Introduction
Angioplastik en endovaskulär procedur som används för att vidga förträngda eller blockerade artärer resulterande från patologiska tillstånd såsom ateroskleros. En vanlig komplikation av angioplastik är postoperativ neointimal hyperplasi, eller restenos, som inträffar på grund av kirurgiska skador och efterföljande inflammation vaskulär remodellering. Dessa förhållanden leder till proliferation av vaskulära glatta celler, och flera patofysiologiska konsekvenser 1-3. Neointimal hyperplasi åter tjocknar kärlet, och förekommer i upp till 60% efter angioplastik patienter inom det första året. Därför är restenos ett stort bakslag för den allmänt använda angioplastikproceduren fyra. Även om implantation av läkemedels elueringen stent kan bidra till att förhindra restenos, kan endast utvalda kandidater genomgå denna kostsam procedur 5.
Både djur och kliniska studier har visat att kronisk inflammation som genereras av Vascular skada och / eller kirurgiskt sår fungerar som huvud stimulans för ballongvidgning neointimal tillväxt 2,4. Råttan halsballongskada modell efterliknar den kliniska situationen och därför fungerar som en värdefull modell för att identifiera cellulära faktorer som involverar i kärlremodellering och vaskulär celltillväxt 6-9. Detta modellsystem är också ett mycket användbart verktyg för att utvärdera och / eller skärmen för droger och terapeutiska reagens som hämmar neointimal tillväxt i prekliniska translationella studier 10-14.
Jämfört med den murina carotid trådskada modellen 15 och den murina femoralartären trådskada modell 16, råtthalspulsådern ballongskada modellen har fördelarna av att vara tillräckligt stort i storlek för den lätthet av kirurgiskt ingrepp som underlättar reproducerbarheten för skada. Det kan ge ett större antal primära celler (t.ex. vaskulära glatta muskelceller, endotelceller) för Additional in vitro-studier för att beskriva den molekylära mekanismen som styr kärlremodellering. Viktigt, jämfört med möss, råttor är också kända för att vara en bättre modell för fysiologiska och toxikologiska studier 17. Även om en nackdel eller begränsning av råttmodellen är bristen på genetiska modifierade och gen-knockout-modeller, kan denna nackdel övervinnas genom tillgängligheten av råttans genomiska sekvensen och den senaste utvecklingen av kraftfulla genomiska redigeringsverktyg såsom crispr-CAS-teknik som gör eventuell manipulation av stora serier av genomiska sekvenser i olika modellsystem 18,19.
Även om råttballongskada modell har använts av flera laboratorier och olika omfattande protokoll har publicerats 20,21, syftar detta protokoll till att ge mer information vid pre-kirurgi preparat och kan vägleda forskare nya till denna procedur för att ställa upp denna kirurgisk praxis. Vi betonar även efter operationen hand om than djur som inte bara tillåter post mortem-patologiska och histomorphological analyser av de terapeutiska effekter på arteriell ombyggnad, men också ultraljud sonografisk studier i levande djur 13,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: användning av råttballongskada modell och därmed förbundna förfaranden, inklusive injektion av rekombinanta sRAGE och ultraljud sonografisk studier har godkänts av Animal Care och användning kommittén (ACUC) av National Institute on Aging, NIH.
1. Pre-kirurgi Förberedelser
- Instrument, kirurgiska plattform och personlig skyddsutrustning.
- Se Material och utrustning Table för alla kirurgiska instrument och reagenser som används i den här proceduren. Autoklav alla kirurgiska instrument före kirurgiskt ingrepp.
OBS: För flera operationer som utförs på samma dag, använd en förvärmd glaspärla autoklav för att sterilisera instrumenten mellan operationer. - Sterilisera ytan på operativ plattform med 70% alkohol. Sätt på operationsrock, hår täcka, kirurgisk mask, skyddsglasögon och handskar. Lämna en låda med steriliserade handskar nära den kirurgiska plattform för ytterligare osse.
