Introduction
血管形成術は、アテローム性動脈硬化症のような病理学的状態から得られる狭めたり閉塞した動脈を広げるために使用される血管内処置です。血管形成術の一つの一般的な合併症は、外科的傷害とその後の炎症誘発性血管リモデリングにより発生した後の運用の新生内膜過形成、または再狭窄、です。これらの条件は、血管平滑筋細胞の増殖、および複数の病態生理学的な結果1-3につながります。新生内膜過形成の容器を再厚く、かつ1年以内に60%まで血管形成後の患者の中で起こります。したがって、再狭窄は、広く使用されている血管形成術手順4の主要な後退です。薬剤溶出ステントの植え込みは、再狭窄を防止するのに役立つかもしれないが、唯一の選択された候補は、この費用のかかる手順5を受けることができます。
動物および臨床研究の両方が慢性炎症がvascuによって生成されたことを確立しましたLAR傷害および/ または手術創は、血管形成後の新生内膜増殖2,4のための主要な刺激として機能します。ラット頸動脈バルーン損傷モデルは、臨床的状況を模倣し、従って、血管リモデリングおよび血管細胞増殖6-9に関与する細胞因子を同定するための貴重なモデルシステムとして機能します。このモデル系は、また、前臨床翻訳研究10-14における新生内膜増殖を抑制する薬物および治療 薬のために非常に有用で評価するためのツール及び/又はスクリーンです。
マウス頸動脈ワイヤ傷害モデル15およびマウス大腿動脈ワイヤ傷害モデル16に比べて、ラット頸動脈バルーン傷害モデルが与え損傷の再現性を容易にする外科的処置を容易にするためにサイズが十分に大きいという利点を有します。これはADDITための一次細胞の多く( 例えば 、血管平滑筋細胞、内皮細胞)を提供することができますional インビトロ血管リモデリングを支配する分子機構を描くための研究。重要なことには、マウスに比べて、ラットにも生理学的および毒性試験17のためのより良いモデルであることが知られています。ラットモデルの欠点または制限が変更された遺伝的および遺伝子ノックアウトモデルの欠如であるが、この欠点は、ラットゲノム配列の可用性と、このようなレンダリングCRISPR-CAS技術などの強力なゲノム編集ツールの最近の開発によって克服することができます異なるモデル系18,19におけるゲノム配列の広大な範囲の可能な操作。
ラットバルーン傷害モデルでは、複数のラボや様々な包括的なプロトコルで使用されてきたが20,21を公開されている、このプロトコルは、手術前の準備でより詳細な情報を提供することを目的とし、この外科的な練習をセットアップするには、この手順に新しい研究者を案内することができます。また、トンの術後のケアを重視します生きた動物13,22だけでなく、動脈リモデリングに対する治療効果の死後の病理学的および組織形態学的分析だけでなく、超音波超音波検査の研究ができます彼の動物。
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Protocol
注:ラットバルーン損傷モデルおよび組換えのsRAGEと超音波超音波検査の研究の注入を含む、関連する手順の使用は、国立老化研究所の動物実験委員会(ACUC)、NIHによって承認されています。
1.手術前の準備
- インストゥルメント、外科プラットフォーム、および個人装備。
- この手順で使用するすべての手術器具および試薬のための材料および機器の表を参照してください。外科手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブ。
注:同じ日に実行される複数の手術の場合、手術の間に器具を滅菌するために予備加熱したガラスビーズ滅菌器を使用しています。 - 70%アルコールでオペレーティングプラットフォームの表面を殺菌します。手術用ガウン、ヘアカバー、外科手術用マスク、保護眼鏡、と手袋を着用してください。追加の私たちのための外科的なプラットフォームの近くに滅菌手袋のボックスを残します電子。
- この手順で使用するすべての手術器具および試薬のための材料および機器の表を参照してください。外科手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブ。
- バルーンカテーテルの準備。
- 滅菌水で1ミリリットル注射器を記入し、滅菌水で満たされた2方コックに注射器を取り付けます。静かにバルーンカテーテルのルアーロック部を記入し、カテーテルの開口部から気泡を除去するためにストップコックを通して水をプッシュ。
- バルーンを保証するテストバルーン膨張は、水0.02mlのことで膨張させることができます。乾燥や汚染を避けるために手術前に滅菌水の容器にバルーンの先端に保管してください。
- 麻酔と動物の準備。
- Wistar系雄性ラット(400〜450グラム)を計量し、IDを確認するために、耳のタグを確認してください。このようなつま先や尾をつまんとしてペダル引っ込め反射をチェックすることによって、鎮静の深さを確認し、誘導チャンバー内にラットを置き、その後、気化器をオンにして1.5〜2.0 Lに3.5から4.0パーセントにイソフルランレベルと酸素レベルを調整動物の。
