliares podem ser cultivadas num meio com 1-10% de soro filtrou-carvão que remove compostos lipofílicos. Soro normal geralmente contém ácidos biliares que podem levar a acumulação de ácidos biliares intra e saturação do Sensor ácidos biliares.
- Medições FRET utilizando o microscópio confocal
- Placa as células de forma estável ou transiently expressando o sensor a uma densidade desejada para uma lamela esterilizada 8 bem fundo câmara de corrediça (0,8 cm 2). Cultivar células em meio de cultura completo (com soro filtrou-carvão), de modo que no dia da experiência, é de cerca de confluência de 60-70%.
- Lavam-se as células aderentes em câmara de corrediça, uma vez com 200 ul de 1x PBS ou Leibovitz L-15, meio de cultura.
- Aspirar e substituir com 300 ul de meio L-15 de Leibovitz cultura de modo que nenhum CO2 controlo é necessário.
Nota: DMEM sem vermelho de fenol podem ser utilizados, assim como CO 2, mas requer condições tampão. Os shows de sensores de ácidos biliares (alguns) pH-sensibilidade de modo objetivo para manter o pH constante durante a coleta de dados. - Dilui-se os compostos a serem utilizados na experiência de imagem confocal também em meio L-15 de cultura. Levar em conta que durante o exame, quantidades relativamente grandes de líquido nas câmaras têm que ser adicionados para assegurar uma mistura rápida da amostra (50-100 ul),assim que soluções 3-5x.
- Inicie o software de imagem de um microscópio confocal com uma temperatura de 37 ° C câmara de incubação e ligue o laser violeta 405 nm. Coloque uma gota de óleo de imersão para o objetivo e colocar a 8 câmaras em cima dela. Para imagens de células única de FRET, utilize o objetivo de petróleo 63X. O sensor tem sido utilizada com sucesso, à TA, mas o comportamento celular pode ser alterada.
- Defina as configurações do microscópio confocal corretamente.
- Defina o modo de aquisição: XYT (time-lapse imagem de plano focal único).
- Adquirir imagens em intervalos de 20 segundos para permitir que os compostos a ser adicionado entre as aquisições sem interromper a experiência.
- Definir faixa espectral para detecção de emissão: Cerulean: 450-520 nm; Citrino: 520-580 nm.
- Concentre-se na camada única célula usando a luz de transiluminação. Comece imagiologia e ajustar a posição z mais precisamente. Ajuste o ganho e offset para cada canal de distinguir sinal de fundo, enquanto permaneceming bem abaixo da saturação para todos os pixels em células de interesse.
- Desenhar círculos para definir a região de interesse (ROI). Selecione as células que mostram a intensidade de fluorescência semelhante. Evitar células que, obviamente, diferentes dos da célula média em tamanho e forma. Expor as células à luz durante um tempo tão curto quanto possível para minimizar a fotodegradação do sensor. É aconselhável chamar ROIs não muito perto do perímetro celular. Esta área é mais sensível às mudanças na intensidade de fluorescência devido à deriva focal (células que se deslocam em direção z) tornando-o mais difícil de monitorar as mudanças na proporção de fluorescência durante o experimento.
- Comece medidas com o microscópio confocal. Aguarde até que a fluorescência cerúleo e citrino é estável.
- Adicionar 50-100 ul ácidos biliares ou outros compostos em pontos de tempo seleccionados durante a medição. As quantidades relativamente altas de líquido (de um quinto a um terço do volume final) são necessárias para misturar fluidos de poço (dentro de 10 segundos) sem agitação / pipetting cima e para baixo. Certifique-se de não tocar na borda da câmara de 8 poços com a ponta da pipeta e adicionar o líquido lentamente, de modo que as células não sair de foco. Não adicione novos compostos antes da fase de platô é atingido. Isso leva cerca de 200 seg.
- Terminar cada experiência com a adição de 100 ul GW4064, concentração final de 5-10 | iM (dose de saturação do sensor) e esperar até que o sensor de fluorescência é estável.
- Salve o experimento e exportar os dados como um arquivo .AVI.
