Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) es ampliamente utilizado para obtener una mejor comprensión de las funciones celulares en las células vivas con una alta resolución temporal y espacial 1. En FRET, la energía de un fluoróforo donante excitado se transfiere a un fluoróforo aceptor. Eficiencia de FRET es fuertemente dependiente de la distancia entre el donante y el fluoróforo aceptor y su orientación y por lo tanto es una lectura sensible de los cambios conformacionales que afectan a los dos fluoróforos. Este fenómeno se explota para generar biosensores basados en FRET para la obtención de imágenes de moléculas pequeñas. Los cambios en su concentración pueden ser monitoreados a medida que aumenta / disminuye en la proporción de intensidad de emisión del aceptor con respecto al fluoróforo donante 2. Por ejemplo, biosensores calcio basados en FRET permiten la detección rápida y estable de las concentraciones de calcio libres en las células 3 viviente. Otras ventajas de biosensores basados en FRET se Imaging en células vivas individuales, theredera no invasividad, de su capacidad para dirigirse a diferentes tipos de células y 4 compartimentos celulares.
Muchos aspectos de la dinámica de ácidos biliares intracelular son aún poco conocidos. Por ejemplo, se sabe poco sobre el mecanismo de regulación subyacente de transporte de ácidos biliares conjugada y no conjugada. Técnicas existentes para supervisar este transporte hacen principalmente el uso de reporteros basados en luciferasa, ácidos biliares radiomarcados, o análogos de ácidos biliares fluorescentes. Esto último requiere la modificación de los ácidos biliares, posiblemente afecte a sus propiedades. Periodistas basados en luciferasa tienen mala resolución de tiempo. Además, estas técnicas resultan en la pérdida de la muestra y no son aplicables para formación de imágenes en las células individuales. Por lo tanto, sería beneficioso utilizar métodos que permiten imágenes de células única en vivo de la actividad de transporte utilizando biosensores FRET, especialmente ya que incluye la ventaja de la detección radiométrica 5, 6. Mientras que las variantes de CFForma P / YFP usa más frecuentemente pares FRET, nuevas estrategias que utilizan Morange y mCherry que portan mutaciones auto-asociación inductores han dado lugar a una expansión de la caja de herramientas FRET con nuevos sensores, incluyendo un sensor de ácido biliar desplazada al rojo 7.
Hemos creado previamente una FRET bilis sensor ácido genéticamente codificado (BAS), que consiste en un fluoróforo donante (cerúleo) y un fluoróforo aceptor (citrino) que se fusiona con el dominio de unión a ligando de receptor X farnesoide (FXR) (FXR-LBD) y un péptido que contiene un motivo LXXLL 8. Este péptido se asocia con el FXR LBD-ácido de una manera dependiente de la bilis. Tras la activación de FXR, la distancia entre citrino y cerúleo alterará debido a un cambio conformacional. En líneas celulares de mamíferos, FXR activación resulta en un aumento claramente detectable en la proporción de citrino / cerúleo, mientras que el sensor purificada trabaja en la dirección opuesta y conduce a una relación de FRET disminuido tras la activación de FXR. Este sensor (CytoBAS)permite el monitoreo de la dinámica de ácidos biliares citosólicas. Mediante la adición carboxilo-terminal de motivos dirigidos subcelulares, el constructo de BAS puede ser dirigido al núcleo (NucleoBAS) y peroxisomas (PeroxiBAS), lo que permite mediciones de las concentraciones de ácidos biliares en diferentes compartimentos celulares. Aunque la adición del motivo focalización peroxisomal no perjudica su capacidad de respuesta a los ácidos biliares, de células permeables FXR ligandos no indujo cambios en cualquier traste PeroxiBAS dentro de los peroxisomas 8. Como la naturaleza de esta discrepancia no se conoce, el protocolo a continuación se centra en CytoBAS y NucleoBAS.
El uso de este sensor FRET codificados genéticamente se demostró recientemente en las células que contienen los transportadores de ácidos biliares hepáticos Na + polipéptido / taurocolato de co-transporte (PNCT) y orgánica alfa transportador de soluto / beta (OSTαβ) 8. PNCT es el importador de ácido biliar hepática principal e OSTαβ es una bilis intestinal basolateraltransportador de ácido que puede funcionar tanto como un importador y exportador depende del gradiente de concentración de ácidos biliares electroquímica 9, 10. Los datos recientes muestran que al transporte de ácidos biliares por PNCT y / o OSTαβ, las respuestas sólidas y rápidas en relación de FRET como un resultado de la interacción ligando-FXR-LBD se pueden observar.