- 麻酔に達した後(
- 麻酔の外科的なレベルに到達した後、単に動物のバリカンと胸骨の上までchinから腹側ネック領域を剃るし、ポビドンヨードおよび70%エタノールで3回の1:10希釈液を交互に剃毛した皮膚を綿棒。
- 乾燥からそれらを防ぐために、綿棒で動物の開いた目に点眼液を置きます。動作中の乾燥を避けるために、水を飲んで動物の舌と口を湿ら。
- 無菌手術用シートでラットを覆い、ネック領域を露出させるためにシートをカット。仰臥位のOに動物を置きます外科医に向かって頭を手術用プラットフォーム上のパッド加熱ナ。テープを使用して、手術用プラットフォームに動物の手足を修正しました。
2.外科的処置
- 左頸動脈の解剖と単離
- ちょうど胸郭の上に尾部に向かう方向に胸骨の先頭にすべての方法を顎の下のストレート切開を作るためにメスを使用してください。ぶっきらぼうに筋層を露出させるために皮膚の下唾液腺組織を分析する7S鉗子を使用してください。頸動脈管構造とネック領域における迷走神経へのアクセスを獲得するために別の筋肉組織。
- ぶっきらぼうに頸動脈を周囲の組織を解剖し、慎重に任意の損傷を避けるために迷走神経と血管筋膜を分離します。継続的にダウンして胸骨の内部および外部の支店および総頸動脈を露出させるために頸動脈分岐部まで解剖します。
- Arteriotの調製大丸有
- 後退や止血のために、左総頸動脈に最も近位のサイトで合字を置き、分岐点に位置即時遠位にある別のリガチャー。
- 頭に向かって動脈を後退させるためにできる限りの分岐部から外頸動脈で4.0絹縫合糸を配置します。永久昇順咽頭、後頭動脈漏れを回避するための優れた甲状腺を含む外頸動脈に沿って4.0絹縫合糸を用いて、小動脈を結紮。
- 重大な逆行性の血液の損失を回避するために、内頸動脈の周りに4.0絹縫合糸を配置します。通常、内部分岐の利用可能な長さは最小です。内頚動脈を可視化するために、静かに右に、上にある頸動脈を後退させることにより可能な限り内頸動脈を露出させます。
- バルーンカテーテルの導入
- 総頸動Aの近位縫合糸を撤回rteryとは、一時的に血流を止めるために、血管に動脈クランプを配置します。できるだけ縫合糸のよう遠位位置で外頸動脈に(1/3動脈の円周の1/4)に小切開を加えます。
- 優しく切開部に未膨張バルーンカテーテルを挿入し、総頸動脈に動脈クランプに近い内腔にカテーテルを進めます。クランプを外し、さらに切開から約35〜40ミリメートル、大動脈弓にバルーンカテーテルを進めます。
- バルーン傷害
- 手動で添付シリンジを介して0.02ミリリットルの容量にカテーテルを膨張し、その後、注射器とカテーテルとの間のコックをロックします。ゆっくりと回転してカテーテルを引き抜きます。カテーテルはarteriotomic切開部に近接している場合には、バルーンを収縮させます。元の場所にカテーテルを進めます。
- 合計3回2.4.1を繰り返します。慎重に動脈内腔からカテーテルを除去します。
- 手術創をクローズアップ
- 縫合糸で動脈切開を閉じます。血流を回復するために内頸動脈をリリース。動脈出血やリークを確認してください。出血が発生した場合は、出血を止めるために、ビット圧力でガーゼを適用します。
- 手続きのために使用される縫合糸およびクランプの残りの部分を削除します。 6.0縫合糸で腺組織を閉じます。皮膚の縫合糸または創傷クリップで皮膚を閉じます。イソフルランの電源を切り、数分間、純酸素で動物を残します。
3.治療薬の投与は、鎮痛薬、手術後のケア、および安楽死
- 治療薬や鎮痛剤の投与。
- 手術後、筋肉内にブプレノルフィン(0.03ミリグラム/キログラム)を注入します。手術中に血液の損失を補償するために、5ミリリットル予め温めた滅菌生理食塩水を皮下に注入します。腹膜へのsRAGE(0.5 ngの/ g)を(治療薬)を注入します。
- OPHで再び目を湿らthalmic軟膏。熱パッドの上にラットを置き、胸骨横臥位を維持するために完全な意識を取り戻すまで、動物を監視します。
- きれいな寝具を使用してケージにラットを戻し、バックビバリウムにケージを持参。出席獣医師や世話人を警告するためにケージに特殊な観測カードを置きます。
- 術後のクリーンアップ
- ゴミや特殊な廃棄容器へのいずれかの針らパッド、綿棒、を含む使用済みの外科材料を入れてください。手術プラットフォームを消毒し、手術器具を清掃してください。
- 術後のケア
- 48時間後に手術期間中にブプレノルフィン(0.03ミリグラム/キログラム)一日二回(BID)を管理します。このような不動、養うことができないこと、hutched姿勢、フリル毛皮、としかめっ面のような苦痛の一般的な徴候のための48時間術後期間中に密接に動物を監視します。創傷赤みのための条件、腫れ、裂開、および感染症を監視します。
注意:追加の治療は、獣医師の勧告に出席に応じて処方されることがあります。 - 獣医師の勧告に出席に応じて縫合または創傷クリップを削除します。