- Se Material och utrustning Table för alla kirurgiska instrument och reagenser som används i den här proceduren. Autoklav alla kirurgiska instrument före kirurgiskt ingrepp.
- Framställning av ballongkatetern.
- Fyll en ml spruta med sterilt vatten och fäst sprutan till en steril vattenfylld tvåvägskranen. Tryck försiktigt vattnet genom kranen för att fylla luer-lock delen av ballongkatetem, och ta bort luftbubblor från öppningen av katetern.
- Test ballong inflation att säkerställa ballongen kan blåsas upp med 0,02 ml vatten. Lagra spetsen på ballongen i en behållare med steriliserat vatten innan operationen för att undvika uttorkning och kontamination.
- Anestesi och djur Förberedelse.
- Väg Wistar-hanråttor (400-450 g) och kontrollera öronmärke för att bekräfta ID. Placera råttan i en induktionskammare, sedan slå på förångaren och justera isofluran nivå till 3,5-4,0% och syrenivån till 1,5-2,0 L. Kontrollera sedationsdjupet genom att kontrollera pedal tillbakadragande reflex såsom nypa tån eller svans av djuret.
- Efter att ha nått anestesi (
- Efter att ha nått den kirurgiska nivå av anestesi, raka ventrala halsområdet från hakan ner till strax ovanför bröstbenet med djurhårklippningsmaskiner och torka den rakade huden med omväxlande 1:10 utspädning av povidon-jod och 70% etanol 3 gånger.
- Placera oftalmisk lösning på de öppna ögon djuret med en bomullspinne för att förhindra dem från uttorkning. Fukta tungan och munnen på djuret med dricksvatten för att undvika uttorkning under operationen.
- Täck råttan med en steril kirurgisk ark och skär arket för att exponera halsområdet. Placera djuret i ryggläge ona värms pad på kirurgisk plattform med huvudet mot kirurgen. Fäst benen av djuret till operations plattform med tejp.
2. kirurgiska ingrepp
- Dissekering och isolering av den vänstra karotidartären
- Använda en skalpell för att göra ett rakt snitt under hakan i en riktning mot svansen hela vägen till toppen av bröstbenet alldeles ovanför bröstkorgen. Använd en 7S pincett för att rakt på sak dissekera spottkörtelvävnader under huden för att exponera muskelskiktet. Separata muskler för att få tillgång till halskärl och vagusnerven i nackregionen.
- Rakt på sak dissekera vävnad som omger halspulsådern, och skilj försiktigt vagusnerven och kärl fascia för att undvika skador. Kontinuerligt dissekera tills halspulsådern bifurkationen för att exponera de inre och yttre grenar och den gemensamma halsartären ned till bröstbenet.
- Framställning av Arteriotnomi
- För indragning och hemostas, placera en ligatur på den mest proximala platsen till vänster gemensamma halspulsådern, och en annan ligatur på platsen omedelbart distalt bifurkation.
- Placera en 4,0 silkesutur vid den yttre karotidartären så långt från bifurkationen som möjligt för att dra tillbaka artären mot huvudet. Permanent ligera små artärer med hjälp av 4,0 silke suturer längs den yttre halspulsådern, inklusive stigande svalg, skallbenet och den överlägsna sköldkörteln att undvika arteriell läcka.
- Placera en 4,0 siden sutur runt den inre halspulsådern för att undvika en betydande bakåtsträvande blodförlust. Vanligtvis, är den tillgängliga längden av den inre grenen minimal. För att visualisera den inre halsartären, exponera den inre karotidartären så mycket som möjligt genom att försiktigt dra tillbaka det överliggande karotidartären till höger.