A continuación, describimos protocolos detallados para los métodos para medir la FRET como el análisis microscópico y confocal de células activadas por fluorescencia (FACS), destacamos pasos críticos, abordamos los problemas potenciales y discutir métodos alternativos. El uso de este sensor FRET codificado genéticamente, la interacción de ácidos biliares con FXR-LBD se puede cuantificar y monitoreada directamente en las células vivas y proporciona un método rápido y simple de visualizar transporte de ácidos biliares y la dinámica en tiempo real. Plásmidos de expresión de mamíferos que codifican CytoBAS NucleoBAS y están disponibles comercialmente. Por lo tanto, este biosensor puede contribuir aún más a lala comprensión de los transportadores de ácidos biliares o compuestos que activan el FXR y proporcionan una visión más profunda de la biología de los ácidos biliares y la señalización.
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Protocol
1. Transfección transitoria
Nota: CytoBAS y NucleoBAS (Por favor, consulte la Tabla de Materiales) se utilizan con éxito en varios tipos de células, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK y células HEK293T). El requisito principal para usar el sensor es que necesita ser expresada, lo que requiere el ADN que codifica para entrar en la célula.
- Las células de la cosecha de un 80% de confluencia 25 cm 2 frasco. Diluir las células en medio de cultivo completo adecuados para la línea específica de células (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% pen / strep para las células U2OS y Huh7).
- Células de placas a la densidad deseada en un 8 cubreobjetos así cámaras estéril (0,8 cm 2). Trate de mantener un sub-confluentes (60-80% de confluencia) capa de células en el día del experimento, aunque esto no es esencial.
- Añadir medio de cultivo completo hasta un volumen final de 400 l por pocillo. Permitir que las células se unan durante 24 horas.
- Preparar la mezcla de transfección en un tubo estéril mediante la adición de 0,5 g de NucleoBASo ADN CytoBAS a 100 l de medio de cultivo (suero / libre de antibióticos). Vortex también. Añadir un reactivo de transfección y mezclar mediante agitación. Reactivos de transfección que dan un rendimiento óptimo son el tipo de células dependiente y pueden requerir pruebas previas.
- Por ejemplo, utilizar 2,5 l de polietilenimina 1 mg / ml (PEI) e incubar el ADN / PEI mezclar durante 15 min a TA.
- Añadir la mezcla de transfección en gotas a las células y mezclar agitando suavemente la placa de la mano. Añadir 100 l de la mezcla durante un pozo de 9,6 cm ~ 2. Utilice 10 l de la mezcla de transfección para cámaras de formación de imágenes individuales para células transfectadas transitoriamente.
Nota: Después de 24 a 48 h, las células expresarán el sensor de ácido biliar y pueden ser utilizados para los experimentos.
2. Transfección estable
- Las células de la cosecha de un 80% de confluencia 25 cm 2 frasco. Diluir sedimento en medio de cultivo completo adecuado para la línea celular específica (10% Bovino Fetal SErum, 1% de L-glutamina, 1% pen / strep para las células U2OS y Huh7) a una concentración de 150.000 células por ml y añadir alrededor de 300.000 células por pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos (2 ml de volumen final).
- Permitir que las células se unan durante 24 horas.
- Prepare la mezcla de transfección en un tubo estéril añadiendo 0,5 g de CytoBAS o ADN NucleoBAS (Por favor, consulte la Tabla de Materiales) a 100 l de medio de cultivo (suero / libre de antibióticos). Vortex también. Añadir un reactivo de transfección y mezclar mediante agitación.
- Por ejemplo, utilizar 2,5 l de polietilenimina 1 mg / ml (PEI) e incubar el ADN / PEI mezclar durante 15 min a TA.
- Añadir 100 l de la mezcla de transfección en gotas a las células y mezclar agitando suavemente la placa de la mano. Incluya siempre un control untransfected al crear una línea celular estable.
- Crecer células O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Trypsinize células según el protocolo del fabricante (incuban las células a 37 ° C wITH 1,5 ml precalentado de tripsina por 25 cm 2 de cultivo de células) y girar hacia abajo a 250 xg a TA durante 5 min. Retire las células sobrenadante y resuspender en 13 ml de medio de cultivo completo. Divida las células a través de varias placas de cultivo de 10 cm de diámetro: 0,5 ml (de baja densidad), 1,5 ml (densidad media) y 4,5 ml (alta densidad). Haga lo mismo para el resto de 6,5 ml.
- Añadir medio de cultivo a un volumen final de 10 ml. Para U2OS células, usar 800 mg de G418 / ml para los plásmidos con el casete de resistencia a la neomicina tales como los CytoBAS y NucleoBAS construye para seleccionar las células positivas. Este concentraciones es de tipo celular dependiente y se puede determinar seleccionando el antibiótico más bajo (G418) de concentración donde las células no transfectadas murieron dentro de 2 a 10 días (G418 800 mg / ml para las células U2OS).
- Actualizar el medio de cultivo con el antibiótico apropiado (G418) cada 72 horas hasta que las células no transfectadas están muertos.
- Examine la placa de cultivo bajo el microscopio con un objetivo 20X paracolonias positivas (fluorescencia pueden ser monitoreados utilizando la mayoría de los conjuntos de filtros utilizados para el verde, cian o fluorescencia amarilla).
