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Neuroscience

एक neuronal प्रोटीन न्यूरॉन्स में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अप्राकृतिक एमिनो एसिड का उपयोग की ऑप्टिकल नियंत्रण

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

पारंपरिक बिजली उत्तेजना की तुलना में, photostimulation नमूनों की शारीरिक प्रणाली के लिए कम से कम हस्तक्षेप के साथ अधिक से अधिक अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। 1971 1 में न्यूरॉन्स को प्रोत्साहित करने के लिए लेसरों का उपयोग के प्रदर्शन के बाद से, कई रचनात्मक तरीके exogenously प्रकाश के साथ neuronal गतिविधि को नियंत्रित करने के आविष्कार किया गया है। Photocaged agonists के ऑप्टिकल रिहाई लंबे ligands 2,3,4 को न्यूरोनल नेटवर्क की शारीरिक प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तकनीक को बंदी एगोनिस्ट के प्रसार के कारण विशिष्टता सीमित है। जेनेटिक विशिष्टता ectopically व्यक्त प्रकाश के प्रति संवेदनशील opsin चैनलों द्वारा हासिल की है और 5,6,7 पंप, और इसे सफलतापूर्वक विविध मॉडल जीवों में चयन neuronal नेटवर्क मिलाना करने के लिए लागू किया गया है। हालांकि, यह अन्य प्रोटीन के लिए opsin प्रोटीन से photoresponsiveness ग्राफ्टिंग के बाद से ऑप्टिकली विभिन्न अन्य न्यूरोनल प्रोटीन को नियंत्रित करने के लिए इस विधि को लागू करने के लिए मुश्किल होगा woulघ तीव्र इंजीनियरिंग कि अध्ययन के तहत प्रोटीन की प्राकृतिक विशेषताओं को बदल सकता है की आवश्यकता होती है। रासायनिक tethering एक प्रोटीन के लिए एक exogenous सहज ligand एक और तरीका चैनल प्रोटीन 8,9,10 की कार्यक्षमता को नियंत्रित करने के लिए प्रदर्शन किया है। ligand प्रस्तुत या azobenzene आधा भाग के photoisomerization के माध्यम से प्रोटीन के बंधन साइट से वापस ले लिया है। Tethering रसायन विज्ञान, मुख्य रूप से झिल्ली प्रोटीन के बाह्य पक्ष के लिए आवेदन की सीमा intracellular पक्ष और intracellular प्रोटीन को छोड़कर।

Photoresponsive UAAS, प्रोटीन में शामिल किए जाने के बाद, एक सामान्य रणनीति प्रकाश के साथ प्रोटीन हेरफेर करने के लिए प्रदान करते हैं। प्रारंभिक प्रयासों में, tRNAs रासायनिक acylated photocaged UAAS साथ Xenopus oocytes में microinjected थे झिल्ली रिसेप्टर्स और आयन चैनल 11, उन्नत है जो उनकी संरचना समारोह संबंधों 12,13,14 की समझ में UAAS शामिल करने के लिए।यह microinjection दृष्टिकोण मुख्य रूप से बड़े oocytes तक सीमित है। एक UAA की जेनेटिक समावेश एक orthogonal tRNA / synthetase जोड़ी है, जो जीवित कोशिकाओं 15,16,17,18 में अंतर्जात प्रोटीन अनुवाद के माध्यम से UAA शामिल का उपयोग करके तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण tRNA acylation और microinjection नजरअंदाज। न्यूरोनल प्रोटीन में UAA समावेश प्राथमिक न्यूरॉन्स और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 19,20 में प्रदर्शन किया गया है। हाल ही में, photoresponsive UAA आनुवंशिक रूप से एक neuronal प्रोटीन में स्तनधारी दिमाग में विवो में पहली बार 21 के लिए शामिल किया गया है। ये प्रगति यह उनके पैतृक सेलुलर वातावरण में UAAS साथ neuronal प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संभव बनाते हैं।

