Introduction
Ангиопластика является эндоваскулярная процедура, используемая для расширения суженных или закупоренной артерии результирующие от патологических состояний, таких как атеросклероз. Одним частым осложнением ангиопластики является послеоперационное гиперплазию неоинтимы, или рестеноза, который возникает вследствие хирургических ран и последующее воспаление индуцированных ремоделирования сосудов. Эти условия приводят к пролиферации сосудистых гладких клеток, а также несколько патофизиологических последствий 1-3. Гиперплазии неоинтимы повторно загустеет судно, и происходит в до 60% после ангиопластики больных в течение первого года. Таким образом, рестеноз является основным препятствием широкоиспользуемого ангиопластики процедуры 4. Хотя имплантация наркотиков элюирования стента может помочь предотвратить рестеноз, только отобранные кандидаты могут пройти эту процедуру дорогостоящей 5.
Оба животных и клинические исследования установили, что хроническое воспаление, порожденный vascuлар травмы и / или хирургической раны служит основным стимулом для после ангиопластики 2,4 роста неоинтимы. Крысиный сонных баллонного повреждения модели имитирует клиническую ситуацию и , следовательно , служит ценным модельной системы для выявления клеточных факторов , которые включают в ремоделирования сосудов и пролиферации клеток сосудов 6-9. Эта модель система также является очень полезным инструментом для оценки и / или экран для лекарственных препаратов и терапевтических реагентов , которые подавляют рост неоинтимы в доклинических исследованиях поступательных 10-14.
По сравнению с травмой мышиной модели сонную проволоки 15 , так и мышиный бедренную артерию проволочной модели повреждения 16, крыса сонная модель баллонного повреждения имеет преимущества быть достаточно большого размера для легкости хирургической процедуры , которая облегчает воспроизводимости нанесенного травмы. Это может обеспечить большее количество первичных клеток (например , клеток гладких мышц сосудов, эндотелиальные клетки) для AdditРациональная в пробирке исследования , чтобы очертить молекулярный механизм , регулирующий ремоделирования сосудов. Важно отметить, что по сравнению с мышами, крысы, как известно, является лучшей моделью для физиологических и токсикологических исследований 17. Хотя недостаток или ограничение крысиной модели является отсутствие генетически модифицированных и нокаут гена моделей, этот недостаток может быть преодолен за счет наличия геномной последовательности у крыс и недавнее развитие мощных геномных инструментов редактирования, таких как CRISPR-CAS технологии, оказывающее возможно манипулирование обширных диапазонов геномных последовательностей в различных модельных системах 18,19.
Хотя модель крысы воздушного шара травма была использована несколькими лабораториями и различных комплексных протоколов были опубликованы 20,21, этот протокол направлен на обеспечение более подробную информацию на предоперационного препаратов и может направлять исследователей новых к этой процедуре , чтобы настроить эту хирургической практике. Мы также подчеркиваем уход после операции Тон животных , что позволяет не только посмертные патологические и гистоморфологические анализ терапевтических эффектов на артериальной ремоделирования, но и УЗИ эхографические исследования в живых животных 13,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: использование крыс баллонной модели повреждения и связанных с ними процедур, включая инъекции рекомбинантных sRAGE и ультразвуковых исследований сонографическими были одобрены по уходу и использованию комитета животных (ACUC) Национального института по проблемам старения, NIH путем.
1. Предварительная подготовка хирургии
- Инструмент, хирургическая платформа, и средства индивидуальной защиты,.
- См Материалы и таблицы оборудования для всех хирургических инструментов и реагентов , используемых в этой процедуре. Автоклав все хирургические инструменты до начала хирургической процедуры.
Примечание: Для нескольких операций, выполняемых в тот же день, используйте предварительно нагретый стеклянный шарик стерилизатор для стерилизации инструментов между операциями. - Стерилизовать поверхность операционной платформы с 70% -ным спиртом. Нанести на хирургическом платье, волосяного покрова, хирургические маски, защитные очки и перчатки. Оставьте коробку стерилизованных перчаток рядом с хирургической платформой для дополнительного насе.