- Marque las colonias positivas que se encuentran aislados de otras colonias con una pluma en la parte inferior exterior de la placa de cultivo.
- Lavar la placa dos veces con tampón fosfato salino (PBS) y aspirar él. Toma alrededor de 15 cilindros de clonación estériles y sumergirlos en silicona estéril. Aplicar ellas alrededor de las colonias seleccionadas presionando ligeramente el plato petri y asegúrese de que no más de una colonia se incluye en el anillo de la clonación.
- Pipetear 20 l de tripsina pre-calentado (1x, 0,25%) en el cilindro de clonación y se incuba a 37 ° C hasta que la mayoría de las células han redondeado (observan con un microscopio).
- Añadir 150 ml de medio de cultivo con suero y antibiótico adecuado (10% de SFB y 800 mg / ml de G418 para las células U2OS y Huh7) en el cilindro de la clonación y la pipeta hacia arriba y abajo varias veces de volver a suspender las células y transferir a un 96-así plato. Actualizar medio después de 4 a 24 horas y permiten que las células crezcan confluentes en los próximos días (37 ° C, 5% de CO 2 para las células U2OS y Huh7).
- Actualizar medio con antibióticos cada 3 o 4 días. Cuando las células han crecido confluentes, transferirlos a una placa más grande. Repita este paso hasta que la cultura es lo suficientemente grande para los experimentos. Criopreservar algunos viales para backup. Medio crioconservación consiste en 20% de SFB y 20% DMSO en los medios de comunicación (DMEM) sin suplementos.
Nota: Ahora, la línea celular es monoclonal y considera estable para expresar el Sensor de ácidos biliares. La mitad de la concentración del antibiótico G418 (400 mg / ml) es ahora suficiente para mantener la expresión en la línea celular estable.
3. Lentiviral Transducción
Nota: algunas líneas celulares se consideran difíciles de transfectar por métodos más tradicionales, como el método de polietilenimina (PEI). Transducción viral de las células es una herramienta alternativa eficiente fo gen de la entrega y la expresión del transgen estable.
- Las células de la cosecha de un 80% de confluencia 25 cm 2 frasco. Diluir las células en medio de cultivo completo adecuado para la línea celular específica (10% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% pen / strep para las células U2OS y Huh7) y añadir alrededor de 200.000 células por pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos.
- Añadir medio de cultivo a un volumen final de 2 ml por pocillo. Permitir que las células se unan durante 24 horas.
- Realizar transducciones virales por las células de incubación de 4-6 horas con 500 l CytoBAS lentivirus que contiene medio (bajo petición) llenó hasta una cantidad total de 1 ml con medio de cultivo completo que contiene 10 mg / ml de dietilaminoetilo (DEAE) -dextrano u otra lentiviral potenciador de la transducción. No se olvide de incluir un bien con las células control no transducidas.
- Retire medio y añadir 2 ml de medio de cultivo completo que contienen el antibiótico deseado (500 mg / ml de higromicina). Use un constructo lentiviral para CytoBAS transducción que proporcionans resistencia a la higromicina a las células. Crecer células bajo condiciones deseadas.
- Actualizar medio con (500 mg / ml de higromicina) antibiótico cada 3 días y dividir las células cuando el 80% de confluencia, hasta que todas las células de control negativo están muertos (tarda aproximadamente 1-2 semanas para la mayoría de las líneas celulares). La línea celular se considera ahora estable para expresar el Sensor de ácidos biliares.
- También puede utilizar las células para los experimentos de 1-3 días después de la transducción viral. Como virus vivo podría estar presente, esto requiere un equipo FRET-lectura en las habitaciones con el nivel de seguridad adecuado.
- Alternativamente, para el aislamiento rápido de líneas celulares estables, lleve a cabo clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
- Las células de la cosecha de un confluente 160 cm 2 frasco.
- Diluir las células en medio de cultivo Leibovitz (L-15 Mediana) con <5% de suero a una concentración de un máximo de 5 x 10 6 células por ml
- Para la recolección de células clasificadas, llenar tubos FACS con 1 ml de medio de recogida (L-15 medio + 1,5% penicilina / estreptomicina, 1% de L-saturación y el 20% de suero).
- Ordenar células para citrino (520-580 nm) o cerúleo (450-520 nm), excitados con 405 láser.
- Después de la clasificación aproximadamente 500.000 células, centrifugar las células (5 min, 250 xg) y resuspender en 5 ml de medio normal de cultivo completo (10% FBS, 250 g / ml de higromicina para las células U2OS y Huh7 CytoBAS) y la placa en una cultura T25 matraz. Crecer células bajo condiciones deseadas (37 ° C, 5% de CO 2 para las células U2OS y Huh7).
4. Imágenes de células vivas del sensor de ácido biliar
Nota: Las células que contienen los transportadores de ácidos biliares pueden ser cultivadas en un medio con 1-10% de suero con filtro de carbón que elimina compuestos lipófilos. El suero normal a menudo contiene ácidos biliares que podrían conducir a la acumulación intracelular de ácidos biliares y la saturación del sensor de ácidos biliares.