अंदर की ओर सुधार पोटेशियम चैनल Kir2.1 एक मजबूत सही करनेवाला है कि कश्मीर + धाराओं सेल से बाहर की तुलना में में अधिक आसानी से गुजरता है, और यह सेल excitability, नाड़ी स्वर, हृदय गति, फिर सहित शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में आवश्यक हैएनएएल नमक प्रवाह और इंसुलिन रिलीज 22। Kir2.1 की overexpression लक्ष्य न्यूरॉन, जो कम उत्तेजनीय 23,24 हो जाता है की झिल्ली क्षमता hyperpolarizes। ऑप्टिकली अपने मूल कोशिकाओं में Kir2.1 नियंत्रित करने के लिए, कांग एट अल। आनुवंशिक रूप से शामिल Kir2.1 में एक फोटो उत्तरदायी UAA स्तनधारी कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और भ्रूण माउस दिमाग 21 में व्यक्त किया। प्रकाश का एक संक्षिप्त नाड़ी एक प्राकृतिक एमिनो एसिड Cys में UAA परिवर्तित करने के लिए, इस प्रकार लक्ष्य Kir2.1 प्रोटीन को सक्रिय करने में सक्षम था। जब इस फोटो-inducible भीतर सुधार पोटेशियम (Pirk) चैनल प्रोटीन चूहे हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स में व्यक्त की गई थी, यह प्रकाश सक्रियण के जवाब में neuronal फायरिंग दबा दिया। इसके अलावा, Pirk चैनल भ्रूण माउस neocortex में व्यक्त की गई थी, और cortical न्यूरॉन्स में प्रकाश सक्रिय Pirk वर्तमान मापा गया था। स्तनधारी दिमाग में विवो में UAA प्रौद्योगिकी के सफल कार्यान्वयन के दरवाजे ऑप्टिकली न्यूरोनल प्रोटीन को नियंत्रित करने खोलता हैउनके पैतृक वातावरण में, आणविक स्तर पर neuronal प्रक्रियाओं और तंत्र के ऑप्टिकल विच्छेदन सकेंगे।

इस प्रोटोकॉल में हम संस्कृति और इन विवो में भ्रूण माउस मस्तिष्क में प्राथमिक न्यूरॉन्स में UAAS के आनुवंशिक शामिल करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन। photoresponsive UAA CMN और Kir2.1 प्रक्रिया को वर्णन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तरीके सफल UAA समावेश और प्रदान की जाती हैं न्यूरोनल प्रोटीन गतिविधि के ऑप्टिकल नियंत्रण आकलन करने के लिए। इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से न्यूरॉन्स और इन विवो में UAAS एन्कोडिंग, और ऑप्टिकली एक photoresponsive UAA के माध्यम से न्यूरोनल प्रोटीन समारोह को विनियमित करने के लिए एक स्पष्ट मार्गदर्शन प्रदान करता है। हम इस प्रोटोकॉल के तंत्रिका विज्ञान और optogenetic जैविक अध्ययन के लिए इन विवो UAA प्रौद्योगिकी के गोद लेने की सुविधा के लिए उम्मीद है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में सभी प्रक्रियाओं का उपयोग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) बायोलॉजिकल अध्ययन के लिए The सॉल्क संस्थान, ला जोला, सीए पर जानवर से निपटने के लिए प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी प्रदर्शन किया गया

1. Kir2.1 में UAA निगमन और प्राथमिक Neuronal संस्कृति में परिणामी Pirk की अभिव्यक्ति

  1. डीएनए निर्माण
    1. UAA शामिल करने के लिए Kir2.1 का लक्ष्य साइट का चयन करें। संरचना और Kir2.1 के समारोह के बारे में पूर्व ज्ञान और जानकारी का फायदा उठाने के लिए, ताकि photoresponsive UAA शामिल साथ चुना साइट Kir2.1 समारोह 21 के ऑप्टिकल मॉडुलन सक्षम बनाता है।