- Open in ImageJ ambos os arquivos AVI (canal 00, cerulean; canalizar 01, citrino) selecionando interleaver Plugins> Pilhas> Stack. Alternativamente, arquivo confocal de importação (por exemplo, .lsm ou arquivos .lif) diretamente em Image J usando plugins apropriados (disponíveis em http://www.openmicroscopy.org) e mover-se para a etapa 4.1.14.
- Para Stack 1: usar Canal 01 (citrino).
- Para Stack 2: usar Canal 00 (cerúleo).
- Clique em Editar> Seleção> Adicionara gerente, para abrir a janela do gerenciador de ROI. Marque a opção 'Mostrar Todos'.
- Desenhe algumas regiões de interesse (ROI), abrangendo células específicas com a ferramenta de seleção oval. Também desenhe um círculo numa zona fora das células ou no interior de uma célula que não expresse o sensor para determinar o sinal de fundo. É aconselhável chamar ROIs não muito perto do perímetro de células em experimentos quando as mudanças na intensidade de fluorescência devido à deriva focal (células que se deslocam em direção z) ou a migração de células eram óbvias.
- Selecione uma célula. Clique em Plugins> Rácio Profiler. Isso resultará em 3 telas: RAW, razão e Ratio_Profile. A janela RAW mostra o aumento da intensidade do citrino (linha azul) e uma diminuição no cerúleo (linha vermelha) se houver FRET. O Rácio de janela dá informação sobre a relação citrino / azul celeste, o que irá aumentar com o aumento da TERF. A janela Ratio_Profile dá o número real de intensidade de fluorescência medido em ambos os canais. Se microslidar arquivos específicos de configuração (por exemplo, .lsm ou .lif em vez de .avi) arquivos são usados a ordem dos canais pode ser revertida.
- Copiar os dados a partir da janela Ratio_Profile da planilha em anexo como dados complementares. Faça o mesmo para todas as outras células e fundo (ROI).
Nota: Na planilha on-line, todos os dados é normalizada para a condição em que se espera a ativação máxima BAS. Dado que é o GW4064 activador mais potente dos FXR, a taxa de fluorescência após a incubação com um excesso de GW4064 é definido como 1. Por conseguinte, é importante para terminar todas as experiências com a adição de GW4064. A vantagem disto é que os dados já não está dependente da intensidade do laser ou ganho do detector e experimentos em dias diferentes podem ser comparados com mais facilidade. Além disso, no diagrama inferior da folha de cálculo, uma média de execução pode ser usado para suavizar as curvas para o ruído experimental. No entanto, não use este gráfico ao analisar dados cinéticos, uma vez que o avera executandoA GE também respostas cinéticas rápidas lisas.
- FRET utilizando medições de fluorescência de células activadas (FACS)
- Dilui-se todos os compostos para o ensaio de FACS em tampão FACS estéreis absorção (EDTA 0,3 mM, 0,5% de BSA, 0,01% de NaN3 e 10 mM de D-glucose).
- Células colheita de um cm2 garrafa de cultura de célula 80% confluentes T-160 utilizando EDTA 5 mM em PBS. Centrifugar células a 250 xg durante 5 minutos. Lavar 2x sedimento celular em 5 ml de tampão de FACS absorção à temperatura ambiente.
- Contagem de células utilizando o contador de Coulter ou numa câmara de contagem.
- Diluir em tampão de captação de grânulo de FACS a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml. Pipeta cima e para baixo para criar uma suspensão homogénea de células individuais. Se as células são difíceis de desagregar, colocar as amostras através de um filtro de células antes de classificar para minimizar entupimentos.
- Pipet 200 células ul por tubo FACS e protegê-los da luz.
- Adicionar a concentração desejada do composto (por exemplo,, Ácidos biliares, ligandos de FXR sintéticos, inibidores do transportador). Vórtice. Incubar durante 20-30 minutos à temperatura ambiente, com agitação (no escuro).
- Enquanto isso, inicie os FACS (os lasers precisam de tempo para se aquecer).
