Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) används ofta för att få en bättre förståelse av cellulära funktioner i levande celler med hög tids- och rumsupplösning 1. I FRET är energi från en exciterad donatorfluorofor fördes till en acceptorfluorofor. FRET-effektiviteten är starkt beroende av avståndet mellan givaren och acceptorfluorofor och deras orientering och är därför en känslig avläsning av konformationsförändringar som påverkar de två fluoroforer. Detta fenomen utnyttjas för att generera FRET-baserade biosensorer för avbildning av små molekyler. Förändringar i deras koncentration kan övervakas som ökar / minskar i förhållandet emissionsintensiteten hos acceptorn kontra donatorfluoroforen 2. Till exempel, FRET-baserade kalcium biosensorer möjliggör snabb och stabil detektering av fria kalciumkoncentrationer i levande celler 3. Andra fördelar med FRET-baserade biosensorer avbildning i enskilda levande celler, tarvinge icke-invasivitet av deras förmåga att riktas mot olika celltyper och cellulära avdelningar 4.
Många aspekter av intracellulära Gallsyrebindande dynamik fortfarande dåligt kända. Till exempel, är lite känt om mekanismen underliggande regleringen av konjugerat och okonjugerat gallsyratransport. Befintliga metoder för att övervaka denna transport Främst av luciferas baserade reportrar, radiomärkta gallsyror, eller fluorescerande gallsyrabindande analoger. Det senare kräver en ändring av gallsyror, eventuellt påverkar deras egenskaper. Luciferas-baserade reportrar har dålig tidsupplösning. Förutom dessa tekniker resultera i förlust av provet och inte är tillämpliga för avbildning i enskilda celler. Därför skulle det vara fördelaktigt att använda metoder som möjliggör levande enda cell imaging transportaktivitet med hjälp av FRET biosensorer, särskilt eftersom det ingår fördelen med kvotmetriska upptäckt 5, 6. Även varianter av CFP / YFP formulär som används mest FRET par, nya strategierna genom mOrange och mCherry bär självassociation framkallande mutationer har lett till en utvidgning av FRET verktygslåda med nya sensorer, inklusive en röd-skiftat gallsyran sensor 7.
Vi har tidigare skapat en genetiskt kodad FRET-gallsyra sensor (BAS), som består av en donatorfluorofor (cerulean) och en acceptorfluorofor (citrin) som är sammansmälta med den farnesoid X-receptorn (FXR) ligandbindande domän (FXR-LBD) och en peptid innehållande en LXXLL-motivet 8. Denna peptid associerar med FXR-LBD i en gallsyra beroende sätt. Vid FXR aktivering, kommer avståndet mellan citrin och cerulean ändra på grund av en konformationsförändring. I däggdjurscellinjer, FXR aktivering resulterar i en klart detekterbar ökning i citrin / cerulean förhållande, medan det renade sensorn fungerar i motsatt riktning och leder till en minskad FRET förhållandet vid FXR aktivering. Denna sensor (CytoBAS)möjliggör övervakning av cytosoliska gallsyrabindande dynamik. Genom karboxylterminal tillsats av subcellulära inriktnings motiv, kan BAS konstruktionen målriktas mot kärnan (nukleobas) och peroxisomer (PeroxiBAS), vilket tillåter mätningar av gallsyra-koncentrationer i olika cellulära avdelningar. Även om tillsatsen av peroxisomal inriktning motivet inte försämra dess lyhördhet för gallsyror, gjorde cellpermeabla FXR-ligander inte framkalla någon FRET förändringar av PeroxiBAS inne peroxisomer 8. Arten av denna skillnad är okänd, under protokollet är inriktad på CytoBAS och nukleobas.
Användningen av detta genetiskt kodad FRET sensor demonstrerades nyligen i celler innehållande hepatiska gallsyrabindande transportörer Na + / taurokolat sam-transporterande polypeptid (NTCP) och organiskt löst ämne transportör alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP är den huvudsakliga lever gallsyran importör och OSTαβ är en basolaterala tarm gallasyra transportör som kan fungera både som importör och exportör beroende på elektro gallsyrakoncentrationen lutning 9, 10. Nya data visade att vid gallsyratransport av NTCP och / eller OSTαβ, kan observeras robusta och snabba svar i FRET-förhållande som ett resultat av ligand-FXR-LBD-interaktion.