- Mediciones de FRET utilizando el microscopio confocal
- Placa de las células de manera estable o transiently expresando el sensor en la densidad deseada en un 8 y cubreobjetos de fondo de diapositivas cámara estéril (0,8 cm 2). Cultivar las células en medio de cultivo completo (utilizando suero con filtro de carbón) de forma que en el día del experimento, de confluencia es de alrededor de 60-70%.
- Lavar las células adherentes en portaobjetos de cámara una vez con 200 l 1x PBS o de Leibovitz L-15 medio de cultivo.
- Aspirar y reemplazar con 300 l L-15 de Leibovitz medio de cultivo de manera que ningún control CO 2 es necesario.
Nota: DMEM sin rojo fenol se puede utilizar también, pero requiere CO 2 condiciones tamponadas. Los espectáculos de sensores de ácidos biliares (algunos) pH-sensibilidad de modo objetivo de mantener el pH constante durante la recopilación de datos. - Diluir los compuestos para ser usados en el experimento de formación de imágenes confocal también en L-15 medio de cultivo. Tome en cuenta que durante la exploración, tienen que ser añadido relativamente grandes cantidades de líquido en las cámaras para asegurar una rápida mezcla de la muestra (50-100 l),así que las soluciones 3-5X.
- Inicie el software de imágenes de un microscopio confocal con una cámara de incubación C 37 ° y encienda el láser nm violeta 405. Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo y colocar el 8-cámara en la parte superior de la misma. Para imágenes de células única de FRET, utilice el objetivo aceite de 63X. El sensor se ha utilizado con éxito en RT, pero el comportamiento celular puede ser alterado.
- Establezca los ajustes del microscopio confocal correctamente.
- De modo Ajuste de adquisición: xyt (time-lapse de plano focal individual).
- Adquirir imágenes a intervalos de 20 segundos para permitir que los compuestos que se añaden entre las adquisiciones sin pausa el experimento.
- Establecer rango espectral para la detección de emisiones: Cerulean: 450 a 520 nm; Citrino: 520-580 nm.
- Centrarse en la capa de células individuales usando luz transiluminación. Iniciar la formación de imágenes y ajustar la posición z con mayor precisión. Ajuste la ganancia y el offset para cada canal de distinguir la señal de fondo mientras permanezcaing muy por debajo de la saturación para todos los píxeles en las células de interés.
- Dibuja círculos para definir la región de interés (ROI). Seleccionar las células que muestran la intensidad de fluorescencia similar. Evite las células que, obviamente, difieren de la célula normal en tamaño y forma. Exponer las células a la luz durante un tiempo lo más corto posible para minimizar fotoblanqueo del sensor. Es aconsejable sacar rendimiento de la inversión no muy cerca del perímetro de la célula. Esta zona es más sensible a los cambios en la intensidad de fluorescencia debido a la deriva focal (células que se mueven en la dirección z) por lo que es más difícil de monitorear los cambios en la relación de fluorescencia durante el experimento.
- Comience mediciones con el microscopio confocal. Espere hasta que la fluorescencia cerúleo y citrino es estable.
- Añadir 50-100 ácidos biliares mu l u otros compuestos en los puntos de tiempo seleccionados durante la medición. Las cantidades relativamente altas de líquido (un quinto a un tercio del volumen final) son necesarios para mezclar los fluidos así (a menos de 10 seg) sin agitación / pipetting arriba y hacia abajo. Asegúrese de no tocar el borde de la cámara de 8 pocillos con la punta de la pipeta y añadir el líquido lentamente para que las células no reciben fuera de foco. No añadir nuevos compuestos antes de que se alcance la fase de meseta. Esto tarda aproximadamente 200 seg.
- Final de cada experimento con la adición de 100 l GW4064, concentración final 5 hasta 10 mM (dosis saturante sensor) y esperar hasta que la fluorescencia del sensor es estable.
- Guarde el experimento y exportar los datos como un archivo AVI.
- Abrir en ImageJ ambos archivos AVI (canal 00, cerúleo, canal 01, citrino) seleccionando Plugins> Pilas> Pila de entrelazado. Alternativamente, archivo confocal de importación (por ejemplo, .lsm o archivos .lif) directamente en la imagen J usando plugins adecuados (disponibles en http://www.openmicroscopy.org) y pasar al paso 4.1.14.
- Por Pila 1: utilizar Canal 01 (citrino).
- Por Pila 2: utilizar Canal 00 (cerúleo).
- Haga clic en Editar> Cambios> Añadirel gerente, para abrir la ventana del administrador de retorno de la inversión. Marque la casilla 'Mostrar todos'.