    2. टैग एम्बर स्टॉप कोडोन उत्परिवर्तित चुना साइट के साथ एक पुनः संयोजक डीएनए एन्कोडिंग Kir2.1 जीन का निर्माण। एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में Kir2.1 टैग डीएनए क्लोन करने के लिए मानक क्लोनिंग तकनीक 25 का प्रयोग करें।
    3. क्लोन tRNA / synthetase जीन है कि UAA के लिए विशिष्ट होते हैं और के जवाब में UAA शामिलअन्य स्तनधारी अभिव्यक्ति में टैग स्टॉप कोडोन 21 प्लाज्मिड।
      नोट: इष्टतम UAA शामिल करने के लिए, विभिन्न प्रमोटरों और जीन कैसेट का संयोजन (tRNA, synthetase, और Kir2.1 के लिए) अलग plasmids में परीक्षण किया जा सकता है।
    4. miniprep का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता प्लाज्मिड DNAs प्राप्त या निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक किट maxiprep। 260/280 अनुपात के 1.9 के आसपास शुद्ध डीएनए के लिए इष्टतम है। जब आवश्यक हो, तैयार डीएनए 25 की शुद्धता की जांच करने के लिए एक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करते हैं। उच्च शुद्धता के साथ supercoiled प्लाज्मिड DNAs न्यूरोनल अभिकर्मक के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं।
  2. संस्कृति चूहे के हिप्पोकैम्पस प्राथमिक न्यूरॉन्स
    1. जगह कांच coverslips (हलकों, व्यास में 12 मिमी) 24 अच्छी तरह से प्लेट में, अच्छी तरह से प्रत्येक पर एक coverslip, और कोट अच्छी तरह से प्रत्येक के साथ 0.5 मिलीग्राम के 250 μl / एमएल पाली डी lysine (100 मिमी में borate बफर: 1.24 छ बोरिक एसिड और 1.90 ग्राम का विआयनीकृत आसुत 400 मिलीलीटर में सोडियम tetraborate एच 2 ओ या DDH 2
    2. विच्छेदन के दिन, उन्हें isoflurane साथ anesthetizing, और मारने का इरादा बनाया के बाद प्रसव के बाद चूहे पिल्ले (1-4 प्रसव के बाद दिन) से नवजात दिमाग इकट्ठा। एक anesthetization isoflurane (2-4%) युक्त कक्ष में पिल्ले anesthetize। रुको जब तक वे होश खो और स्पर्श उत्तेजनाओं को और पंजे के बन्द रखो के लिए प्रतिक्रिया करने में विफल।
    3. मानक तकनीक का उपयोग करते हुए 26, गर्म में मस्तिष्क से hippocampi काटना (~ 37 डिग्री सेल्सियस) खारा (10 मिमी और 20 मिमी HEPES डी ग्लूकोज हांक संतुलित नमक के घोल में जोड़ा), और 4.5 मिलीलीटर गर्म नमक के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब में hippocampi इकट्ठा ।
    4. hippocampi (0.25% अंतिम trypsin एकाग्रता) को 2.5% trypsin के 500 μl जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. अच्छी तरह से खारा (3 एक्स 10 एमएल) और Triturate के साथ ऊतक कुल्ला।
    6. 1 मिलीलीटर w में अलग न्यूरॉन्स की वसूलीहाथ में बढ़ोतरी पर न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) मीडिया 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 21.2 मिलीमीटर डी ग्लूकोज, 2 मिमी एल glutamine, 2% बी -27, और 0.1% सीरम भरनेवाला।
      नोट: ताजा वृद्धि मीडिया को तैयार करने के विच्छेदन के दिन एल glutamine और बी -27 जोड़ें।
