Introduction
A angioplastia é um procedimento endovascular utilizado para alargar as artérias estreitadas ou obstruídas resultantes de condições patológicas tais como a aterosclerose. Uma complicação comum da angioplastia é a hiperplasia neointimal pós-operacional, ou a restenose, que ocorre devido a lesões cirúrgicas e subsequente remodelação vascular induzida por inflamação. Estas condições conduzem à proliferação de células lisas vasculares, e várias consequências fisiopatológicas 1-3. Hiperplasia neointimal re-engrossa o navio, e ocorre em até 60% dos pacientes pós-angioplastia no primeiro ano. Portanto, a restenose é um grande revés do procedimento de angioplastia amplamente utilizado 4. Embora a implantação do stent droga-eluição pode ajudar a prevenir reestenose, os candidatos selecionados apenas pode submeter a esse procedimento caro 5.
Ambos os estudos animais e clínicos têm demonstrado que a inflamação crónica gerado por vasculesão lar e / ou ferida cirúrgica serve como o principal estímulo para 2,4 crescimento neointimal pós-angioplastia. As carótidas de ratos lesão por balão modelo mimetiza a situação clínica e, portanto, serve como um sistema modelo útil para identificar factores celulares que envolvem na remodelação vascular e proliferação de células vasculares 6-9. Este sistema modelo também é uma ferramenta muito útil para avaliar e / ou tela de medicamentos e reagentes terapêuticos que suprimem o crescimento neointimal em estudos translacionais pré-clínicos 10-14.
Em comparação com o modelo de murino de arame carótida ferimento 15 e o fio artéria femoral modelo de lesão de murino 16, o modelo de lesão carótida em ratos de balão tem as vantagens de ser suficientemente grande em tamanho para a facilidade de procedimento cirúrgico que facilita a reprodutibilidade da lesão infligida. Ele pode fornecer um maior número de células primárias (por exemplo, células do músculo liso vascular, células endoteliais) para additional estudos in vitro para delinear o mecanismo molecular que regula a remodelação vascular. Importante, em comparação com os ratinhos, os ratos são também conhecidos como sendo um melhor modelo para estudos fisiológicos e toxicológicos 17. Embora uma desvantagem ou limitação do modelo de rato, é a falta de modelos genéticos modificados e knockout de genes, esta desvantagem pode ser superada pela disponibilidade da sequência genómica de rato e o desenvolvimento recente de poderosas ferramentas de edição genómicas, tais como tecnologia CRISPR-CAS que torna possível manipulação de vastas faixas de seqüências genômicas em diferentes sistemas modelo 18,19.
Embora o modelo de lesão por balão de rato foi utilizado por vários laboratórios e vários protocolos completos foram publicados 20,21, este protocolo visa fornecer mais detalhes em preparações pré-cirurgia e pode orientar investigadores novos para este procedimento para configurar esta prática cirúrgica. Ressaltamos, ainda, o cuidado pós-operatório de tele animais que não permite apenas análises post-mortem patológicos e histomorfológicas dos efeitos terapêuticos sobre o remodelamento arterial, mas também estudos de ultra-som ultra-sonográficos de animais vivos 13,22.
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Protocol
NOTA: o uso do modelo de lesão por balão rato e procedimentos associados, incluindo injeção de estudos ultra-sonográficos sRAGE e ultra-som recombinantes foram aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso (ACUC) do Instituto Nacional sobre Envelhecimento, NIH.
1. Preparações Pré-cirurgia
- Instrumento, Plataforma cirúrgica e Equipamentos de Proteção Individual.
- Ver Materiais e Equipamento da Tabela para todos os instrumentos cirúrgicos e os reagentes utilizados neste procedimento. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico.
NOTA: Para várias operações realizadas no mesmo dia, usar um esterilizador com esferas de vidro pré-aquecida para esterilizar instrumentos entre as cirurgias. - Esterilizar a superfície da plataforma operacional com álcool a 70%. Coloque em vestido cirúrgico, tampa de cabelo, máscara cirúrgica, óculos de segurança e luvas. Deixe uma caixa de luvas esterilizadas perto da plataforma cirúrgica para nós adicionaise.