- Införandet av ballongkatetern
- Dra tillbaka den proximala sutur på den gemensamma hals enrtery och placera en arteriell klämma på fartyget för att tillfälligt stoppa blodflödet. Göra ett litet (1/3 till 1/4 av omkretsen av artären) snitt på den externa karotidartären vid en plats som är distal till suturen som möjligt.
- Försiktigt in en un-uppblåsta ballongkateter i snittet och sedan föra katetern i lumen nära artärklämman på den gemensamma halspulsådern. Ta bort klämman, och vidare mata fram ballongkatetem till aortabågen, approximativt 35-40 mm från snittet.
- balloon Injury
- blåsa manuellt katetern till en volym av 0,02 ml via den bifogade sprutan och sedan låser kranen mellan sprutan och katetern. Sakta dra katetern med rotationer. När katetern ligger nära den arteriotomic incision, tömma ballongen. Advance katetern tillbaka till den ursprungliga platsen.
- Upprepa 2.4.1 för totalt 3 gånger. Försiktigt bort katetern från artär lumen.
- Close Up operationssåret
- Stänga arteriotomin med suturer. Frigöra den inre halsartären för att återställa blodflödet. Kontrollera om arteriell blödning eller läckage. Om blödning uppstår, tillämpa en bit gasbinda med en bit tryck för att stoppa blödningen.
- Ta bort resten av suturer och klämmor som används för förfarandet. Stäng körtelvävnad med 6,0 suturer. Stäng huden med huden suturer eller sår klipp. Stänga av isofluran och lämna djuret med rent syre under några min.
3. Administration of Therapeutics, analgetika, efter kirurgi vård, och dödshjälp
- Administration av Therapeutics och analgetika.
- Efter operationen, injicera buprenorfin (0,03 mg / kg) intramuskulärt. Injicera 5 ml förvärmas steril saltlösning subkutant för att kompensera blodförlust under operationen. Injicera sRAGE (0,5 ng / g) (therapeutics) i bukhinnan.
- Fukta ögonen igen med ophthalmic salva. Placera råttan på värmedyna och övervaka djuret tills det återfår fullständig medvetandet att upprätthålla sternala VILA.
- Återgå råtta i en bur med rena sängkläder och föra buren tillbaka till terrariet. Placera en särskild observations kort på buren för att varna de deltagande veterinärer och fastighetsskötare.
- Efter operationen Cleanup
- Sätt använt kirurgiskt material inklusive kuddar, kompresser, nålar et al antingen i papperskorgen eller en speciell avfallsbehållaren. Desinficera kirurgi plattform och rengör kirurgiska instrument.
- Efter operationen Care
- Administrera buprenorfin (0,03 mg / kg) två gånger per dag (två gånger dagligen) under 48 h efter kirurgi perioden. Övervaka djuret noga under 48 timmar efter operationen period för de gemensamma tecken på stress såsom orörlighet, oförmåga att föda, hutched hållning, ruggig päls, och grimas. Övervaka lindade förutsättningar för rodnad, svullnad, sårruptur, och infektioner.
NOTERA:Ytterligare behandlingar kan förskrivas enligt behandlande veterinär rekommendation. - Ta bort sutur eller sår klipp enligt behandlande veterinär rekommendation.
- Administrera buprenorfin (0,03 mg / kg) två gånger per dag (två gånger dagligen) under 48 h efter kirurgi perioden. Övervaka djuret noga under 48 timmar efter operationen period för de gemensamma tecken på stress såsom orörlighet, oförmåga att föda, hutched hållning, ruggig päls, och grimas. Övervaka lindade förutsättningar för rodnad, svullnad, sårruptur, och infektioner.