- Dibuja unas pocas regiones de interés (ROI) que cubren las células específicas con la herramienta de selección ovalada. También dibujar un círculo en un área fuera de las células o en el interior de una célula que no expresa el sensor para determinar la señal de fondo. Es aconsejable sacar rendimiento de la inversión no muy cerca del perímetro de células en experimentos cuando los cambios en la intensidad de fluorescencia debido a la deriva focal (células que se mueven en la dirección z) o la migración de células eran obvias.
- Seleccione una celda. Haga clic en Plugins> Profiler Ratio. Esto resultará en 3 pantallas: RAW, ratio y Ratio_Profile. La ventana RAW muestra el aumento en la intensidad de citrino (línea azul) y una disminución en cerúleo (línea roja) si hay FRET. La ventana Ratio da información acerca de la relación citrino / cerúleo, lo que aumentará con un aumento en FRET. La ventana Ratio_Profile da los números reales de la intensidad de fluorescencia se mide en ambos canales. Si microsfrente archivos de configuración específica (por ejemplo, .lsm o .lif lugar de .avi) archivos se utilizan el orden de los canales puede ser revertida.
- Copiar los datos desde la ventana Ratio_Profile en la hoja de cálculo que se adjunta como datos suplementarios. Hacer lo mismo para todas las otras células (y fondo ROI).
Nota: En la hoja de cálculo en línea, todos los datos se normaliza a la condición en la que se espera la activación máxima BAS. Dado que GW4064 es el activador más potente de FXR, la relación de fluorescencia después de la incubación con un excedente de GW4064 se establece en 1. Por tanto, es importante para poner fin a todos los experimentos con la adición de GW4064. La ventaja de esto es que los datos ya no es dependiente de la intensidad del láser o la ganancia del detector y los experimentos en diferentes días se pueden comparar más fácilmente. Por otra parte, en el gráfico inferior de la hoja de cálculo, un promedio móvil se puede utilizar para suavizar las curvas para el ruido experimental. Sin embargo, no utilice este gráfico en el análisis de los datos cinéticos, ya que la avera corriendoGE también respuestas cinéticas rápidas lisas.
- Mediciones de FRET utilizando fluorescencia de células activadas clasificación (FACS)
- Diluir todos los compuestos para el experimento en FACS FACS estériles tampón de absorción (EDTA 0,3 mM, 0,5% de BSA, 0,01% NaN 3 y 10 mM D-glucosa).
- Las células de la cosecha de un 80% de confluencia T-160 cm2 cultivo celular frasco utilizando EDTA 5 mM en PBS. Las células se centrifuga a 250 g durante 5 min. Lavar 2x sedimento de células en FACS 5 ml de tampón de absorción a TA.
- Recuento de células utilizando el contador Coulter o una cámara de recuento.
- Diluir sedimento en tampón de absorción FACS a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión homogénea de células individuales. Si las células son difíciles de desagregar, poner las muestras a través de un filtro de células antes de la clasificación para minimizar las obstrucciones de la boquilla.
- Pipetear 200 l células por tubo de FACS y protegerlos de la luz.
- Añadir la concentración deseada del compuesto (por ejemplo,, Los ácidos biliares, ligandos FXR sintéticos, inhibidores del transportador). Vórtice. Incubar durante 20-30 min a TA mientras se agitaba (en la oscuridad).
- Mientras tanto, iniciar las FACS (los láseres necesitan tiempo para calentarse).
- Establezca la citometría de flujo parámetros de compuerta para el experimento (véase la Figura 3):
- Cargar alrededor de 100.000-200.000 NucleoBAS o CytoBAS células transfectadas para determinar las puertas.
- Primero ajustar los voltajes de FSC y SSC para trazar las células en el centro de la trama.
- Usando el láser violeta, ajustar el cerúleo (450/40 nm) valor de la tensión y citrino (525/20 nm) Tensión y asegurar que todos NucleoBAS o CytoBAS células positivas se representan en el gráfico de dispersión.
- Establecer las puertas correctas (Puerta P1 hasta Puerta P4), vea la Figura 4.
- Utilice puerta P1 para excluir las células muertas, por lo general se muestran en la esquina inferior izquierda de la selección de la principal población en el medio de la SSC-A / FSC-Una parcela.
- Utilice P2 puerta enFSC-H / FSC-Una ventana para eliminar dosillos del análisis. Las células individuales se presentan en una línea más diagonal de dobletes.
- Puerta de P3 en el citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) de la ventana puede ser utilizado para seleccionar a NucleoBAS / CytoBAS células positivas, por gating citrino y pilas de gran cerúleo, una población representada en diagonal en la esquina superior derecha de la trama.
- Dibuje P4 puerta en la parte superior izquierda de la población, lo más cerca posible y asegurarse de que no más del 5% de las células caen dentro de esta puerta.
- Cargar algunas células no transfectadas (sin expresión de CytoBAS o NucleoBAS) para determinar autofluorescencia. La población no transfectadas no puede estar situado en la puerta P3. Ajustar P3 puerta cuando sea necesario para excluir las células auto-fluorescente.