- Ver Materiais e Equipamento da Tabela para todos os instrumentos cirúrgicos e os reagentes utilizados neste procedimento. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes do procedimento cirúrgico.
- Preparação do cateter de balão.
- Encher seringa de 1 ml com água estéril e anexar a seringa a uma de duas vias torneira cheio de água estéril. Suavemente empurrar a água através da torneira de passagem para preencher a parte Luer-lock do cateter de balão, e remover as bolhas de ar a partir da abertura do cateter.
- a insuflação do balão de teste para assegurar que o balão pode ser insuflado por 0,02 ml de água. Armazenar a ponta do balão em um recipiente de água esterilizada antes da cirurgia, para evitar a dessecação e a contaminação.
- Anestesia e Preparação Animal.
- Pesar ratos Wistar machos (400-450 g) e verifique a etiqueta de orelha para confirmar a identificação. Coloque o rato em uma câmara de indução, em seguida, ligar o vaporizador e ajustar o nível de isoflurano para 3,5-4,0% eo nível de oxigênio para 1,5-2,0 L. verificar a profundidade de sedação, verificando pedal retirada reflexa, como beliscar o dedo do pé ou a cauda do animal.
- Depois de atingir a anestesia (
- Depois de atingir o nível cirúrgico de anestesia, raspar a região do pescoço ventral a partir do queixo para baixo para um pouco acima do esterno com cabelo clippers animais e limpe a pele raspada com a alternância de diluição de 1:10 de iodopovidona e 70% de etanol 3 vezes.
- Colocar em solução oftálmica os olhos abertos do animal com um cotonete de algodão para impedir que sequem. Umedeça a língua e da boca do animal com água potável para evitar a secagem durante a operação.
- Cobrir o rato com uma folha cirúrgico estéril e cortar a folha para expor a região do pescoço. Colocar o animal em decúbito dorsal ona aquecida almofada na plataforma cirúrgica com a cabeça para o cirurgião. Corrigir os membros do animal para a plataforma cirúrgica usando fita.
2. Procedimentos Cirúrgicos
- A dissecção e isolamento da artéria carótida esquerda
- Usar um bisturi para fazer uma incisão linear abaixo do queixo na direcção do cauda todo o caminho para a parte superior do esterno logo acima da caixa torácica. Use uma pinça 7S para dissecar sem rodeios os tecidos glândulas salivares sob a pele para expor a camada muscular. tecidos musculares separados para obter acesso a vasculatura da carótida e do nervo vago na região do pescoço.
- Sem rodeios dissecar tecidos circundantes da artéria carótida, e cuidadosamente separar o nervo vago e fáscia vascular para evitar qualquer dano. Continuamente dissecar até à bifurcação da artéria carótida para expor os ramos interno e externo e a artéria carótida comum até ao esterno.
- Preparação de Arterioto meu
- Para a retracção e a hemostasia, colocar uma ligadura no local mais proximal na artéria carótida comum esquerda, e outra ligadura no local distai imediato à bifurcação.
- Coloque uma sutura 4,0 de seda para a artéria carótida externa, na medida do possível bifurcação da artéria para retrair na direcção da cabeça. Permanentemente ligar pequenas artérias utilizando 4,0 suturas de seda ao longo da artéria carótida externa, incluindo da faringe ascendente, o occipital eo superior da tireóide para evitar vazamento arterial.
- Coloque uma sutura 4,0 de seda em torno da artéria carótida interna a fim de evitar uma perda de sangue significativa retrógrada. Normalmente, o comprimento disponível do ramo interno é mínima. Para a visualização da artéria carótida interna, expor a artéria carótida interna, tanto quanto possível, retraindo suavemente a artéria carótida sobrejacente à direita.
- Introdução do cateter balão
- Retrair a sutura proximal na carótida comum umrtery e colocar uma pinça arterial na embarcação para interromper temporariamente o fluxo de sangue. Adicione uma pequena (1/3 a 1/4 da circunferência da artéria) incisão na artéria carótida externa em um local como distai para o fio de sutura quanto possível.