- Definir a citometria de fluxo para os parâmetros de propagação da experiência (ver Figura 3):
- Carregar em torno de 100.000-200.000 NucleoBAS ou CytoBAS células transfectadas para determinar as portas.
- Primeiro ajustar as tensões FSC e SSC para traçar as células no centro da trama.
- Usando o laser violeta, ajustar o cerúleo (450/40 nm) valor de tensão e citrino (525/20 nm) tensão e garantir que todos os NucleoBAS ou CytoBAS células positivas são plotados no gráfico de dispersão.
- Defina as portas corretas (Portão P1 até Portão P4), consulte a Figura 4.
- Use porta P1 para excluir as células mortas, geralmente apresentados no canto inferior esquerdo, seleccionando a população principal no meio do CCD-A / FSC-A trama.
- Use porta em P2o FSC-H / FSC-A janela para remover dupletos de análise. Células individuais são apresentadas em uma linha diagonal mais do que doublets.
- Portão P3 no citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) janela pode ser usado para selecionar para NucleoBAS / CytoBAS células positivas, por gating citrino e de células de alta cerúleo, uma população exibido na diagonal no canto superior direito o enredo.
- Desenhe portão P4 no canto superior esquerdo da população, o mais próximo possível e certifique-se que não mais de 5% das células são abrangidas por esta porta.
- Coloque algumas células não transfectadas (sem expressão de CytoBAS ou NucleoBAS) para determinar auto-fluorescência. A população não transfectadas não pode ser localizado na porta P3. Ajuste porta P3 quando necessário excluir as células auto-fluorescente.
- Agitar as amostras antes da colocação dos tubos no FACS. Para cada amostra, medir pelo menos 10.000 células no portão P3.
Nota: A Janela Hierarquia População dá o número de eventosque está sendo exibido para cada portão e% do portão principal. No portão 4, o% dos pais afirma células com um aumento / rácio cerúleo citrino como uma porcentagem de todas as NucleoBAS células positivas.
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Representative Results
O sensor de FRET-BAS apresentada baseia-se no domínio de FXR (LBD-FXR) de ligação ao ligando ligado a dois fluoróforos de citrino e cerúleas) e um motivo LXXLL. Este sensor permite investigações de transporte de ácido biliar em células com elevada resolução espacial e temporal (Figura 1 A) vivas. Mutações em celeste e citrino foram aplicados para promover a formação do complexo intramolecular (Figura 1 B). Os ácidos biliares e outros ligandos de FXR FXR e ligam-se, assim, alterar a distância entre o citrino e azul celeste por uma alteração conformacional. Em células de mamífero vivo, isto resulta num aumento da eficiência de TERF (aumento de citrino, diminuição celeste) (Figura 1 C, 1 D). Durante uma experiência de células vivas de FRET quantitativa baseada em intensidade com o microscópio confocal, it foi observado que o ácido tauroquenodesoxicólico (ATQDC) tenha sido tratada com (30 mm), as células que expressam U2OS NucleoBAS falta transportadores de ácidos biliares não mostram quaisquer alterações na FRET, enquanto o rácio médio citrino / cerúleo aumentou consideravelmente após o tratamento com GW4064 (5 M) (Figura 1 C). Em contraste, células U2OS que co-expressam NucleoBAS, NTCP e OSTαβ mostrou um claro aumento na proporção de citrino / azul celeste após a adição de ATQDC, e um aumento ainda maior em relação após adição de GW4064 (Figura 1 D). Isto demonstra que ATQDC é incapaz de passar através da membrana da célula e requer transportadores específicos para entrar na célula.