- См Материалы и таблицы оборудования для всех хирургических инструментов и реагентов , используемых в этой процедуре. Автоклав все хирургические инструменты до начала хирургической процедуры.
- Подготовка баллонным катетером.
- Наполните шприц емкостью 1 мл стерильной водой и прикрепить шприц к стерильной заполненной водой двухсторонним запорного крана. Аккуратно надавите воду через кран, чтобы заполнить часть Луера баллонного катетера, и удалить пузырьки воздуха из отверстия катетера.
- инфляция испытания на воздушном шаре, чтобы обеспечить воздушный шар может быть накачаны на 0,02 мл воды. Хранить наконечник баллона в контейнере стерилизованной воды до операции, чтобы избежать высыхание и загрязнения.
- Обезболивание и подготовка животных.
- Взвесьте самцов крыс Wistar (400-450 г) и проверьте тег уха, чтобы подтвердить ID. Поместите крысу в индукционной камере, затем включите испарителем и отрегулируйте изофлуран уровень до 3,5-4,0%, а уровень кислорода до 1,5-2,0 L. Проверьте глубину седации, проверяя педаль вывода рефлекс, такие как ущемление носок или хвост животного.
- После достижения анестезии (
- После достижения хирургического уровня анестезии, брить область вентральной шеи от подбородка до чуть выше грудины с машинки для стрижки волос животных и тампон выбритую кожу с чередованием в соотношении 1:10 разбавление повидон-йода и 70% этанола в 3 раза.
- Поместите офтальмологического раствора на открытые глаза животного с помощью ватного тампона, чтобы предотвратить их от высыхания. Смочить языка и ротовой полости животного с питьевой водой, чтобы избежать высыхания во время операции.
- Накройте крыса с стерильный хирургический лист и режут лист, чтобы выставить область шеи. Поместите животное в лежачем положении Oна площадку с подогревом на хирургической платформе с головой к хирургу. Закрепить конечности животного к хирургическому платформе с помощью ленты.
2. Хирургические процедуры
- Вскрытие и выделение артерии левую сонную
- Используйте скальпель, чтобы сделать прямой разрез ниже подбородка в направлении к хвосту весь путь до вершины грудины чуть выше грудной клетки. Используйте 7S пинцетом прямо препарировать слюнные железистой ткани под кожу, чтобы подвергать мышечный слой. Отдельные мышечные ткани, чтобы получить доступ к сонной и сосудистую систему блуждающего нерва в области шеи.
- Попросту рассекать ткани, окружающие сонную артерию, и осторожно отделить блуждающего нерва и сосудистой фасции, чтобы избежать каких-либо повреждений. Непрерывно рассекают до развилки сонной артерии, чтобы выставить внутренние и внешние ветви и общей сонной артерии вниз к грудине.
- Получение Arteriotмики
- Для втягивания и гемостаза, поместите лигатуры на наиболее проксимального участка на левой общей сонной артерии, а другой лигатуры на месте непосредственной дистальнее бифуркации.
- Поместите 4,0 шелковым швом на наружной сонной артерии, как далеко от развилки, насколько это возможно, чтобы убрать артерию к головке. Постоянно перевязать мелкие артерии, используя 4,0 шелковыми швами вдоль наружной сонной артерии, включая восходящей глоточной, затылочной и верхней щитовидной железы, чтобы избежать утечки артериальной.
- Поместите 4,0 шов шелковой нитью вокруг внутренней сонной артерии, чтобы избежать значительного ретроградную потери крови. Как правило, доступная длина внутренней ветви минимальна. Для визуализации внутренней сонной артерии, обнажить внутреннюю сонную артерию как можно больше, осторожно втягивая облегающего сонной артерии справа.