- Dödshjälp
- Två veckor efter operationen, avliva råttorna att isolera halspulsåder för obduktion histo-morfologiska analyser 22. Placera råttan i en kammare som innehåller 5-20% isofluran mättad luft under minst 2 min tills fullständigt upphörande av andning. Kontrollera döden före dissektion av organ och vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två veckor efter ballongskada, råttan avlivas och halspulsåder isoleras för histo-morfologisk analys. Båda drivs vänstra halspulsådern och icke-opererad höger artär är tvärsnitt, bearbetas och paraffininbäddade. Paraffin prover är därefter ytterligare tunn sektionerad, och färgades med hematoxylin-eosin (H & E). Histo-morfologiska analyser utförs med hjälp av en digital bildanalys systemet. Detaljerna i artär skörd och histo-morfologisk analys har beskrivits 13,23. Den ballongskada-framkallade neointimal tillväxt, eller förtjockning av kärlväggen, om de lämnas obehandlade (eller behandlade med koksaltlösning som placebo), är uppenbar, såsom visas i figur 1B, jämfört med icke-operatör kärl sektion från samma råtta (Figur 1A). Avsnittet fartyg från råtta fick terapeutiska reagens (i det här fallet, sRAGE) som blockerar neointimal tillväxt visade Significantly minskad förtjockning av kärlväggen (Figur 1C). Effekterna av ballongskada samt terapeutisk behandling kan också utvärderas in vivo med hjälp av ultraljud ultraljud 22, som samarbetar väl med resultaten från histo-morfologisk analys (Figur 2). Detaljerna för utvärdering av effekten och administrationsfönstret terapeutisk sRAGE i råttballongskada modell har beskrivits i tidigare publikationer 13,22. För att utvärdera terapeutiska reagens som minskar eller blockerar skade framkallade kärlväggen ombyggnad, en grupp av råttor (n = 8-15) skall drivas i syfte att erhålla statistiskt meningsfulla slutsatser.
Figur 1:. Representativa resultat från råttans karotid ballongskada modell H & E-färgning av carotid artär tvärsnitt (A) den högra halspulsådern avsnitt icke-operatör; (B) ballongen skadad och placebobehandlade vänstra karotidartären sektion (pilarna indikerar de neotimal områden); (C) ballongen skadad och sRAGE-behandlade vänstra halspulsådern avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Korrelation av ultraljud ultraljud och histologi sRAGE (0,5 ng / g) behandlades hals kärl, som visas i spridningsdiagram av data från (A) lumen tjocklek diameter och (B) kärlväggen vid 2 veckor efter skada (den icke-operatör skadade med sRAGE, och placebobehandlade, n = 12 i varje grupp). (C) Representant sonographic och histologiska (100X) bilder. (Figur från referens 22, med tillstånd från förlaget). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har funnits två metoder som används för att blåsa upp ballongen för att generera den skada som tar bort väggmålning endotelet i halsartärlumen. En är att fylla den bifogade sprutan med vätska 20, och den andra är att använda lufttrycket 21. Vi föredrar att använda vätskefyllda sprutan eftersom den exakta vätskevolymen (0,02 ml) kommer att användas för varje förfarande. Detta gör en exakt och reproducerbar uppblåsning av ballongen, vilket leder till en liknande nivå av skada i varje djur som genomgår förfarandet. Använda vätskan i sprutan verkligen kräver avlägsnande av luftbubblor i vätskan. Detta kan uppnås genom att trycka ut bubblorna från öppningen av katetern. Efter att ha avlägsnat en majoritet av luftbubblor, kommer eventuella rest, små luftbubblor försvinna i 1-2 timmar. Vi föreslår att forskare gör pre-kirurgi material redo 1-2 timmar före ingreppet, och kontrollera graden av ballonguppblåsnings före varje enskild operation för att säkerställa förekommandelämpligt inflation.