- Delicadamente inserir um cateter balão un-inflado dentro da incisão e, em seguida, avançar o cateter no lúmen próximo da braçadeira arterial na artéria carótida comum. Remover o grampo, e avançar o cateter de balão para o arco aórtico, de aproximadamente 35-40 mm a partir da incisão.
- lesão por balão
- inflar manualmente o cateter para um volume de 0,02 ml através da seringa ligada e, em seguida, fechar a torneira de passagem entre a seringa e o cateter. Lentamente, retirar o cateter com rotações. Quando o cateter está perto da incisão arteriotomic, esvaziar o balão. Avançar o cateter de volta ao local original.
- Repita 2.4.1 para um total de 3 vezes. Remova cuidadosamente o cateter do lúmen da artéria.
- Feche acima da ferida cirúrgica
- Feche a arteriotomia com suturas. Solte a artéria carótida interna para restaurar o fluxo de sangue. Verifique se há sangramento arterial ou vazar. Se ocorre sangramento, aplicar um pedaço de gaze com um pouco de pressão para interromper a hemorragia.
- Retire o apoio de suturas e grampos utilizados para o procedimento. Feche o tecido glandular com 6,0 suturas. Feche a pele com suturas ou agrafos. Desligue o isoflurano e deixar o animal com oxigênio puro para alguns min.
3. A administração de Therapeutics, Analgésicos, cuidados pós-cirurgia e eutanásia
- A administração de Therapeutics e analgésicos.
- Após a cirurgia, injectar buprenorfina (0,03 mg / kg) por via intramuscular. Injectar 5 ml pré-aquecido por via subcutânea, solução salina estéril para compensar a perda de sangue durante a cirurgia. Injectar sRAGE (0,5 ng / g) (terapêutica) no peritoneu.
- Umedecer os olhos novamente com ophpomada thalmic. Coloque o rato sobre a almofada de calor e monitorar o animal até que ele recupera a consciência completa para manter decúbito esternal.
- Devolver o rato a uma gaiola com roupa de cama limpa e trazer a gaiola de volta para o biotério. Coloque um cartão de observação especial sobre a gaiola para alertar os veterinários presentes e cuidadores.
- Limpeza pós-cirúrgica
- Coloque material cirúrgico utilizado, incluindo almofadas, cotonetes, agulhas et al, quer para o lixo ou um recipiente especial disposição. Desinfectar a plataforma de cirurgia e limpar os instrumentos cirúrgicos.
- Cuidados pós-cirúrgica
- Administrar buprenorfina (0,03 mg / kg) duas vezes ao dia (bid), durante o período pós-operatório de 48 horas. Monitorar o animal de perto durante o período pós-operatório de 48 horas para os sinais comuns de estresse, tais como a imobilidade, a incapacidade para se alimentar, postura hutched, pele arrepiou, e careta. Monitorar o estado da ferida para vermelhidão, inchaço, deiscência, e infecções.
NOTA:Tratamentos adicionais podem ser prescritos de acordo com a assistir a recomendação do médico veterinário. - Retirar a sutura ou grampos de sutura de acordo com a assistir a recomendação do médico veterinário.
- Administrar buprenorfina (0,03 mg / kg) duas vezes ao dia (bid), durante o período pós-operatório de 48 horas. Monitorar o animal de perto durante o período pós-operatório de 48 horas para os sinais comuns de estresse, tais como a imobilidade, a incapacidade para se alimentar, postura hutched, pele arrepiou, e careta. Monitorar o estado da ferida para vermelhidão, inchaço, deiscência, e infecções.
- Eutanásia
- Duas semanas após a cirurgia, a eutanásia os ratos para isolar as artérias carótidas para post-mortem histo-análise morfológica 22. Colocar o rato numa câmara que contém 5-20% de isoflurano ar saturado por pelo menos 2 min até a cessação completa da respiração. Verifique a morte antes da dissecação dos órgãos e tecidos.