- Введение баллонным катетером
- Отвести проксимальный шов на общей сонной аrtery и поместите артериальный зажим на судне, чтобы временно остановить поток крови. Сделать небольшой (от 1/3 до 1/4 длины окружности артерии) разрез на наружной сонной артерии в месте, как дистально по отношению к шву, насколько это возможно.
- Аккуратно вставьте маркированного завышены баллонный катетер в разрез, а затем продвигать катетер в просвет близко к артериальной зажим на общей сонной артерии. Удалите зажим, и дальнейшее продвижение катетера-баллона в дуге аорты, примерно на 35-40 мм от разреза.
- Balloon Травма
- Вручную надуть катетер до объема 0,02 мл через прилагаемый шприц и затем зафиксировать запорного крана между шприцом и катетером. Медленно снять катетер с вращением. Когда катетер находится близко к arteriotomic разрез, выкачать воздушный шар. Продвигайте катетер обратно в исходное местоположение.
- Повторите 2.4.1 в течение всего 3 раза. Осторожно удалите катетер из просвета артерии.
- Close Up послеоперационной раны
- Закройте артериотомия с швами. Выпуск внутренней сонной артерии, чтобы восстановить кровоток. Проверьте наличие артериальной кровотечения или утечки. В случае возникновения кровотечения, применить кусок марли с немного давления, чтобы остановить кровотечение.
- Удалить остальную часть шовного материала и зажимов, используемых для процедуры. Закройте железистой ткани с 6,0 швами. Закройте кожу с швами кожи или раны клипов. Выключите изофлуран и оставить животное с чистым кислородом в течение нескольких минут.
3. Администрация Therapeutics, Анальгетики, Послеоперационный уход, и эвтаназия
- Администрация Therapeutics и анальгетиков.
- После операции вводят бупренорфин (0,03 мг / кг) внутримышечно. Вводят 5 мл подогретого стерильный физиологический раствор подкожно, чтобы компенсировать потерю крови во время операции. Вводят sRAGE (0,5 нг / г) (Therapeutics) в брюшину.
- Смочите глаза снова с ОрЬthalmic мазь. Поместите крысу на тепловой площадку и контролировать животное, пока он не восстановит полное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее.
- Вернуть крысу в клетку с чистым постельным бельем и принесите клетку обратно в виварий. Поместите специальную карточку наблюдения на клетке, чтобы предупредить курирующих ветеринаров и дворников.
- Послеоперационный Cleanup
- Помещенный используемый хирургический материал, включая прокладки, тампоны, иглы и др либо в мусорное ведро или специальный контейнер для утилизации. Лечить хирургии платформы и очистки хирургических инструментов.
- Уход за Послеоперационный
- Администрирование бупренорфин (0,03 мг / кг) два раза в день (ставка) в течение 48 ч период после операции. Монитор животных тесно в течение 48 ч период после операции по поводу общих признаков бедствия, таких как неподвижность, неспособность кормить, hutched осанки, взъерошенный мех и гримасы. Монитор намотанные условия для покраснение, отек, расхождение краев раны и инфекции.
ЗАМЕТКА:Дополнительные методы лечения могут быть назначены в соответствии с рекомендацией посещать ветеринара. - Удалить шов или ранить клипы в соответствии с рекомендацией посещать ветеринара.
- Администрирование бупренорфин (0,03 мг / кг) два раза в день (ставка) в течение 48 ч период после операции. Монитор животных тесно в течение 48 ч период после операции по поводу общих признаков бедствия, таких как неподвижность, неспособность кормить, hutched осанки, взъерошенный мех и гримасы. Монитор намотанные условия для покраснение, отек, расхождение краев раны и инфекции.