Här beskriver vi detaljerade protokoll för metoder för att mäta FRET såsom konfokala mikroskopisk analys och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), markera kritiska steg, ta itu med potentiella problem och diskutera alternativa metoder. Med användning av denna genetiskt kodad FRET-sensorn, kan gallsyra interaktion med FXR-LBD kvantifieras och övervakas direkt i levande celler och ger en snabb och enkel metod för att visualisera gallsyratransporten och dynamik i realtid. Däggdjur expressionsplasmider som kodar CytoBAS och nukleobas är kommersiellt tillgängliga. Därför kan denna biosensor ytterligare bidra tillförståelse av galla syra transportörer eller föreningar som aktiverar FXR och ger en djupare inblick i gallsyror biologi och signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transient transfektion
Obs: CytoBAS och nukleobas (Se Material tabell) används framgångsrikt i flera celltyper, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK och HEK293T celler). Det viktigaste kravet att använda sensorn är att det behöver uttryckas, vilket kräver det kodande DNA för att komma in i cellen.
- Harvest celler från en 80% sammanflytande 25 cm 2 kolv. Späd celler i fullständigt odlingsmedium som lämpar sig för den specifika cellinje (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep för U2OS och Huh7-celler).
- Plate celler vid den önskade densiteten i en steril 8 väl chambered täckglas (0,8 cm 2). Sikta på en sub-konfluenta (60-80% konfluens) skikt av celler på dagen för experimentet, även om detta inte är väsentligt.
- Lägg fullständigt odlingsmedium till en slutlig volym av 400 | il per brunn. Låt cellerna fästa under 24 timmar.
- Förbered transfektion mix i ett sterilt rör genom tillsats av 0,5 mikrogram av nukleobaseller CytoBAS DNA till 100 pl odlingsmedium (serum / antibiotikafritt). Vortex väl. Lägg till en transfektionsreagens och blanda genom att vortexa. Transfektionsreagenser som ger optimal effektivitet är celltyp beroende och kan kräva föregående testning.
- Exempelvis använder 2,5 pl av en mg / ml polyetylenimin (PEI) och inkubera DNA / PEI blanda under 15 min vid RT.
- Lägg transfektion blandningen i droppar till cellerna och blanda genom att försiktigt skaka väl plattan för hand. Tillsätt 100 pl av blandningen under en brunn av ~ 9,6 cm 2. Använd 10 pl av transfektionsblandningen för individuella avbildningskammare för övergående transfekterade celler.
Anmärkning: Efter 24-48 h, kommer celler uttrycker gallsyran sensorn och kan användas för experiment.
2. Stabil transfektion
- Harvest celler från en 80% sammanflytande 25 cm 2 kolv. Späd pelleten i fullständigt odlingsmedium som är lämpligt för den specifika cellinje (10% fetalt bovint Serum, 1% L-glutamin, 1% pen / strep för U2OS och Huh7-celler) till en koncentration av 150.000 celler per ml och tillsätt cirka 300 tusen celler per brunn i en 6-brunnars odlingsplatta (2 ml änden volym).
- Låt cellerna fästa under 24 timmar.
- Förbered transfektion mix i ett sterilt rör genom tillsats av 0,5 pg av CytoBAS eller nukleobas DNA (Se Material tabell) till 100 pl odlingsmedium (serum / antibiotika gratis). Vortex väl. Lägg till en transfektionsreagens och blanda genom att vortexa.
- Exempelvis använder 2,5 pl av en mg / ml polyetylenimin (PEI) och inkubera DNA / PEI blanda under 15 min vid RT.
- Tillsätt 100 ul av transfektionsblandningen i droppar till cellerna och blanda genom att försiktigt skaka väl plattan för hand. Inkluderar alltid en otransfekterade kontroll när du skapar en stabil cellinje.
- Odla celler O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
- Trypsinisera celler enligt tillverkarens protokoll (Inkubera cellerna vid 37 ° C bITH 1,5 ml förvärmd trypsin per 25 cm 2 cellkultur) och snurra dem ner vid 250 xg vid RT i 5 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 13 ml komplett odlingsmedium. Dela upp celler över olika 10 cm diameter odlingsskålar: 0,5 ml (låg densitet), 1,5 ml (medeldensitet), och 4,5 ml (hög densitet). Gör samma sak för resterande 6,5 ml.
- Lägg odlingsmedium till en slutlig volym av 10 ml. För U2OS celler, använder 800 mikrogram / ml G418 för plasmider med neomycinresistens kassetten såsom CytoBAS och nukleobas konstruktioner för att selektera för positiva celler. Detta koncentrationer är celltyp beroende och kan bestämmas genom att välja lägsta antibiotika (G418) koncentration där otransfekterade celler dog inom 2 till 10 dagar (800 mikrogram / ml G418 för U2OS celler).
- Uppdatera odlingsmediet med lämpligt antibiotikum (G418) var 72 timmar tills otransfekterade celler är döda.
- Undersök odlingsplatta under mikroskop med en 20x objektiv förpositiva kolonier (fluorescens kan övervakas med hjälp av de flesta filteruppsättningar som används för grön, cyan eller gul fluorescens).