Localização celular do sensor é determinada pela presença de sinais de localização específicos. NucleoBAS é encaminhada para o núcleo por o sinal de localização nuclear (Figura <forte> 2 B), enquanto CytoBAS não contém qualquer sinal de localização e, por conseguinte, permanece no citosol (Figura 2 A). O biossensor pode também ser combinado com a imagem de outras proteínas fluorescentes, permitindo medições de expressão de proteína / localização e activação FXR na mesma célula. Por exemplo, a Figura 2 mostra células U2OS C co-transfectadas com NucleoBAS e NTCP-mKate2. Além disso, o sensor também pode ser combinada com outros sensores para imagiologia subcelular de mais do que um parâmetro simultaneamente. Por exemplo, NucleoBAS foi expressa juntamente com TGR5 (EST clone IMAGE # 5221127) e um sensor de AMPc citosólica (t Epac VV) 11 para medir a activação e TGR5 FXR na mesma célula ao mesmo tempo. Após a ligação TGR5, os níveis de cAMP aumentado no citosol, que foi detectado pelo sensor de AMPc, enquanto que a activação do FXR no núcleo era visualized simultaneamente. Figuras 2D-F mostram uma série de tempo composto de 6 imagens confocais de células T NucleoBAS-TGR5- epac VV, após tratamento com GW4064 (5 fiM) (Figura 2 D), com ATQDC (10 uM) (Figura 2E) ou com ácido quenodesoxicólico (CDCA) (10 uM) (Figura 2 M) a t = 0. A cor verde representa regiões onde a proporção 525/450 nm de emissão diminui (representando elevação de cAMP) e a cor-de-rosa representa um aumento da taxa de emissão (activação FXR), em comparação com as proporções no início da experiência.
Além disso, a citometria de fluxo pode ser utilizado para pesquisar um conjunto de células sobre nível de uma única célula ou como rastreio de alto rendimento em toda a população. As células que expressam U2OS NucleoBAS foram excited com um laser violeta 405 nm e a fluorescência foi coletado no intervalo 450/40 para a faixa de cerúleo e 525/20 para citrino. A fim de melhorar a eficiência de experiências FRET com base em FACS, portas adequadas deve ser definido (Figura 3). O portão P1 exclui os detritos celulares e a porta P2 remove dupletos de análise. Em seguida, a análise é restrita a citrino (animado com 488 laser) e cerúleo (animado com 405 laser) células positivas por portão 3. Finalmente, portão P4 representa a porcentagem de células com uma proporção elevada emissão de citrino / cerúleo (utilizando excitação de cerúleo com 405 a laser nm). Para cada amostra, pelo menos, 10.000 células que se inserem na porta 3 foram medidos.
Posteriormente, com base em FACS FRET citometria de fluxo foi utilizada para calcular o aumento na TERF em células vivas após 30 min de incubação com ATQDC e GW4064. U2OS células tratadas com as não expressam NucleoBAS mostrou <5% das células no portão P4 (citrino / cerulean células-alto). Na ausência de transportadores de ácido biliar, uma percentagem semelhante foi observada em 30 uM ATQDC células tratadas (Figura 4 A). Em contraste, NucleoBAS célula co-expressando, PNCT e OSTαβ fez mostrar um aumento da quantidade de citrino / cerúleo-altos células de cerca de 38%. Após a adição de 10 uM GW4064, quase 90% das células eram citrino / azul celeste de alta independentemente da expressão de OSTαβ ou NTCP (Figura 4 B). Os dados podem ser apresentados em gráficos de barras (% de células na porta 4, a população 4) (Figura 4 C, D) ou como histogramas de população de citrino-rácio azul celeste (Figura 4 E, F).