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Representative Results
Duas semanas após a lesão por balão, o rato é sacrificado e as artérias carótidas são isoladas para análise histo-morfológica. Ambos operados artéria carótida esquerda e artéria direita un-operado são cortados transversalmente, processados e embebidos em parafina. As amostras são, em seguida, parafina mais fina-seccionados e corados com hematoxilina-eosina (H & E). análises Histo-morfológicas são realizadas utilizando um sistema de análise de imagem digital. Os detalhes da artéria colheita e análise histo-morfológicas foram descritos 13,23. O balão de lesão-provocou o crescimento da neointima, ou o espessamento da parede do vaso, se deixados sem tratamento (ou tratadas com solução salina como o placebo), é evidente como se mostra na Figura 1B, em comparação com a secção vaso não operado a partir do mesmo rato (Figura 1A). A secção do vaso do reagente terapêutico rato recebeu (neste caso, sRAGE) que bloqueia o crescimento da neointima mostrou signifvamente reduziu o espessamento da parede do vaso (Figura 1C). Os efeitos da lesão provocada pelo balão, bem como o tratamento terapêutico pode também ser avaliada in vivo utilizando ecografia ultra-sons 22, que colaboram bem com os resultados da análise histo-morfológicas (Figura 2). Os detalhes para a avaliação da eficácia e da janela de administração de sRAGE terapêutico no modelo de lesão por balão de rato foram descritos em publicações anteriores 13,22. Para avaliar reagentes terapêuticos que reduzem ou bloqueiam a remodelação da parede dos vasos provocada por lesões, um grupo de ratos (n = 8-15) estão a ser exploradas de forma a obter conclusões estatisticamente significativas.
Figura 1:. Os resultados representativos do modelo de lesão carótida em ratos balão de H & E coloração do Carotid artérias transversais (A) a secção da artéria não operado carótida direita; (B) o balão de feridas e a secção da artéria carótida esquerda tratado com placebo (setas indicam as áreas neotimal); (C) o balão feridos e sRAGE tratados seção artéria carótida esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Correlação da ecografia ultra-som e histologia sRAGE (0,5 ng / g) tratada vasos carótidas mostrados no diagrama de dispersão dos dados de (A) lúmen espessura diâmetro e (B) da parede do vaso a 2 semanas após a lesão (o não operado , feridas com sRAGE, e tratado com placebo, n = 12 para cada grupo). (C) sonographi representativasc e imagens histológicas (100x). (Figura de referência 22, com a permissão do editor). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Houve dois métodos utilizados para insuflar o balão, de modo a gerar a lesão que remove o endotélio mural no lúmen da carótida arteriais. Um é para encher a seringa ligada com o líquido 20, e a outra é a utilização de pressão de ar 21. Nós preferimos usar uma seringa cheia de líquido, porque o volume de líquido exacto (0,02 ml) será usado para cada procedimento. Isto rende uma inflação preciso e reprodutível do balão, o que leva a um nível semelhante de lesões em cada animal submetido a procedimento. Usando o líquido na seringa, de facto requer a remoção de bolhas de ar no líquido. Isto pode ser conseguido empurrando as bolhas para fora a partir da abertura do cateter. Depois de retirar a maioria das bolhas de ar, alguns, pequenas bolhas de ar residuais irá se dissipar em 1-2 horas. Nós sugerimos que os pesquisadores fazem materiais pré-cirurgia pronto 1-2 horas antes do procedimento, e verificar o grau de insuflação do balão antes de cada cirurgia individual para garantir a approinflação disso.
Para a cirurgia, o cirurgião e seu / sua assistente (s) devem usar todas as engrenagens de proteção necessárias, incluindo máscaras, luvas estéreis e batas cirúrgicas para proteger os animais e os pesquisadores da infecção. É importante utilizar totalmente crescidas, ratos machos com pesos corporais semelhantes (por exemplo, entre 380-450 g) para assegurar o tamanho adequado da artéria carótida para a introdução do cateter de embolectomia 2F padrão balão Fogarty usado para este procedimento. Antes da cirurgia, verifique o nível de isoflurano no vaporizador para assegurar uma quantidade suficiente do anestésico que cobre toda a cirurgia, e volte a encher o vaporizador se necessário, antes de cada cirurgia começa. Verifique o medidor de pressão do tanque de oxigênio para garantir oxigênio suficiente para a cirurgia. Para assegurar uma profundidade adequada da anestesia é atingido, pode-se também controlar a taxa respiratória do rato. Um rato normal tem uma taxa respiratória de ~ 85 respiração / min; um aumento na profundidade respiratória e reritmo gular, e uma diminuição na taxa respiratória significa anestesia cirúrgica.