- Markera de positiva kolonierna som ligger isolerade från andra kolonier med en penna på utsidan botten av odlingsskålen.
- Tvätta plattan två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och aspirera den. Ta ca 15 sterila kloningscylindrar och doppa dem i sterilt silikon. Tillämpa dem runt de utvalda kolonierna genom att trycka lätt mot petriskål och se till att inte mer än en koloni ingår i kloningsringen.
- Pipettera 20 pl av förvärmda trypsin (1x, 0,25%) i kloningcylindern och inkubera vid 37 ° C tills det mesta av cellerna har avrundade upp (observera med ett mikroskop).
- Tillsätt 150 pl odlingsmedium med serum och lämpligt antibiotikum (10% FBS och 800 mikrogram / ml G418 för U2OS och Huh7 celler) i kloningscylinder och pipettera upp och ned flera gånger för att resuspendera cellerna och överför till en 96-brunnar. Uppdatera mediet efter 4-24 timmar och låta cellerna att växa sammanhängande under de närmaste dagarna (37 ° C, 5% CO2 under U2OS och Huh7 celler).
- Uppdatera medium med antibiotika var 3 eller 4 dagar. När cellerna har vuxit konfluenta, överföra dem till en större brunnar. Upprepa detta steg tills kulturen är tillräckligt stor för experiment. Cryopreserve några flaskor för backup. Frysförvaring Mediet består av 20% FBS och 20% DMSO i media (DMEM) utan tillägg.
Obs: Nu är cellinjen monoklonala och vara stabil för att uttrycka Bile Acid Sensor. Halva koncentrationen av antibiotikumet G418 (400 | ig / ml) är nu tillräcklig för att upprätthålla uttryck i stabil cellinje.
3. Lentiviral Transduktion
Obs! Vissa cellinjer anses svåra att transfektera med mer traditionella metoder såsom polyetylenimin metoden (PEI). Viral transduktion av celler är ett effektivt alternativ verktyg feller gen-leverans och stabilt transgenexpression.
- Harvest celler från en 80% sammanflytande 25 cm 2 kolv. Späd celler i fullständigt odlingsmedium som är lämpligt för den specifika cellinje (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep för U2OS och Huh7-celler) och tillsätt cirka 200 tusen celler per brunn i en 6-brunnars odlingsplatta.
- Lägg odlingsmedium till en slutlig volym av 2 ml per brunn. Låt cellerna fästa under 24 timmar.
- Utför virus transduktioner genom att inkubera celler för 4-6 timmar med 500 ul CytoBAS lentivirus innehållande medium (på begäran) fylls upp till ett sammanlagt belopp om 1 ml med komplett odlingsmedium innehållande 10 ug / ml dietylaminoetyl (DEAE) -dextran eller annan lentiviral transduktion förstärkare. Glöm inte att ta med en brunn med otransducerade kontrollceller.
- Avlägsna mediet och tillsätt 2 ml av komplett odlingsmedium innehållande önskat antibiotikum (500 | ig / ml hygromycin). Använd en lentivirala konstruktet för CytoBAS transduktion som gers hygromycinresistens till celler. Odla celler under önskade betingelser.
- Uppdatera medium med (500 mikrogram / ml hygromycin) antibiotikum var 3 dagar och dela cellerna när 80% sammanflytande, tills alla negativa kontrollceller är döda (tar ca 1-2 veckor för de flesta cellinjer). Cellinjen anses nu vara stabil för expression av gallsyrakoncentration sensor.
- Alternativt kan du använda celler för experiment 1-3 dagar efter viral transduktion. Som levande virus kan förekomma, kräver FRET-avläsning utrustning i rum med lämplig säkerhetsnivå.
- Alternativt, för snabb isolering av stabila cellinjer, utföra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
- Harvest celler från en konfluent 160 cm 2 kolv.
- Späd celler i Leibovitz odlingsmedium (L-15 medium) med <5% serum till en koncentration av högst 5 x 10 6 celler per ml
- För insamling av sorterade celler, fylla FACS rör med 1 ml av insamling medium (L-15-medium + 1,5% pen / strep, en% L-glut och 20% serum).
- Sortera celler för citrin (520-580 nm) eller cerulean (450-520 nm), glada med 405 laser.
- Efter sortering cirka 500 tusen celler, spinn ner celler (5 min, 250 x g) och återsuspendera dem i 5 ml normal komplett odlingsmedium (10% FBS, 250 | ig / ml Hygromycin för U2OS och Huh7 CytoBAS celler) och plattan dem i en T25 odlings kolv. Odla celler under önskade betingelser (37 ° C, 5% CO2 under U2OS och Huh7-celler).