Figura 1. Projeto do Sensor dos ácidos biliares (BAS). (A) Representação estrutural do modo de ação de um Sensor de ácido Bile geneticamente codificado. É constituída por um fluoróforo dador (azul celeste) e um fluoróforo aceitador (citrino) ligado através do FXR-LBD e fundido com um péptido de FXR-cofactor (motivo LXXLL). (B) domínio arquitectura esquemática dos BAS. Os Q204F / V224L mutações fluoróforo promover a formação de interações intermoleculares entre cerúleo e citrino. O construto contém um NucleoBAS sinal de localização nuclear do C-terminal (NLS) e, portanto, acumula-se no núcleo, enquanto que a construção CytoBAS carece de qualquer sequência de direccionamento e, por conseguinte, é mostrada a localização citossólica. (C) Representante baseada confocal experimento FRET com BAS como uma ferramenta para monitorar o transporte de ácido biliar conjugado. Nenhuma mudança em relação citrino / cerúleo é observado após a adição ATQDC 30 M em células única expressing NucleoBAS. Quando 5 � GW4064 foi adicionado, um forte aumento do rácio citrino / cerúleo foi observada. (D) A importação de ATQDC (30 uM) resulta numa activação considerável do sensor em células cotransfectadas NTCP e OSTαβ. GW4064 (5 uM) O tratamento subsequente conduz a um novo aumento do rácio de citrino / azul celeste. Os resultados são expressos em média ± DP, n = 6 células individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. FRET-BAS Localização construir em células vivas. Imagens microscópio confocal de células U2OS transfectadas com CytoBAS (A) ou NucleoBAS (B). (C) As células U2OS co-transfected com NucleoBAS e PNCT-mKate2. A barra de escala representa 10 um. (D - F) de séries temporais de células transf NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (D) GW4064 activa FXR (aumento da proporção 525/450 nm), mas não TGR5. (E) ATQDC TGR5 activa na membrana plasmática (diminuição da proporção 525/450 nm), mas não é capaz de entrar na célula para activar FXR no núcleo. (F) CDCA ativa TGR5 na membrana plasmática, bem como FXR no núcleo (aumento da proporção 525/450 nm no núcleo, diminuição no citoplasma). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A citometria de fluxo gating parameters. (A) A porta P 1 in / FSC-A janela do SSC-A é usado para excluir as células mortas. (B) Em FSC-H / FSC-A janela, a porta P2 é desenhado para eliminar os eventos doublet de análise. (C) No citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) janela, NucleoBAS (e CytoBAS) células positivas são selecionados (Portão P3). (D) Finalmente, no citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) janela, portão P4 contém citrino / cerúleo-altos células do experimento FACS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .
Figura 4. Experiência representativa FACS medir o transporte de ácido biliar usando NucleoBAS. (A >, B) FACS-plots mostrando a quantidade de citrino / cerúleo-alta NucleoBAS-expressando células vivas U2OS (A) e células U2OS co-expressando NucleoBAS, OSTαβ e PNCT (B) após o tratamento com tampão de controle (à esquerda), 30 mM ATQDC (meio) ou GW4064 10 mM (direita). (C, D) Gráfico de barras mostrando percentagem de citrino / células-cerúleas alta após 30 min de incubação com ATQDC GW4064 ou em células que expressam U2OS NucleoBAS e co-transfectadas com (D) ou sem (C) e OSTαβ NTCP. (E, F) Histograma mostra a distribuição do rácio citrino / cerúleo em uma população de células que expressam U2OS NucleoBAS com ou sem OSTαβ e PNCT após 30 minutos de incubação com ATQDC (amarelo), GW4064 (vermelho) ou tampão de controlo (azul). Todas as condições foram medidos três vezes. As barras representam valores médios + desvio padrão (SD) (n = 3).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a utilização de um sensor de ácido biliar romance geneticamente codificado capaz de controlar a dinâmica espaço-temporais de transporte de ácido biliar em células vivas. Este biossensor consiste em proteínas fluorescentes cerúleas e citrino que são fundidos para FXR-LBD, formando deste modo um sensor de ácido biliar à base de FRET (BAS).