- эвтаназия
- Через две недели после операции, эвтаназии крыс изолировать сонных артерий для посмертного гисто-морфологического анализа 22. Поместите крысу в камеру, содержащую 5-20% изофлуран насыщенный воздухом в течение по меньшей мере 2 мин до полного прекращения дыхания. Проверьте смерть перед вскрытием органов и тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Через две недели после баллонного повреждения, крыса умерщвлены и Сонные артерии выделяют для гисто-морфологического анализа. Оба работают левой сонной артерии и неоперированного правой артерии являются кросс-секционного, обрабатываются и парафин. Образцы парафина затем дополнительно тонкие разрезаны, и окрашивали гематоксилин-эозином (H & E). Гисто-морфологического анализа выполняются с использованием цифровой системы анализа изображений. Детали урожая артерии и гисто-морфологического анализа были описаны 13,23. Баллон травмы вызвал неоинтимы рост, или утолщение стенки сосуда, если его не лечить (или вводили физиологический раствор в качестве плацебо), очевидно , как показано на рисунке 1В, по сравнению с неоперированной секции сосуда из той же крысы (рис 1А). Секция сосуд из терапевтического реагента крысы получили (в данном случае, sRAGE), который блокирует рост неоинтимы показал significantly уменьшенный утолщение стенки сосуда (рис 1C). Последствия травмы воздушного шара, а также терапевтическое лечение также может быть оценена в естественных условиях с помощью ультразвуковой сонографии 22, который хорошо сотрудничать с результатами гисто-морфологического анализа (рисунок 2). Детали для оценки эффективности и окна введения терапевтических sRAGE в модели баллонного повреждения у крыс, были описаны в предыдущих публикациях 13,22. Для оценки терапевтических реагентов, которые снижают или блокируют травмы вызывали стенки сосуда, ремоделирование группу крыс (п = 8-15) должны эксплуатироваться с целью получения статистически значимых выводов.
Рисунок 1:. Типичные результаты крысиной модели сонной травмы на воздушном шаре H & E окрашивание Carotid артерии поперечные сечения (А) секция артерия правую сонную неоперированных; (B) баллон травмирован и участок артерии левую сонную группе плацебо (стрелки указывают neotimal области); (C) баллон травмирован и sRAGE обработанной секции левой сонной артерии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Корреляция ультразвуковой эхографии и гистологии sRAGE (0,5 нг / г) обрабатывают сонных сосудов , показанные на график рассеяния данных из (а) люмена диаметра и толщины (В) стенки кровеносного сосуда через 2 недели после травмы (не-управляемый , ранения с sRAGE, и плацебо, N = 12 в каждой группе). (C) Представитель sonographiс и гистологические (100X) изображения. (Рисунок из ссылки 22 с разрешения издателя). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Там было два метода, используемые для надувания воздушного шара, чтобы произвести травмы, которая удаляет настенная эндотелий в сонной просвета артерии. Одним из них является , чтобы заполнить прилагаемый шприц с жидким 20, а другой , чтобы использовать давление воздуха 21. Мы предпочитаем использовать заполненный жидкостью шприц, так как точный объем жидкости (0,02 мл), будет использоваться для каждой процедуры. Это делает точную и воспроизводимую инфляцию воздушного шара, что привело к аналогичному уровню травматизма у каждого животного проходит процедуру. Использование жидкости в шприц действительно требует удаления пузырьков воздуха в жидкости. Это может быть достигнуто путем нажатия пузырьков из отверстия катетера. После удаления большинства пузырьков воздуха, любые остаточные, крошечных пузырьков воздуха будет рассеиваться в течение 1-2 ч. Мы полагаем, что исследователи делают предоперационного материалы готовы 1-2 часа до процедуры, а также проверить степень инфляции воздушного шара перед каждой индивидуальной операции, чтобы обеспечить APPROтаже инфляция.