    7. एक hemocytometer साथ न्यूरॉन्स गिनती, और 1.0-1.5 x 10 5 सेल में 24 अच्छी तरह प्लेटें में coverslips पर उन्हें प्लेट / अच्छी तरह से 500 μl विकास मीडिया के साथ घनत्व के बाद एक 40 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से छाना।
    8. 2-3 सप्ताह के लिए 95% हवा humidified इनक्यूबेटर: एक 5% सीओ 2 में 35 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरोनल संस्कृति सेते हैं। सबसे अच्छा परिणाम के लिए, ऊष्मायन के दौरान जितना संभव संस्कृति को परेशान करने से बचें।
  3. कैल्शियम फास्फेट (सीए-पी) प्राथमिक Neuronal संस्कृति के अभिकर्मक
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान और दुकान बनाओ: 0.5 एम BES (एन, एन -bis [2-हाइड्रोक्सी एथिल] -2-aminoethanesulfonic एसिड) बफर (10x); 150 मिमी ना 2 HPO 4 (100x); 2.8 एम NaCl (10 x); बाँझ DDH 2 हे; बाँझ 1 एन NaOH।
    2. अभिकर्मक के दिन पर ताजा 2.5 एम 2 CaCl 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ DDH 2 हे में समाधान और बाँझ फिल्टर कर सकते हैं। ताजा 2x BES बफर खारा (बीबीएस) 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ 7.00 पीएच (NaOH के साथ पीएच को समायोजित) और बाँझ फिल्टर में 50 मिमी BES, 1.5 मिमी ना 2 HPO 4, और 280 मिमी NaCl युक्त बफर बनाओ।
      नोट: 2 CaCl समाधान और coverslips की संख्या के आधार पर बीबीएस बफर की राशि ट्रांसफ़ेक्ट हो गणना। इसके अलावा 1.3.4 पर दिखेगा।
    3. 500 μl ताजा पूर्व गर्म अभिकर्मक विकास मीडिया के साथ संस्कृति विकास मीडिया बदलें। (अभिकर्मक मीडिया सदस्य प्लस 21.2 मिलीमीटर डी ग्लूकोज के साथ किया जा सकता है)।
      नोट: पुराने मीडिया नहीं छोड़ें।
    4. DDH 2 हे की राशि की गणना और व्यवस्था अभिकर्मक समाधान युक्त 1.65 μl 2 CaCl, 0.7 माइक्रोग्राम डीएनए, और 16.5 और (प्रत्येक coverslip प्रति 33 μl) बनाने के लिए में जोड़ने के लिए तैयार# 181; एल 2x बीबीएस।
    5. संस्कृति में जोड़ने से पहले तुरंत अभिकर्मक समाधान तैयार है। तैयार करने के लिए, पहले गठबंधन 2 CaCl और DDH 2 हे जबकि धीरे ट्यूब आंदोलनरत। आंदोलन जारी है और धीरे धीरे समाधान में डीएनए जोड़ें। अन्त में, 2x बीबीएस बफर बूंद-वार करते हुए आंदोलनरत जोड़ें।
    6. इसके तत्काल बाद neuronal संस्कृति के प्रत्येक coverslip करने के लिए अभिकर्मक समाधान के 30 μl जोड़ें।
    7. 45 मिनट-1 घंटे के लिए 95% हवा humidified इनक्यूबेटर: संस्कृति पकवान एक बार कुछ समाधान मिश्रण और एक 5% सीओ 2 में 35 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं रॉक। बाद न्यूरॉन्स अभिकर्मक समाधान के साथ incubated हैं, बहुत ही सुन्दर सीए-पी अवक्षेप न्यूरॉन्स को कवर करने के लिए एक परत के रूप में होगा।
    8. 500 μl पूर्व गर्म कपड़े धोने बफर (135 मिमी NaCl, 20 मिमी HEPES, 4 मिमी KCl, 2 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी ना 2 HPO 4, पीएच 7.3 से कम 10 मिमी ग्लूकोज, बाँझ साथ अभिकर्मक मीडिया बदलें 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर) और 35 पर सेते6, सी एक 5% सीओ 2: 15-20 मिनट के लिए 95% हवा humidified इनक्यूबेटर। सीए-पी अवक्षेप धोने कदम के बाद गायब हो जाएगा।