- Vortex las muestras antes de la colocación de los tubos en el FACS. Para cada muestra, medir al menos 10.000 células en P3 puerta.
Nota: La Jerarquía Ventana Población da el número de eventosque se muestra para cada puerta y% de la puerta principal. En la puerta 4, el% de los padres afirma células con una mayor relación de citrino / cerúleo como un porcentaje de todas las células positivas NucleoBAS.
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Representative Results
El sensor FRET-BAS presentado se basa en el dominio de FXR (LBD-FXR) de unión al ligando unido a dos fluoróforos citrino y cerúleo) y un motivo LXXLL. Este sensor permite investigaciones de transporte de ácidos biliares en las células con alta resolución espacial y temporal (Figura 1 A) viviente. Las mutaciones en cerúleo y citrino se aplicaron a promover la formación del complejo intramolecular (Figura 1 B). Los ácidos biliares y otros ligandos FXR se unen a FXR y con ello alterar la distancia entre citrino y cerúleo por un cambio conformacional. En células de mamíferos que viven, esto resulta en un aumento de la eficiencia de FRET (aumento citrino, disminución cerúleo) (Figura 1 C, 1 D). Durante una célula viva cuantitativa basada en la intensidad de FRET experimento con el microscopio confocal, it se observó que el ácido tauroquenodesoxicólico (TCDCA) tratados con (30 M) U2OS células que expresan NucleoBAS carecen de transportadores de ácidos biliares no muestran cambios en FRET, mientras que el citrino relación media / cerúleo aumentó notablemente después del tratamiento con GW4064 (5 M) (Figura 1 C). En contraste, las células U2OS co-expresión de NucleoBAS, PNCT y OSTαβ mostraron un claro incremento en relación citrino / cerúleo tras la adición de TCDCA, y un aumento aún mayor en relación después de la adición de GW4064 (Figura 1 D). Esto demuestra que TCDCA es incapaz de pasar a través de la membrana de la célula y requiere transportadores específicos para entrar en la célula.
Celular localización del sensor se determina por la presencia de señales específicas de localización. NucleoBAS está dirigido al núcleo por la señal de localización nuclear (Figura <strong> 2 B), mientras que CytoBAS no contiene ninguna señal de localización y por lo tanto permanece en el citosol (Figura 2 A). El biosensor también se puede combinar con las imágenes de otras proteínas fluorescentes, lo que permite mediciones de la expresión de la proteína / localización y la activación de FXR en la misma célula. Por ejemplo, la Figura 2 C muestra U2OS células co-transfectadas con NucleoBAS y PNCT-mKate2. Además, el sensor también se puede combinar con otros sensores para formación de imágenes subcelular de más de un parámetro simultáneamente. Por ejemplo, NucleoBAS se expresó junto con TGR5 (EST clon imagen # 5221127) y un sensor de cAMP citosólico (T Epac VV) 11 para medir la activación de FXR TGR5 y en la misma célula al mismo tiempo. Al TGR5 vinculante, aumentaron los niveles de cAMP en el citosol que fue detectado por el sensor de cAMP, mientras que la activación de FXR en el núcleo era visualized simultáneamente. Las figuras 2D-F mostrar una serie temporal compuesta de 6 imágenes confocal de células NucleoBAS-TGR5- T EPAC vv después del tratamiento con GW4064 (5 M) (Figura 2 D), con TCDCA (10 M) (Figura 2 E) o con ácido quenodesoxicólico (CDCA) (10 M) (Figura 2 F) en t = 0. El color verde representa regiones donde se disminuye la emisión de 525/450 nm relación (que representan la elevación de cAMP) y el color rosa representa un aumento en la relación de emisión (activación FXR), en comparación con las relaciones en el inicio del experimento.
Además, la citometría de flujo se puede utilizar para cribar una reserva de células en nivel de células individuales o como cribado de alto rendimiento en toda la población. U2OS células que expresan NucleoBAS eran Excited con un láser violeta 405 nm y la fluorescencia se recogió en el rango 450/40 para la gama cerúleo y 525/20 para citrino. Con el fin de mejorar la eficiencia de FRET a base de experimentos FACS, puertas adecuadas deben establecerse (Figura 3). La puerta P1 excluye los desechos celulares y la puerta P2 elimina dosillos del análisis. A continuación, el análisis se limita a citrino (entusiasmados con 488 láser) y cerúleo (entusiasmados con 405 láser) células positivas por la puerta 3. Por último, P4 puerta representa el porcentaje de células con un ratio de emisión de alta citrino / cerúleo (utilizando excitación de cerúleo con láser 405 nm). Para cada muestra, se midieron al menos 10.000 células que cayeron dentro de la puerta 3.