Durante a cirurgia, anestesia deve ser continuamente monitorizada e mantida através da verificação da respiração, reflexo do pedal, e a resposta do animal ao estímulo cirúrgico. De nota, o cirurgião deve mudar luvas se seus / suas mãos tocam partes não estéreis do animal durante a cirurgia como a verificação pedal reflexo para evitar a contaminação potencial e infecção. Além disso, o cirurgião eo assistente também devem acompanhar atentamente os sinais vitais do animal durante a operação para evitar a overdose de anestésico e tomar ações corretivas rápidas para evitar a situação se ocorrer desligando o isoflurano e aumentar o nível de oxigênio a 100%. Os sinais de overdose de anestésico incluem respiração lenta e superficial e pulso fraco e irregular. Sugerimos também uma boa preparação de arteriotomia antes da lesão por balão, incluindo uma separação completa da carótida umseções rtery de seus tecidos adjacentes. Isso ajudará a evitar hemorragias inesperadas durante a operação.
O animal sob anestesia, inclusive durante a fase de recuperação pós-cirúrgica, nunca deve ser deixado sem vigilância. Como uma alternativa para a buprenorfina regulares (0,03 mg / kg BID) durante o período pós-operatório de 48 horas, a buprenorfina de libertação sustentada (buprenorfina SR) também pode ser usado. A injecção de SR buprenorfina (1,0-1,2 mg / kg) imediatamente após a cirurgia irá cobrir o período pós-cirúrgico até 72 horas. Em geral, as complicações pós-cirúrgicas não são antecipados; mas uma prática cuidadosa monitory garante o bem-estar dos animais e é uma política pela ACUC institucional.
Porque é mais importante para reproduzir o mesmo nível da lesão por balão no grupo de estudo de animais (8-15), habilidades cirúrgicas adequadas e familiaridade com o procedimento são altamente recomendados. Para os pesquisadores novos a este procedimento, sugerimosprimeiro a praticar todo o procedimento, incluindo a preparação de arteriotomia, a lesão por balão eo fechamento da ferida em carcaças de ratos que podem estar disponíveis no biotério institucional. Praticando o procedimento cirúrgico com veterinários ou pesquisadores familiarizados com o procedimento também garante a obtenção de resultados lesão por balão reprodutíveis e consistentes.
Em nossa opinião, drogas e / ou terapêutica que negam o crescimento neointimal estão melhor administrado imediatamente após a lesão por balão, a fim de compensar a inflamação no estágio inicial. Alguns reagentes podem ter de ser administrado continuamente durante os dias subsequentes de recuperação para conseguir o efeito. Uma intervenção precoce ajuda para bloquear ou reduzir o que se seguiu 13,22,24 remodelação vascular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 F Fogarty balloon embolectomy catheter | Edwards Lifesciences | ||
| Standard scalpel | Fine Science Tools | ||
| Small curved forceps (Large radius Dumont#7shanks curved) | Fine Science Tools | ||
| Large, medium and small micro-scissors | Roboz | ||
| Needles (20 G) | TycoHealthcare | ||
| Micro-surgery forceps with micro-blunted atraumatic tips | Fine Science Tools | ||
| Atraumatic straight small arterial clamps | Fine Science Tools | ||
| Retractor with maximum spread 5.5 cm long blunt teeth | Fine Science Tools | ||
| Silk suture (4.0 and 6.0 ) | Fine Science Tools | ||
| Syringe (1.0 ml) | BD | ||
| Curity gauze sponges | AllegroMedical | ||
| Cotton tip applicators sterile and non-sterile | Puritan Medical Products | ||
| Compact hot bead sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | ||
| ADS200 anesthesia system/ventilator | Paragon Medical | ||
| Isoflurane (forane), liquid form | Baxter | ||
| Sodium chloride 0.9% (Saline) | Hospira | ||
| Buprenex (buprenorphine) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | ||
| 70% alcohol | Fisher | ||
| 1:10 Betadine | Fisher |
References
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