4. Levande cell imaging av Bile Acid Sensor
Obs: Celler innehållande gallsyra-transportörer kan odlas i medium med 1-10% träkol filtrerad serum som avlägsnar lipofila föreningar. Normalt serum innehåller ofta gallsyror som kan leda till intracellulär gallsyror anhopning och mättnad av Bile Acid Sensor.
- FRET mätningar med konfokalmikroskop
- Platta cellerna stabilt eller transiently uttrycker sensorn på den önskade densiteten i en steril 8 väl täck botten kammare slide (0,8 cm 2). Odla celler i fullständigt odlingsmedium (med användning av träkol filtrerad serum) så att det på dagen för experimentet, är konfluens omkring 60-70%.
- Tvätta de vidhäftande cellerna i kammaren glida gång med 200 ^ il 1 x PBS eller Leibovitz L-15 odlingsmedium.
- Aspirera och ersätt med 300 pl Leibovitz L-15 odlingsmedium så att ingen CO 2 kontroll är nödvändig.
Obs: DMEM utan fenolrött kan likaså användas men kräver CO2 buffrade betingelser. De gallsyra sensor visar (vissa) pH-känslighet syftar så för att hålla pH konstant under datainsamlings. - Späd föreningarna som ska användas i det konfokala avbildningsexperiment också i L-15 odlingsmedium. Ta hänsyn till att under avbildning, relativt stora mängder vätska i kamrarna måste tillsättas för att säkerställa snabb blandning av provet (50-100 ul),så gör 3-5x lösningar.
- Starta bildbehandlingsprogram av en konfokalmikroskop med en 37 ° C inkubationskammaren och slå på violett 405 nm laser. Sätt en droppe immersionsolja på målet och placera 8-kammare ovanpå den. För enda cell avbildning av FRET använder oljeobjektiv 63X. Sensorn har med framgång använts vid RT, men cellbeteende skulle kunna förändras.
- Ställ in inställningarna för konfokalmikroskop ordentligt.
- Ställ Förvärv läge: xyt (time-lapse avbildning av enstaka fokalplan).
- Hämta bilder på 20 sek intervaller för att tillåta föreningar som skall läggas mellan förvärv utan att avbryta försöket.
- Ställ spektralområdet för emissionsdetektering: Cerulean: 450-520 nm; Citrin: 520-580 nm.
- Fokus på den enda cellskiktet med hjälp av genomlysning ljus. Starta avbildning och justera z-positionen mer exakt. Justera förstärkning och offset för varje kanal för att skilja signal från bakgrunden medan kvaring långt under mättnad för alla bildpunkter i celler av intresse.
- Rita cirklar för att definiera regionen av intresse (ROI). Välj celler som visar liknande fluorescensintensitet. Undvik celler som uppenbarligen skiljer sig från den genomsnittliga cell i storlek och form. Exponera cellerna för ljus under en tid så kort som möjligt för att minimera fotoblekning av sensorn. Det är lämpligt att dra ROI inte mycket nära cell omkrets. Detta område är mest känsliga för förändringar i fluorescensintensitet på grund av fokal drift (celler som rör sig i z-riktning) gör det svårare att övervaka förändringar i fluorescensförhållande under försöket.
- Börja mätningar med konfokalmikroskop. Vänta tills cerulean och citrin fluorescens är stabil.
- Lägg 50-100 il gallsyror eller andra föreningar vid valda tidpunkter under mätning. De relativt höga mängder vätska (en femtedel till en tredjedel av den slutliga volymen) är nödvändigt att blanda vätskorna väl (inom 10 sek) utan att skaka / pipetting upp och ner. Se till att inte röra vid kanten av den 8 brunnar kammare med pipettspetsen och tillsätt vätskan långsamt så att cellerna inte komma ur fokus. Inte lägga till nya föreningar innan platåfasen nås. Detta tar ungefär 200 sekunder.
- Avsluta varje experiment med tillsats av 100 pl GW4064, slutkoncentration 5-10 iM (sensormätt dos) och vänta tills sensor fluorescens är stabil.
- Spara experimentet och exportera data som en AVI-fil.
- Öppna i ImageJ både AVI-filer (kanal 00, cerulean, kanal 01, citrin) genom att välja Plugins> Staplar> Stack interleaver. Alternativt, import konfokala fil (t.ex. .lsm eller .lif filer) direkt i Image J med hjälp av lämpliga plugins (finns på http://www.openmicroscopy.org) och gå till steg 4.1.14.
- För Stack 1: använd Kanal 01 (citrin).
- För Stack 2: använd Kanal 00 (cerulean).
- Klicka på Redigera> Val> Läggtill chef för att öppna ROI manager fönstret. Markera kryssrutan "Visa alla".