O Sensor Ácido Bile é relativamente simples e conveniente em uso quando se tem experiência básica com cultura de células e FACS ou (confocal) microscopia. No entanto, alguns aspectos pode exigir alguma resolução de problemas. Quando se utiliza o sensor de ácidos biliares em combinação com os transportadores de ácido biliar, recomenda-se as células em meio de cultura com soro filtrou-carvão. Carvão reduz ainda mais os níveis de ácidos biliares por adsorção a partir do soro. Especialmente na presença de importadores como NTCP, isto é crucial para evitar a saturação do sensor durante a cultura, uma vez que esta é a causa mais comum de um sensor insensíveldurante as experiências. Por conseguinte, foi criado um outro sensor (NucleoBAS N354K / I372V) contendo mutações que alteram a sensibilidade a ácidos biliares, a criação de uma gama dinâmica maior 8. Para definir se o sensor já está saturada, a relação de citrino / azul celeste pode ser comparada com a relação em células de controlo que não expressam quaisquer transportadores dos ácidos biliares, uma vez que estas células são assumidos ter baixos niveis intracelulares de ácidos biliares. Alternativamente, microscopia de fluorescência, tempo de vida de imagem (FLIM) medições podem ser realizadas para investigar FRET de uma forma independente de intensidade 12. Esta técnica está além do escopo deste artigo, e requer equipamentos mais especializados. Outras razões para um sensor insensível incluem a utilização de células que são auto-fluorescentes e / ou que perderam NucleoBAS expressão. De nota, as flutuações na intensidade do cerúleo e citrino (por exemplo, devido a mudanças focais) durante o experimento pode obscurecer a visualização direta das mudanças FRET em imagiologia, enquantoa natureza ratiometric do sensor ainda permite o monitoramento da dinâmica de ácidos biliares. Muitas vezes, mudanças de intensidade absolutos são modestos para os fluoróforos individuais mediante adição de ligantes FXR, enquanto o aumento da proporção é evidente.
Para a análise de TERF em células transfectadas com o sensor de BAS, e filtros de luz de laser adequado deve ser seleccionado. O aumento da intensidade do citrino durante FRET tem que ser medido com o laser de diodo violeta (405 nm) com emissões monitorizadas ao longo 450-520 (cerúleo) e 520-580 (citrino). Um aspecto importante a ter em conta é a sensibilidade do sensor de fotobranqueamento. Quando a intensidade de um ou ambos os fluoróforos diminui lentamente com o tempo, sem adição de ligantes, que muitas vezes indica fotobranqueamento. Este fenómeno ocorre principalmente quando o poder do laser for demasiado elevada. Para evitar este efeito indesejável, o poder lasers não deve exceder 5% do total de energia e as células têm que ser mantidas em obscuridade, tanto quanto possível. Limitar atempo para procurar as células corretas. As flutuações na intensidade de fluorescência também pode ser causada por arrastamento focal no eixo z. Para contrariar isto, o tamanho do orifício pode ser aumentada e é aconselhável desenhar ROIs não muito perto do perímetro da célula.
O sensor de FRET para ácidos biliares foi testado em vários tipos de células (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK e células HEK293T) que podem ser transfectadas e têm um fenótipo estável. No entanto, as células primárias e diferenciadas, tais como hepatócitos são difíceis de transfectar e para manter estável em termos de características. Transdução viral pode ajudar com difícil-a-transfectar células (construir disponível quando solicitado). No momento, estamos gerando uma linha mouse para permitir o uso do sensor em células primárias isoladas recentemente que dedifferentiate rapidamente no isolamento.
Para realizar a experiência confocal descrito, é imperativo que a linha celular seleccionada é aderente ao um prato de cultura e cresce num Sicamada de células ngle. No entanto, as células que crescem em suspensão, as células aderentes ou que podem ser tratadas com tripsina com bastante facilidade, pode também ser medida utilizando FACS. Finalmente, é aconselhável para selecionar uma linha celular sem transporte de ácidos biliares endógenos ou síntese quando se analisa a via de transporte específico. Ie, ao medir a atividade de certas (mutantes) proteínas transportadoras transfectadas.
O apresentadas geneticamente codificado BAS biosensor fluorescente é uma ferramenta valiosa para monitorar transporte de animais vivos único ácido biliar celular. A BAS contém um FXR-LBD que é activado por uma grande variedade de ácidos biliares, permitindo imagens de dinâmica subcelulares de ácidos biliares 8. Isto dá uma grande vantagem em relação à utilização de outras técnicas. Por exemplo, em ensaios de repórter de luciferase dirigido do promotor-, o sinal de luciferase está dependente da estabilidade do repórter no interior das células, não suporta informação subcelular, e requer a destruição da amostra
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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