Posteriormente, se utilizó citometría de flujo de FRET a base de FACS para calcular un aumento en FRET en las células vivas después de 30 min de incubación con TCDCA y GW4064. U2OS células tratadas para no expresan NucleoBAS mostraron <5% en células P4 puerta (citrino / ccélulas erulean-altos). En ausencia de transportadores de ácidos biliares, un porcentaje similar se observó en 30 M TCDCA células tratadas (Figura 4 A). En contraste, NucleoBAS de células co-expresando, PNCT y OSTαβ sí mostraron una mayor cantidad de citrino / células cerúleo-máximo de alrededor de 38%. Después de la adición de 10 mM GW4064, casi 90% de las células eran citrino / cerúleo-alta con independencia de expresión de OSTαβ o PNCT (Figura 4 B). Los datos pueden ser presentados en gráficos de barras (% de células en la puerta 4, de habitantes 4) (Figura 4 C, D) o como histogramas de población de relación citrino cerúleo (Figura 4 E, F).
Figura 1. Diseño del Sensor de ácidos biliares (BAS). (A) la representación estructural del modo de acción de un Bile Acid Sensor codificado genéticamente. Se compone de un fluoróforo donante (cerúleo) y un fluoróforo aceptor (citrino) unido a través de la FXR-LBD y fusionado a un péptido FXR-cofactor (motivo LXXLL). (B) de la arquitectura de dominio esquemática de los BAS. Las mutaciones fluoróforo / V224L Q204F promueven la formación de interacciones intramoleculares entre cerúleo y citrino. El constructo NucleoBAS contiene una señal de localización nuclear C-terminal (NLS) y por lo tanto se acumula en el núcleo, mientras que el constructo CytoBAS carece de cualquier secuencia de dirección y por lo tanto muestra la localización citosólica. (C) Representante basada en confocal experimento FRET con BAS como una herramienta para controlar el transporte de ácidos biliares conjugados. No se observa ningún cambio en la relación de citrino / cerúleo después del 30 M Además TCDCA en células sólo expressing NucleoBAS. Cuando se añadió 5 M GW4064, se observó un fuerte aumento de la proporción de citrino / cerúleo. (D) La importación de TCDCA (30 mM) da como resultado una activación considerable del sensor en las células cotransfectadas Ntcp y OSTαβ. El tratamiento posterior GW4064 (5 M) conduce a un aumento adicional de citrino relación / cerúleo. Los resultados se expresan como media ± DE, n = 6 celdas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2. FRET-BAS Localización constructo en las células vivas. Imágenes microscopio confocal de células U2OS transfectadas con CytoBAS (A) o NucleoBAS (B). (C) células U2OS co-transfected con NucleoBAS y PNCT-mKate2. La barra de escala representa 10 micras. (D - F) Series de tiempo de las células transfectadas NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV. (D) GW4064 activa FXR (aumento de la relación 525/450 nm), pero no TGR5. (E) TCDCA TGR5 activa en la membrana plasmática (disminución de la relación 525/450 nm), pero no es capaz de entrar en la célula para activar FXR en el núcleo. (F) CDCA activa TGR5 en la membrana plasmática, así como FXR en el núcleo (aumento de la proporción de 525/450 nm en el núcleo, la disminución en el citoplasma). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Citometría de flujo Paramete gatingrs. (A) El P 1 puerta en el SSC-A / FSC-Una ventana se utiliza para excluir las células muertas. (B) En el FSC-H / FSC-A de la ventana, la puerta P2 se dibuja para eliminar eventos doblete de análisis. (C) En el citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) ventana, NucleoBAS (y CytoBAS) células positivas se seleccionan (Puerta P3). (D) Por último, en el citrino (525/20 nm) / cerúleo (450/40 nm) de la ventana, la puerta P4 contiene citrino / células cerúleo-altas del experimento FACS. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
La Figura 4. Representante FACS experimento midiendo transporte de ácidos biliares mediante NucleoBAS. (A >, B) FACS-parcelas que muestran la cantidad de citrino / NucleoBAS-expresan cerúleo-altos de vida las células U2OS (A) y las células U2OS co-expresión de NucleoBAS, OSTαβ y PNCT (B) después del tratamiento con tampón de control (izquierda), 30 M TCDCA (medio) o 10 M GW4064 (derecha). (C, D) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de células citrino /-cerúleo alta después de 30 minutos de incubación con TCDCA o GW4064 en células U2OS expresan NucleoBAS y co-transfectadas con (D) o sin (C) OSTαβ y PNCT. (E, F) del histograma muestra la distribución de citrino relación / cerúleo en una población de células que expresan U2OS NucleoBAS con o sin OSTαβ y PNCT después de 30 minutos de incubación con TCDCA (amarillo), GW4064 (rojo) o tampón de control (azul). Todas las condiciones se midieron tres veces. Las barras representan valores medios + desviación estándar (SD) (n = 3).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Archivo Suplementario 2:. Plantilla BAS Zeiss Leica importada de datos Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí se presenta un protocolo detallado para el uso de un nuevo codificado genéticamente sensor de ácido biliar capaz de monitorizar la dinámica espacio-temporales de transporte de ácidos biliares en las células vivas. Este biosensor consta de proteínas fluorescentes azul cerúleo y citrino que se fusionan a FXR LBD-, formando de este modo un sensor de ácido biliar basado en FRET (BAS).