- Rita några områden av intresse (ROI) som täcker specifika celler med den ovala markeringsverktyget. Drar också en cirkel i ett område utanför celler eller i en cell som inte uttrycker sensorn för att bestämma bakgrundssignalen. Det är lämpligt att dra ROI inte mycket nära cell omkrets i experiment då förändringar i fluorescensintensitet på grund av fokal drift (celler som rör sig i z-riktning) eller cellmigration var uppenbara.
- Välj en cell. Klicka på Plugins> Ratio Profiler. Detta kommer att resultera i 3 skärmar: RAW, förhållande och Ratio_Profile. RAW fönstret visar ökningen i intensiteten hos citrin (blå linje) och en minskning i cerulean (röd linje) om det finns FRET. Ratio fönstret ger information om förhållandet citrin / cerulean, vilket kommer att öka med en ökning av FRET. Den Ratio_Profile fönstret ger det faktiska antalet fluorescensintensitet mätt i båda kanalerna. Om microsklara installationsspecifika filer (t.ex. .lsm eller .lif stället för .avi-filer) används kanalen ordning kan vändas.
- Kopiera data från Ratio_Profile fönstret i kalkylbladet bifogas som kompletterande data. Gör samma sak för alla de andra cellerna (och bakgrunds ROI).
Obs: I online kalkylblad, normaliseras till det tillstånd vid vilken maximal BAS aktivering väntas all data. Med tanke på att GW4064 är den mest potenta aktivator av FXR är fluorescensförhållandet efter inkubation med ett överskott på GW4064 satt till 1. Det är därför viktigt att avsluta alla försök med tillsats av GW4064. Fördelen med detta är att data inte längre är beroende av laserintensiteten eller detektorförstärkning och experiment på olika dagar kan jämföras lättare. Vidare i det nedre diagrammet i kalkylbladet, ett löpande medelvärde kan användas för att jämna kurvorna för experimentella brus. Men inte använda denna graf vid analys av kinetiska data, eftersom den löpande averaGE kommer också släta snabba kinetiska svar.
- FRET mätningar med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
- Späd alla föreningar för FACS-experiment i sterila FACS upptagsbuffert (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN3 och 10 mM D-glukos).
- Harvest celler från en 80% konfluent T-160 cm 2 cellodlings kolv med användning 5 mM EDTA i PBS. Centrifugera cellerna vid 250 xg under 5 min. Tvätta cellpelleten 2x i 5 ml FACS upptagsbuffert vid RT.
- Räkna celler med användning av Coulter-räknare eller en räkningskammare.
- Späd pelleten i FACS upptag buffert till en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Pipettera upp och ner för att skapa en homogen suspension av enskilda celler. Om celler är svåra att disaggregera lade proverna genom en cell sil före sortering för att minimera munstycken träskor.
- Pipett 200 ul celler per FACS rör och skydda dem från ljus.
- Lägg den önskade koncentrationen av föreningen (t.ex., Gallsyror, syntetiska FXR ligander, transportörer hämmare). Virvel. Inkubera under 20-30 min vid RT under omskakning (i mörker).
- Samtidigt starta FACS (lasrarna behöver tid att värma upp).
- Ställ flödescytometri grindparametrarna för experimentet (se figur 3):
- Ladda runt 100,000-200,000 nukleobas eller CytoBAS transfekterade celler för att bestämma grindarna.
- Först justera FSC och SSC spänningar att rita cellerna i mitten av tomten.
- Med hjälp av violett laser, justera cerulean (450/40 nm) spänningsvärde och citrin (525/20 nm) spänning och se till att alla nukleobas eller CytoBAS positiva celler plottas i punktdiagrammet.
- Ställ in rätt grindar (Gate P1 upp till Gate P4), se figur 4.
- Använd grind P1 för att utesluta döda celler, vanligtvis visas i det nedre vänstra hörnet genom att välja befolkningen i mitten av SSC-A / FSC-En tomt.
- Använd grind P2 iFSC-H / FSC-Ett fönster för att ta bort duplets från analys. Enstaka celler presenteras i en mer diagonal linje än dubbletter.
- Gate P3 i citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) fönstret kan användas för att selektera för nukleobas / CytoBAS positiva celler, genom grind citrin och cerulean höga celler, uppvisade en befolkning diagonalt i det övre högra hörnet av handlingen.
- Rita grind P4 längst upp till vänster av befolkningen, så nära som möjligt och se till att inte mer än 5% av cellerna faller inom denna port.
- Ladda några otransfekterade celler (inget uttryck för CytoBAS eller nukleobas) för att bestämma auto-fluorescens. Den otransfekterade befolkningen får inte placeras i grind P3. Justera grind P3 vid behov för att utesluta auto-fluorescerande celler.
- Vortexa provexemplaren före placera rören i FACS. För varje prov, vara minst 10.000 celler i grind P3.