- 48時間後に手術期間中にブプレノルフィン(0.03ミリグラム/キログラム)一日二回(BID)を管理します。このような不動、養うことができないこと、hutched姿勢、フリル毛皮、としかめっ面のような苦痛の一般的な徴候のための48時間術後期間中に密接に動物を監視します。創傷赤みのための条件、腫れ、裂開、および感染症を監視します。
- 安楽死
- 手術の2週間後に、22を分析し 、死後ヒスト形態学のための頸動脈を分離するために、ラットを安楽死させます。呼吸の完全な停止するまで、少なくとも2分間、空気を飽和5から20までパーセントイソフルランを含むチャンバーにラットを置きます。前の器官および組織の切開に死を確認します。
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Representative Results
二週間バルーン損傷後、ラットを安楽死させられ、頸動脈はヒスト形態素解析のために単離されます。両方とも、左頸動脈および非作動右動脈は、断面に処理され、パラフィン包埋されている操作しました。パラフィン次いで、サンプルをさらに薄い切片であり、そしてヘマトキシリン - エオシン(H&E)で染色しました。ヒスト形態学的分析は、デジタル画像分析システムを用いて行われます。動脈収穫とヒスト形態素解析の詳細は、13,23に記載されています。バルーン傷害誘発新生内膜増殖、または血管壁の肥厚、未処理の(またはプラセボとして生理食塩水で処置された)ままの場合、 図1Bに示すように、同じラット( 図から非操作容器部に比べて、明らかです1A)。ブロック新生内膜増殖がsignif示したこと(この場合は、のsRAGE)ラット受けた治療薬の容器区分icantly血管壁( 図1C)の肥厚を減少させました。バルーン損傷ならびに治療的処置の効果はまた、ヒスト形態素解析の結果( 図2)と十分に協力超音波超音波検査22を使用してインビボで評価することができます。ラットバルーン傷害モデルにおける有効性および治療 のsRAGEの管理ウィンドウの評価の詳細は、以前の刊行物13,22に記載されています。低減する治療薬を評価または損傷誘発血管壁リモデリングを遮断するために、ラット(N = 8-15)のグループは、統計的に意味のある結論を得るために操作されます。
図1: ラット頸動脈バルーン傷害モデルから代表的な結果 carotiのH&E染色。D動脈断面(A)非操作右頸動脈部と(B)バルーン負傷し、プラセボ処置左頸動脈の部分(矢印がneotimal領域を示します)。 (C)バルーン負傷し、左頸動脈のセクションをsRAGEの処理された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:直径及び(B)血管壁の厚ルーメン超音波超音波検査および組織学の相関 (A)からのデータの散布図で示したsRAGE(0.5 ngの/ g)で処理された頸動脈の血管は、2週目に損傷後(非操作します、のsRAGEで負傷、およびプラセボ処置、各群n = 12)。 (C)代表sonographicおよび組織学的(100X)の画像。 (出版社の許可を受けて、基準22から図)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
頚動脈の動脈内腔で壁画内皮を除去損傷を生成するためにバルーンを膨張させるために使用される二つの方法がありました。一つは、液体20を取り付けた注射器を充填することであり、他方は空気圧21を使用することです。我々は、正確な液量(0.02 ml)を各手順に使用されるので、液体が充填された注射器を使用することを好みます。これは、処置を受けて各動物における損傷の同様のレベルにつながる、バルーンの正確で再現インフレをレンダリングします。シリンジ内の液体を使用すると、実際に液体中の気泡の除去を必要とします。これは、カテーテルの開口部から気泡を押し出すことによって達成することができます。気泡の大部分を除去した後、残留、小さな気泡が1~2時間で散逸します。私たちは、研究者が1〜2時間前の手順と手術前の材料を準備することを示唆している、とアプロを確保するために、各個々の手術前にバルーン膨張の度合いを確認しますpriateインフレ。
手術のために、外科医と彼/彼女のアシスタント(複数可)は、感染から動物や研究者の双方を保護するために、フェイスマスク、滅菌手袋、手術用ガウンを含むすべての必要な保護ギアを着用しなければなりません。この手順のために使用される標準2Fフォガーティバルーン塞栓摘出カテーテルを導入するための頸動脈の適切なサイズを確保するために同様のbodyweights( 例えばグラム380から450の間)に完全に成長し、雄ラットを使用することが重要です。手術前に、手術全体をカバーして麻酔薬の十分な量を確保するために気化器にイソフルランのレベルをチェックし、必要に応じて、各手術の開始前に気化器を補充します。手術のために十分な酸素を確保するために、酸素タンクの圧力計を確認してください。麻酔の適切な深さに達していることを確認するためには、また、ラットの呼吸速度を監視することができます。正常ラットは〜85息/分の呼吸速度を持っています。呼吸の深さと再の増加のどのリズム、および呼吸数の減少は、外科手術の麻酔を意味します。