Для операции хирург и его / ее помощник (ы) должны носить все необходимые механизмы защиты, включая маски, стерильные перчатки и хирургические халаты, чтобы защитить и животных и исследователей от инфекции. Важно , чтобы в полной мере использовать выращены самцов крыс с аналогичными массой тела (например , между 380-450 г) для обеспечения надлежащего размера сонной артерии для введения стандартной 2F Фогарти воздушный шар эмболэктомические катетер , используемый для этой процедуры. Перед операцией проверить уровень изофлуран в испарителе, чтобы обеспечить достаточное количество анестезирующего средства, которая покрывает всю операцию, и при необходимости пополнить испарителем перед каждым началом операции. Проверьте датчик давления кислородного бака для обеспечения достаточного количества кислорода для операции. Для обеспечения надлежащей глубины анестезии достигается, можно также контролировать частоту дыхания у крыс. Нормальная крыса имеет частота дыхания ~ 85 дыхания / мин; увеличение респираторного глубины и повторногогорловой ритм и уменьшение частоты дыхания означает хирургической анестезии.
Во время операции, анестезии необходимо постоянно контролироваться и поддерживаться путем проверки дыхания, педали рефлекс и реакцию животного к хирургическому раздражитель. Следует отметить, что хирург должен изменить перчатки, если его / ее руки коснуться нестерильные частей животного во время операции, такие как проверка педали рефлекс для предотвращения возможного загрязнения и инфекции. Кроме того, хирург и ассистент также следует внимательно следить за жизненно важные признаки животного во время операции, чтобы предотвратить передозировки анестезирующего препарата и быстро принимать корректирующие меры, чтобы предотвратить ситуацию, если это происходит путем выключения изофлуран и увеличить уровень кислорода до 100%. Признаки передозировки анестезирующего препарата включают медленные и неглубокие дыханий, а также слабый и нерегулярный пульс. Мы также предлагаем хорошую подготовку артериотомии до травмы воздушного шара, включая полное разделение сонной аrtery участки из прилегающих тканей. Это поможет избежать неожиданных кровотечений во время операции.
Животных под наркозом, в том числе и во время послеоперационной фазы восстановления, никогда не следует оставлять без присмотра. В качестве альтернативы регулярным бупренорфин (0,03 мг / кг) в течение торгов в 48 ч послеоперационный период, также может быть использован с замедленным высвобождением бупренорфин (бупренорфин SR). Инъекция бупренорфина SR (1,0-1,2 мг / кг) сразу же после операции будет охватывать послеоперационные период до 72 часов. В общем, послеоперационные осложнения не предвидится; но тщательная увещевательное практика обеспечивает благополучие животных и является политика институциональной ACUC.
Потому что это самое главное, чтобы воспроизвести тот же уровень баллонного повреждения в исследуемой группе животных (8-15), адекватных хирургических навыков и знакомство с процедурой, настоятельно рекомендуется. Для исследователей новых к этой процедуре, мы предлагаемпервый на практике всю процедуру, включая подготовку артериотомии, травмы баллона и закрытия раны на тушек крыс, которые могут быть доступны в институциональном вивария. Практикующий хирургической процедуры с ветеринарами или исследователей, знакомых с процедурой, также обеспечивает получение воспроизводимых и стабильных результатов баллонного повреждения.