Obs: Befolknings Hierarki Fönstret ger antalet händelservisas för varje grind och% av moder grinden. I grinden 4, den% av moder påstår celler med en ökad citrin / cerulean förhållandet i procent av alla nukleobas positiva celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET-BAS sensor presenteras baseras på den ligandbindande domänen av FXR (LBD-FXR) fäst vid två fluoroforer citrin och cerulean) och en LXXLL-motivet. Denna sensor gör utredningar gallsyratransport i levande celler med hög rumslig och temporal upplösning (figur 1 A). Mutationer i cerulean och citrin applicerades för att främja bildningen av den intramolekylära komplexet (figur 1 B). Gallsyror och andra FXR ligander binder till FXR och därigenom förändra avståndet mellan citrin och cerulean av en konformationsförändring. I levande däggdjursceller, resulterar detta i en ökad FRET effektivitet (citrin ökning, cerulean minskning) (figur 1 C, 1 D). Under en levande cell kvantitativ intensitet baserad FRET experimentera med konfokalmikroskop, jagt observerades att taurochenodeoxycholic syra (TCDCA) -behandlade (30 iM) U2OS celler som uttrycker nukleobas saknar gallsyrabindande transportörer inte påvisa eventuella förändringar i FRET, medan den genomsnittliga citrin / cerulean förhållandet ökat anmärkningsvärt efter behandling med GW4064 (5 M) (Figur 1 C). Däremot U2OS celler samuttrycker nukleobas, gjorde NTCP och OSTαβ visar en tydlig ökning av citrin / cerulean förhållande vid tillsats av TCDCA, och en ännu större ökning av förhållandet efter tillsats av GW4064 (fig 1 D). Detta visar att TCDCA inte kan passera genom cellmembranet och kräver specifika transportörer för att komma in i cellen.
Cellulär lokalisering av sensorn bestäms genom närvaron av specifika lokaliseringssignaler. Nukleobas är riktad till kärnan av den nukleära lokaliseringssignalen (figur <strong> 2 B), medan CytoBAS inte innehåller någon lokaliseringssignal och förblir därför i cytosolen (fig 2 A). Biosensorn kan också kombineras med avbildning av andra fluorescerande proteiner, som möjliggör mätningar av proteinuttryck / lokalisering och FXR aktivering i samma cell. Exempelvis visar figur 2 C U2OS celler samtransfekterade med nukleobas och NTCP-mKate2. Dessutom kan sensorn också kombineras med andra sensorer för subcellulär avbildning av mer än en parameter samtidigt. Till exempel var nukleobas uttrycktes tillsammans med TGR5 (EST-klon IMAGE # 5.221.127) och en cAMP-cytosolisk sensor (T Epac VV) 11 för att mäta TGR5 och FXR aktivering i samma cell på samma gång. Vid TGR5 bindande, cAMP-nivåer ökade i cytosolen som upptäcktes av cAMP sensorn, medan FXR aktivering i kärnan var visualized samtidigt. Figurerna 2D-F visar en tidsserie bestående av 6 konfokala bilder av nukleobas-TGR5- T EPAC vv-celler efter behandling med GW4064 (5 pM) (figur 2 D), med TCDCA (10 pM) (figur 2 E) eller med kenodeoxicholsyra (CDCA) (10 M) (Figur 2 F) vid t = 0. Den gröna färgen representerar områden där 525/450 nm emissionsförhållandet är minskat (representerande cAMP höjd) och den rosa färgen representerar en ökning av emissionsförhållandet (FXR aktivering), jämfört med förhållandena i början av experimentet.
Dessutom flödescytometri kan användas för att screena en pool av celler på enskild cellnivå eller såsom högeffektiv screening på hela befolkningen. U2OS celler som uttrycker nukleobas var EXCITed med en violett 405 nm laser och fluorescensen samlades upp i 450/40 intervallet för cerulean och 525/20 intervall för citrin. För att förbättra effektiviteten i FACS-baserade FRET experiment måste rätta grindar ställas in (Figur 3). P1 gate utesluter celldebris och P2 gate bort duplets från analys. Därefter analysen begränsad till citrin (exciteras med 488 laser) och cerulean (exciteras med 405 laser) positiva celler genom grinden 3. Slutligen representerar grinden P4 procentandelen celler med en hög citrin / cerulean emissionsförhållandet (med användning av excitation av cerulean med 405 nm laser). För varje prov, var minst 10.000 celler som föll inom gate 3 mätt.