手術中、麻酔を継続的に監視しなければならないと呼吸、ペダル反射、及び外科的刺激に対する動物の応答をチェックすることにより維持しました。彼/彼女の手は、このような潜在的な汚染や感染を防ぐために、ペダル反射をチェックするように、手術中に動物の非滅菌部品に触れた場合注目すべきは、外科医は、手袋を変更する必要があります。また、外科医と助手も慎重に麻酔薬の過剰投与を防止し、それはイソフルランをオフにすることによって発生した場合、状況を回避するために迅速な是正措置をとり、100%に酸素レベルを高めるために運転中に動物のバイタルサインを監視する必要があります。麻酔薬の過剰摂取の兆候が遅く、浅い呼吸、弱いと不規則なパルスを含みます。また、頸動脈aの完全な分離を含むバルーン傷害の前に動脈切開の良い準備を示唆していますその隣接組織からrteryセクション。これは、操作中に予期しない出血を回避するのに役立ちます。
手術後の回復期中を含む麻酔下の動物は、放置すべきではありません。 48時間の術後期間中に定期的なブプレノルフィン(0.03ミリグラム/ kgのBID)、徐放性ブプレノルフィン(ブプレノルフィンSR)の代替として使用することもできます。手術直後ブプレノルフィンSR(1.0から1.2ミリグラム/キログラム)の注入は、72時間までの手術後の期間をカバーします。一般的には、手術後の合併症が予想されていません。しかし、慎重な警告の練習は、動物の福祉を確保し、制度ACUCによってポリシーです。
それは動物の研究グループ(8-15)でのバルーン損傷の同じレベルを再現することが最も重要であるため、適切な外科的スキルと手順に精通を強くお勧めします。この手順に新しい研究者のために、我々は示唆しています動脈切開の準備、バルーン傷害や制度動物施設で利用可能なものがラットの死骸に創傷閉鎖を含む全体の手順を練習する最初。手順を熟知獣医または研究者と外科手術を練習することも、再現性と一貫性のあるバルーン傷害の結果を得ることが保証されます。
私たちの見解、薬物および/または新生内膜の成長を否定する治療法では最高の早い段階で炎症を相殺するために、バルーン損傷直後に投与されます。いくつかの試薬は、効果を達成するために、回復のその後の日中に継続的に投与する必要があるかもしれません。早期介入は、ブロックしたり、その後の血管リモデリングの13,22,24を減らすのに役立ちます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 F Fogarty balloon embolectomy catheter | Edwards Lifesciences | ||
Standard scalpel | Fine Science Tools | ||
Small curved forceps (Large radius Dumont#7shanks curved) | Fine Science Tools | ||
Large, medium and small micro-scissors | Roboz | ||
Needles (20 G) | TycoHealthcare | ||
Micro-surgery forceps with micro-blunted atraumatic tips | Fine Science Tools | ||
Atraumatic straight small arterial clamps | Fine Science Tools | ||
Retractor with maximum spread 5.5 cm long blunt teeth | Fine Science Tools | ||
Silk suture (4.0 and 6.0 ) | Fine Science Tools | ||
Syringe (1.0 ml) | BD | ||
Curity gauze sponges | AllegroMedical | ||
Cotton tip applicators sterile and non-sterile | Puritan Medical Products | ||
Compact hot bead sterilizer | Fine Science Tools | ||
Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | ||
ADS200 anesthesia system/ventilator | Paragon Medical | ||
Isoflurane (forane), liquid form | Baxter | ||
Sodium chloride 0.9% (Saline) | Hospira | ||
Buprenex (buprenorphine) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | ||
70% alcohol | Fisher | ||
1:10 Betadine | Fisher |
References
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