El sensor de Bile Acid es relativamente simple y conveniente en uso al tener experiencia básica con cultivo celular y FACS o (confocal) microscopía. Sin embargo, algunos aspectos pueden requerir alguna solución de problemas. Cuando se utiliza el sensor de ácidos biliares en combinación con los transportadores de ácidos biliares, se recomienda a células de cultivo en medio con suero con filtro de carbón. Charcoal reduce aún más los niveles de ácidos biliares por adsorción a partir del suero. Especialmente en la presencia de importadores tales como PNCT, esto es crucial para evitar la saturación del sensor durante el cultivo, ya que esta es la causa más común de un sensor insensibledurante los experimentos. Por lo tanto, otro sensor se ha creado (NucleoBAS N354K / I372V) que contiene mutaciones que alteran la sensibilidad para ácidos biliares, la creación de un rango dinámico más grande 8. Para definir si el sensor ya está saturado, la relación citrino / cerúleo se puede comparar a la relación en células de control que no expresan ningún transportadores de ácidos biliares, puesto que se supone que esas células a tener bajos niveles de ácidos biliares intracelulares. Alternativamente, imágenes de microscopía de fluorescencia de vida (Flim) mediciones se puede realizar para investigar FRET de manera intensidad independiente 12. Esta técnica está más allá del alcance de este documento, y requiere un equipo más especializado. Otras razones para un sensor insensible incluyen el uso de células que son auto-fluorescente y / o han perdido NucleoBAS expresión. De nota, las fluctuaciones en la intensidad de la cerúleo y citrino (por ejemplo, debido a los cambios focales) durante el experimento pueden ocultar la visualización directa de los cambios de FRET durante la formación de imágenes, mientrasla naturaleza radiométrica del sensor todavía permite el monitoreo de la dinámica de ácidos biliares. A menudo, los cambios de intensidad absolutos son modestos para los fluoróforos individuales tras la adición de ligandos de FXR, mientras que el aumento de la relación es evidente.
Para el análisis FRET en las células transfectadas con el sensor de BAS, deben seleccionarse luz y filtros láser apropiado. El aumento de la intensidad de citrino durante FRET se tiene que medir con el láser diodo violeta (405 nm) con emisiones controladas sobre 450-520 (cerúleo) y 520 a 580 (citrino). Un aspecto importante a tener en cuenta es la sensibilidad del sensor a photobleaching. Cuando la intensidad de uno o ambos fluoróforos disminuye lentamente en el tiempo sin adición de ligandos, que a menudo indica photobleaching. Este fenómeno se produce principalmente cuando la potencia del láser es demasiado alto. Para evitar este efecto no deseado, la potencia de los láseres no debe exceder de 5% de la potencia total y las células tienen que mantenerse en la oscuridad tanto como sea posible. Limite eltiempo para la búsqueda de las células correctas. Las fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia también pueden ser causados por la deriva focal en el eje z. Para contrarrestar esto, el tamaño del agujero de alfiler se puede aumentar y es aconsejable para dibujar regiones de interés no muy cerca del perímetro de la célula.
El sensor de FRET para los ácidos biliares se ha probado en varios tipos de células (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK y células HEK293T) que pueden ser transfectadas y tienen un fenotipo estable. Sin embargo, las células primarias y diferenciadas tales como los hepatocitos son difíciles de transfectar y para mantener estable en términos de características. Transducción viral puede ayudar con células difíciles de transfectar (construir a petición). Actualmente estamos generando una línea de ratón para permitir el uso del sensor en células primarias recién aisladas que dedifferentiate rápidamente al aislamiento.
Para realizar el experimento descrito confocal, es imperativo que la línea celular seleccionada es adherente a una placa de cultivo y crece en un SIcapa de células ngle. Sin embargo, las células que crecen en suspensión, o células adherentes que se pueden tripsinizaron con bastante facilidad, también pueden ser medidos utilizando los FACS. Por último, se aconseja para seleccionar una línea celular sin transporte de ácidos biliares endógenos o síntesis en el análisis de una vía de transporte específico. Es decir, cuando se mide la actividad de ciertas (mutantes) proteínas transportadoras transfectadas.
El presentado codificado genéticamente BAS biosensor fluorescente es una valiosa herramienta para el monitoreo de transporte vivo sola ácido biliar celular. El BAS contiene un FXR-LBD que se activa por una gran variedad de ácidos biliares, lo que permite formación de imágenes de la dinámica subcelulares de los ácidos biliares 8. Esto da una gran ventaja en relación con el uso de otras técnicas. Por ejemplo, en ensayos de reportero de luciferasa promotor impulsado, la señal de luciferasa depende de la estabilidad del reportero en las células, no soporta la información subcelular, y requiere la destrucción de la muestra
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
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