För kirurgi, måste kirurgen och hans / hennes assistent (er) bära alla nödvändiga skyddsåtgärder redskap inklusive ansiktsmasker, sterila handskar och operationsrockar för att skydda både djur och forskare från smitta. Det är viktigt att använda fullvuxna, hanråttor med liknande bodyweights (t.ex. mellan 380-450 g) för att säkerställa rätt storlek av halspulsådern för införandet av standarden 2F Fogarty ballong embolektomikateter används för detta förfarande. Före operationen, kontrollera nivån av isofluran i förångaren för att säkerställa tillräcklig mängd av bedövningsmedlet som täcker hela operationen, och fyll förångaren vid behov före varje operation startar. Kontrollera manometern av syretank för att säkerställa tillräckligt med syre för operationen. För att säkerställa en ordentlig anestesidjup har nåtts, kan en också övervaka andningsfrekvensen hos råttan. En normal råtta har en andningsfrekvens på ~ 85 andetag / min; en ökning av andnings djup och regular rytm, och en minskning i andningshastigheten betyder kirurgisk anestesi.
Under operationen, måste anestesi kontinuerligt övervakas och underhållas genom att kontrollera andning, pedal reflex, och svaret hos djuret till operations stimulans. Notera bör kirurgen byta handskar om hans / hennes händer röra osterila delar av djuret under operationen såsom kontroll pedal reflex för att förhindra eventuella föroreningar och infektion. Dessutom bör kirurgen och assistenten också noga övervaka vitala tecken på djuret under operationen för att förhindra bedövningsmedel överdos och vidta snabba korrigerande åtgärder för att avvärja situationen om det sker genom att stänga av isofluran och öka syrenivån till 100%. Tecken på bedövningsmedel överdos inkluderar långsamma och grunda andetag, och svag och oregelbunden puls. Vi föreslår också en bra förberedelse av arteriotomy före ballongskada inklusive en fullständig separation av hals enrtery avsnitt från deras angränsande vävnader. Detta kommer att bidra till att undvika oväntade blödningar under operationen.
Djuret under anestesi, även under den post-kirurgiska återhämtningsfasen, bör aldrig lämnas utan uppsikt. Som ett alternativ till den vanliga buprenorfin (0,03 mg / kg två gånger dagligen) under 48 h efter kirurgi perioden, kan fördröjd frisättning buprenorfin (buprenorfin SR) också användas. Injektion av buprenorfin SR (1,0-1,2 mg / kg) omedelbart efter operationen kommer att täcka den postoperativa perioden fram till 72 timmar. I allmänhet postkirurgiska komplikationer inte förväntat, men en noggrann monitory praktiken garanterar djurens välbefinnande och är en politik av den institutionella ACUC.
Eftersom det är mycket viktigt att återskapa samma nivå av ballongskada i studien grupp av djur (8-15), adekvata kirurgisk kompetens och förtrogenhet med förfarandet rekommenderas starkt. För forskare nya till detta förfarande, föreslår viförst att öva hela förfarandet inklusive utarbetande av arteriotomy, ballongskada och tillslutning av sår på råtta slaktkroppar som kan finnas tillgängliga i den institutionella djuranläggning. Öva det kirurgiska ingreppet med veterinärer och forskare bekanta med förfarandet säkerställer också att få reproducerbara och konsekventa ballongskada resultat.
Enligt vår uppfattning, droger och / eller läkemedel som upphäver neointimal tillväxt bäst administreras omedelbart efter ballongskada i syfte att kompensera inflammationen på ett tidigt stadium. Vissa reagenser kan behöva administreras kontinuerligt under de efterföljande dagars återhämtning för att uppnå effekten. En tidig intervention hjälper till att blockera eller minska den efterföljande kärlremodellering 13,22,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 F Fogarty balloon embolectomy catheter | Edwards Lifesciences | ||
| Standard scalpel | Fine Science Tools | ||
| Small curved forceps (Large radius Dumont#7shanks curved) | Fine Science Tools | ||
| Large, medium and small micro-scissors | Roboz | ||
| Needles (20 G) | TycoHealthcare | ||
| Micro-surgery forceps with micro-blunted atraumatic tips | Fine Science Tools | ||
| Atraumatic straight small arterial clamps | Fine Science Tools | ||
| Retractor with maximum spread 5.5 cm long blunt teeth | Fine Science Tools | ||
| Silk suture (4.0 and 6.0 ) | Fine Science Tools | ||
| Syringe (1.0 ml) | BD | ||
| Curity gauze sponges | AllegroMedical | ||
| Cotton tip applicators sterile and non-sterile | Puritan Medical Products | ||
| Compact hot bead sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | ||
| ADS200 anesthesia system/ventilator | Paragon Medical | ||
| Isoflurane (forane), liquid form | Baxter | ||
| Sodium chloride 0.9% (Saline) | Hospira | ||
| Buprenex (buprenorphine) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | ||
| 70% alcohol | Fisher | ||
| 1:10 Betadine | Fisher |
References
- Chaabane, C., Otsuka, F., Virmani, R., Bochaton-Piallat, M. L.