Därefter tillsattes FACS-baserade FRET flödescytometri användas för att beräkna en ökning av FRET i levande celler efter 30 min inkubation med TCDCA och GW4064. Icke-behandlade U2OS celler som uttrycker nukleobas visade <5% celler i grind P4 (citrin / cerulean-höga celler). I avsaknad av galla syra transportörer, en liknande procentsats observerats i 30 iM TCDCA behandlade celler (Figur 4 A). Däremot cell samuttrycker nukleobas, NTCP och OSTαβ uppvisade en ökad mängd citrin / cerulean-höga celler av omkring 38%. Efter tillsats av 10 | iM GW4064, var nästan 90% av cellerna citrin / cerulean-hög oberoende av expression av OSTαβ eller NTCP (Figur 4 B). Data kan presenteras i stapeldiagram (% celler i grinden 4, befolkning 4) (fig 4 C, D) eller som populations histogram av citrin-cerulean förhållande (fig 4 E, F).
Figure 1. Utformning av gallsyran Sensor (BAS). (A) Strukturell representation av verkningssättet för en genetiskt kodad gallsyrakoncentration sensor. Den består av en donatorfluorofor (cerulean) och en acceptorfluorofor (citrin) länkad via FXR-LBD och kondenserad till en FXR-cofaktor peptid (LXXLL-motivet). (B) Schematisk domänarkitektur av BAS. De Q204F / V224L fluoroforenhetema mutationer främja bildandet av intramolekylära interaktioner mellan cerulean och citrin. Den nukleobas konstruktionen innehåller en C-terminal nukleär lokaliseringssignal (NLS) och därför ackumuleras i kärnan, medan den CytoBAS konstruktet saknar någon målsökande sekvensen och därför visar cytosolisk lokalisation. (C) Representant konfokala baserade FRET experiment med BAS som ett verktyg för att övervaka konjugerad gallsyratransport. Ingen förändring i citrin / cerulean förhållandet observeras efter 30 iM TCDCA tillskott i celler bara expressing nukleobas. När 5 pM GW4064 tillsattes, en starkt ökad citrin / cerulean förhållande observeras. (D) Införsel av TCDCA (30 iM) resulterar i en avsevärd aktivering av sensorn i Ntcp och OSTαβ co-transfekterade celler. Efterföljande GW4064 (5 pM) behandling leder till en ytterligare ökning av citrin / cerulean förhållande. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD, n = 6 enskilda celler. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Lokalisering FRET-BAS-konstruktionen i levande celler. Konfokalmikroskop bilder av U2OS celler transfekterade med CytoBAS (A) eller nukleobas (B). (C) U2OS celler sam-transfected med nukleobas och NTCP-mKate2. Skalan stapel representerar 10 mikrometer. (D - F) Tidsserier av nukleobas-TGR5- T EPAC VV transfekterade celler. (D) GW4064 aktiverar FXR (ökad 525/450 nm förhållande), men inte TGR5. (E) TCDCA aktiverar TGR5 på plasmamembranet (minskade 525/450 nm ratio), men kan inte komma in i cellen för att aktivera FXR i kärnan. (F) CDCA aktiverar TGR5 på plasmamembranet samt FXR i kärnan (ökade 525/450 nm förhållande i kärnan, minskade i cytoplasman). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flödescytometri grind parameters. (A) P 1 gate i SSC-A / FSC-Ett fönster används för att utesluta döda celler. (B) I FSC-H / FSC-Ett fönster är P2 porten dras för att eliminera dubblett händelser från analys. (C) I citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) fönster, nukleobas (och CytoBAS) positiva celler selekteras (Gate P3). (D) Slutligen, i citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) fönstret, innehåller P4 gate citrin / cerulean höga celler i FACS experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Figur 4. Representant FACS experiment mäta gallsyratransport använder nukleobas. (A > B) FACS-diagram som visar mängden citrin / cerulean höga levnads nukleobas-uttryck U2OS celler (A) och U2OS celler samuttrycker nukleobas, OSTαβ och NTCP (B) efter behandling med kontrollbuffert (till vänster), 30 iM TCDCA (mitten) eller 10 | iM GW4064 (höger). (C, D) stapeldiagram som visar procentandelen citrin / cerulean-hög celler efter 30 min inkubation med TCDCA eller GW4064 i U2OS celler som uttrycker nukleobas och samtransfekterades med (D) eller utan (C) OSTαβ och NTCP. (E, F) Histogram visar fördelningen av citrin / cerulean förhållandet i en population av U2OS celler som uttrycker nukleobas med eller utan OSTαβ och NTCP efter 30 min inkubation med TCDCA (gul), GW4064 (röd) eller kontrollbuffert (blå). Alla villkor mättes tre gånger. Staplarna representerar medelvärdena + standardavvikelse (SD) (n = 3).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande File 1:. Mall BAS allmänna Klicka här för att ladda ned den här filen.