На наш взгляд, наркотиков и / или терапии, опровергающих рост неоинтимы лучше всего вводить сразу после баллонного повреждения для того, чтобы компенсировать воспаление на ранней стадии. Некоторые реагенты, возможно, потребуется вводить непрерывно в течение последующих дней восстановления для достижения эффекта. Раннее вмешательство помогает блокировать или уменьшить последующего ремоделирования сосудистого 13,22,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 F Fogarty balloon embolectomy catheter | Edwards Lifesciences | ||
| Standard scalpel | Fine Science Tools | ||
| Small curved forceps (Large radius Dumont#7shanks curved) | Fine Science Tools | ||
| Large, medium and small micro-scissors | Roboz | ||
| Needles (20 G) | TycoHealthcare | ||
| Micro-surgery forceps with micro-blunted atraumatic tips | Fine Science Tools | ||
| Atraumatic straight small arterial clamps | Fine Science Tools | ||
| Retractor with maximum spread 5.5 cm long blunt teeth | Fine Science Tools | ||
| Silk suture (4.0 and 6.0 ) | Fine Science Tools | ||
| Syringe (1.0 ml) | BD | ||
| Curity gauze sponges | AllegroMedical | ||
| Cotton tip applicators sterile and non-sterile | Puritan Medical Products | ||
| Compact hot bead sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | ||
| ADS200 anesthesia system/ventilator | Paragon Medical | ||
| Isoflurane (forane), liquid form | Baxter | ||
| Sodium chloride 0.9% (Saline) | Hospira | ||
| Buprenex (buprenorphine) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | ||
| 70% alcohol | Fisher | ||
| 1:10 Betadine | Fisher |
References
- Chaabane, C., Otsuka, F., Virmani, R., Bochaton-Piallat, M. L.
- Goel, S. A., Guo, L. W., Liu, B., Kent, K. C.
- Khan, R., Agrotis, A., Bobik, A. Understanding the role of transforming growth factor-beta1 in intimal thickening after vascular injury. Cardiovasc Res. 74, 223-234 (2007).
- Schillinger, M., Minar, E. Restenosis after percutaneous angioplasty: the role of vascular inflammation. Vasc Health Risk Manag. 1, 73-78 (2005).
- Katz, G., Harchandani, B., Shah, B. Drug-eluting stents: the past, present, and future. Curr Atheroscler Rep. 17, 485 (2015).
- Jain, M., Singh, A., Singh, V., Barthwal, M. K. Involvement of Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase-1 in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Neointimal Formation After Rat Carotid Injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2015).
- Lee, K. P., et al. Carvacrol inhibits atherosclerotic neointima formation by downregulating reactive oxygen species production in vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 240, 367-373 (2015).
- Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101 (12), 1362-1365 (2000).
- Noda, T., et al. New endoplasmic reticulum stress regulator, gipie, regulates the survival of vascular smooth muscle cells and the neointima formation after vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (5), 1246-1253 (2015).
- Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).
- Guo, J., et al. p55gamma functional mimetic peptide N24 blocks vascular proliferative disorders. J Mol Med (Berl). , (2015).
- Oh, C. J., et al. Dimethylfumarate attenuates restenosis after acute vascular injury by cell-specific and Nrf2-dependent mechanisms. Redox Biol. 2, 855-864 (2014).
- Tae, H. J., et al. The N-glycoform of sRAGE is the key determinant for its therapeutic efficacy to attenuate injury-elicited arterial inflammation and neointimal growth. J Mol Med (Berl. 91 (12), 1369-1381 (2013).
- Zhou, Z., et al. Receptor for AGE (RAGE) mediates neointimal formation in response to arterial injury. Circulation. 107 (17), 2238-2243 (2003).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Le, V., Johnson, C. G., Lee, J. D., Baker, A. B. Murine model of femoral artery wire injury with implantation of a perivascular drug delivery patch. J Vis Exp. (96), e52403 (2015).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J.
- Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods Mol Med. 139, 1-30 (2007).
- Zhang, W., Trebak, M. Vascular balloon injury and intraluminal administration in rat carotid artery. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tae, H. J., et al. Vessel ultrasound sonographic assessment of soluble receptor for advanced glycation end products efficacy in a rat balloon injury model. Curr Ther Res Clin Exp. 76, 110-115 (2014).
- Tae, H. J., et al. Chronic treatment with a broad-spectrum metalloproteinase inhibitor, doxycycline, prevents the development of spontaneous aortic lesions in a mouse model of vascular Ehlers-Danlos syndrome. J Pharmacol Exp Ther. 343 (1), 246-251 (2012).
- Sakaguchi, T., et al. Central role of RAGE-dependent neointimal expansion in arterial restenosis. J Clin Invest. 111 (7), 959-972 (2003).