- Goel, S. A., Guo, L. W., Liu, B., Kent, K. C.
- Khan, R., Agrotis, A., Bobik, A. Understanding the role of transforming growth factor-beta1 in intimal thickening after vascular injury. Cardiovasc Res. 74, 223-234 (2007).
- Schillinger, M., Minar, E. Restenosis after percutaneous angioplasty: the role of vascular inflammation. Vasc Health Risk Manag. 1, 73-78 (2005).
- Katz, G., Harchandani, B., Shah, B. Drug-eluting stents: the past, present, and future. Curr Atheroscler Rep. 17, 485 (2015).
- Jain, M., Singh, A., Singh, V., Barthwal, M. K. Involvement of Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase-1 in Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation and Neointimal Formation After Rat Carotid Injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2015).
- Lee, K. P., et al. Carvacrol inhibits atherosclerotic neointima formation by downregulating reactive oxygen species production in vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 240, 367-373 (2015).
- Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101 (12), 1362-1365 (2000).
- Noda, T., et al. New endoplasmic reticulum stress regulator, gipie, regulates the survival of vascular smooth muscle cells and the neointima formation after vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (5), 1246-1253 (2015).
- Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).
- Guo, J., et al. p55gamma functional mimetic peptide N24 blocks vascular proliferative disorders. J Mol Med (Berl). , (2015).
- Oh, C. J., et al. Dimethylfumarate attenuates restenosis after acute vascular injury by cell-specific and Nrf2-dependent mechanisms. Redox Biol. 2, 855-864 (2014).
- Tae, H. J., et al. The N-glycoform of sRAGE is the key determinant for its therapeutic efficacy to attenuate injury-elicited arterial inflammation and neointimal growth. J Mol Med (Berl. 91 (12), 1369-1381 (2013).
- Zhou, Z., et al. Receptor for AGE (RAGE) mediates neointimal formation in response to arterial injury. Circulation. 107 (17), 2238-2243 (2003).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A.
- Le, V., Johnson, C. G., Lee, J. D., Baker, A. B. Murine model of femoral artery wire injury with implantation of a perivascular drug delivery patch. J Vis Exp. (96), e52403 (2015).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J.
- Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods Mol Med. 139, 1-30 (2007).
- Zhang, W., Trebak, M. Vascular balloon injury and intraluminal administration in rat carotid artery. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tae, H. J., et al. Vessel ultrasound sonographic assessment of soluble receptor for advanced glycation end products efficacy in a rat balloon injury model. Curr Ther Res Clin Exp. 76, 110-115 (2014).
- Tae, H. J., et al. Chronic treatment with a broad-spectrum metalloproteinase inhibitor, doxycycline, prevents the development of spontaneous aortic lesions in a mouse model of vascular Ehlers-Danlos syndrome. J Pharmacol Exp Ther. 343 (1), 246-251 (2012).
- Sakaguchi, T., et al. Central role of RAGE-dependent neointimal expansion in arterial restenosis. J Clin Invest. 111 (7), 959-972 (2003).