Kompletterande File 2. Mall BAS Zeiss Leica importerade data Klicka här för att ladda ned den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för användning av en ny genetiskt kodad gallsyror sensor som kan övervaka Spatiotemporal dynamik gallsyratransport i levande celler. Denna biosensor består av cerulean och citrin fluorescerande proteiner som är fuserade till FXR-LBD, och därigenom bilda en FRET-baserad gallsyra sensor (BAS).
Gallsyran Sensor är relativt enkel och bekväm användning när man har grundläggande erfarenhet med cellodling och FACS eller (konfokal) mikroskopi. Dock kan vissa aspekter kräver en viss felsökning. Vid användning av gallsyra sensor i kombination med gallsyra-transportörer, rekommenderas att odla celler i medium med träkol filtrerad serum. Kol reducerar ytterligare gallsyror nivåer genom adsorption från serum. Särskilt i närvaro av importörer såsom NTCP, är detta avgörande för att förhindra mättning av sensorn under odling, eftersom det är den vanligaste orsaken till en okänslig sensorunder experimenten. Därför gjordes en annan sensor skapas (nukleobas N354K / I372V) innehållande mutationer som ändrar känsligheten för gallsyror, vilket skapar en större dynamiskt område 8. För att definiera om sensorn redan är mättad, kan citrin / cerulean förhållande jämföras med förhållandet i kontrollceller som inte uttrycker något gallsyrabindande transportörer, eftersom dessa celler antas ha låga intracellulära galla syranivåer. Alternativt kan fluorescens-livstids imaging mikroskopi (FLIM) mätningar utföras för att undersöka FRET i en intensitetsoberoende sätt 12. Denna teknik är utanför ramen för detta dokument och kräver mer specialiserad utrustning. Andra orsaker till en okänslig sensor innefattar användning av celler som är auto-fluorescerande och / eller har förlorat nukleobas uttryck. Notera kan fluktuationer i intensitet cerulean och citrin (till exempel på grund av bränn skift) under försöket skymma direkt visualisering av FRET förändringar under avbildning, medanden kvotmetriska naturen av sensorn fortfarande tillåter övervakning av gallsyrabindande dynamik. Ofta absoluta intensitetsförändringar är blygsam för de enskilda fluoroforer vid tillsättning av FXR-ligander, medan ökningen i förhållandet är uppenbar.
För FRET-analys i celler transfekterade med BAS sensorn, bör väljas lämpligt laserljus och filter. Ökningen av citrin intensitet under FRET måste mätas med den violetta diod (405 nm) laser med utsläpp övervakas över 450-520 (cerulean) och 520-580 (Citrin). En viktig aspekt att ta hänsyn till är känsligheten hos givaren till fotoblekning. När intensiteten hos en eller båda fluoroforer sakta sjunker i tid utan tillsats av ligander, ofta indikerar det fotoblekning. Detta fenomen uppstår främst när lasereffekten är för hög. För att undvika denna oönskade effekt bör lasrar kraften inte överstiga 5% av den fulla kraften och cellerna måste hållas i mörker så mycket som möjligt. Begränsatid att söka efter de rätta cellerna. Fluktuationer i fluorescensintensitet kan också orsakas av fokal avdrift i z-axeln. För att motverka detta kan pinhole storlek ökas och det är lämpligt att dra ROI inte mycket nära cell omkrets.
FRET sensor för gallsyror har testats i flera celltyper (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK och HEK293T celler) som kan transfekterade och har en stabil fenotyp. Men primära och differentierade celler såsom hepatocyter är svåra att transfektera och att upprätthålla en stabil när det gäller egenskaper. Viral transduktion kan hjälpa till med svår transfektera celler (konstruera tillgänglig på begäran). Vi håller på att generera en mus linje att tillåta användning av sensorn i nyisolerade primära celler som snabbt dedifferentiate vid isolering.
För att utföra den konfokala experimentet beskrivet, är det absolut nödvändigt att den valda cellinjen är vidhäftande till en odlingsskål och växer i en single cellskikt. Celler som växer i suspension eller vidhäftande celler som kan trypsinerade ganska lätt, kan också mätas med hjälp av FACS. Slutligen, är det tillrådligt att välja en cellinje utan endogen gallsyratransporten eller syntes när man analyserar ett visst transportväg. Dvs vid mätning av aktiviteten hos vissa transfekterade (muterade) transportproteiner.
De presenterade genetiskt kodade fluorescerande biosensor BAS är ett värdefullt verktyg för att övervaka enda levande cell gallsyratransport. BAS innehåller en FXR-LBD som aktiveras av en stor variation av gallsyror, vilket möjliggör avbildning av subcellulära dynamik gallsyror 8. Detta ger en stor fördel i förhållande till användningen av andra tekniker. Till exempel i promotordriven luciferas reporter analyser, är luciferas signal beroende på stabiliteten av rapportör inom celler, stöder inte subcellulär information och kräver destruktion av provet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M.
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B.
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