    9. 500 μl ताजा वृद्धि मीडिया से धोने बफर बदलें। फिर, बचाया मूल मीडिया के साथ विकास मीडिया की जगह।
    10. UAA CMN (50 μl गर्म विकास मीडिया में पूर्व मिश्रित) संस्कृति में जोड़े 1 मिमी अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए।
    11. Assays से पहले 12-48 घंटे के लिए 95% हवा humidified इनक्यूबेटर: एक 5% सीओ 2 में 35 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृति सेते हैं।
  4. प्रकाश सक्रियण के साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग
    1. अतिरिक्त / intracellular समाधान तैयार करें। Intracellular समाधान 135 मिमी पोटेशियम gluconate, 10 मिमी NaCl, 2 मिमी MgCl 2, 10 मिमी HEPES, 1 मिमी EGTA, 2.56 मिमी कश्मीर 2 एटीपी, और पीएच 7.4 से 0.3 मिमी ली 2 जीटीपी में शामिल है। बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान 150 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, शामिल हैं 5 मिमी 2 MgCl, 0.5 मिमी CaCl 2, 5 मिमी ग्लूकोज, और 7.4 पीएच में 10 मिमी HEPES।
    2. एक 45 डिग्री के कोण पर 1 सेमी दूर से केन्द्र बिन्दु को प्रकाश देने के लिए रिग पर माइक्रोस्कोप से 385 एनएम के उत्सर्जन के साथ एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) स्थापित करें। एक प्रकाश बिजली मीटर के साथ एलईडी की शक्ति की जाँच करें।
  5. एक वाणिज्यिक micropipette खींचने का उपयोग 3-6 MΩ पिपेट प्रतिरोध करने की कांच इलेक्ट्रोड से पैच pipettes खींचो। micropipette खींचने स्थापित करने के लिए निर्माता के अनुदेश का पालन करें।
    1. पिपेट प्रतिरोध का परीक्षण करने के लिए, पहली intracellular समाधान के साथ पिपेट भरने और इलेक्ट्रोड धारक पर यह स्थिति। एक 35 मिमी संस्कृति कोशिकी समाधान के साथ भरा पकवान में पिपेट, माइक्रोस्कोप पी पर रखा डुबकीlatform। एक सर्किट पूरा करने के लिए डिश में एक जमीन इलेक्ट्रोड विसर्जित कर दिया।
    2. एम्पलीफायर / digitizer पर बारी और एक डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करते हैं। एक झिल्ली परीक्षण प्रोटोकॉल के साथ पिपेट प्रतिरोध की निगरानी।
  6. इनक्यूबेटर से न्यूरॉन संस्कृति का एक coverslip बाहर ले जाओ और बाह्य समाधान में एक बार कुल्ला। वैक्यूम तेल का प्रयोग, एक 35 मिमी संस्कृति ताजा कोशिकी समाधान के साथ भरा पकवान के बीच में coverslip दबाए रखें।
  7. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माइक्रोस्कोप मंच पर coverslip / डिश रखें।
  8. मानक पैच clamping तकनीकों का प्रयोग, mCitrine प्रतिदीप्ति 27 के साथ एक न्यूरॉन पैच। रिकार्ड neuronal गतिविधि वर्तमान दबाना (मैं दबाना) विधि का उपयोग कर। सबसे पहले, एक छोटे से वर्तमान इंजेक्शन लगाने के द्वारा आसपास -72 एम वी विश्राम क्षमता को समायोजित। फिर, कार्रवाई की क्षमता के निरंतर गोलीबारी (5-15 हर्ट्ज) प्रेरित करने के लिए एक कदम और वर्तमान (10-200 PA) इंजेक्षन।
  9. मैन्युअल, या डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, एक पल्स फ्लैश (एक पापएलईडी प्रकाश के 100 मिसे -1 सेकंड की अवधि) न्यूरॉन के gle पल्स जबकि रिकॉर्डिंग, और देखो अगर कार्रवाई की क्षमता प्रभावित कर रहे हैं।
  10. 0.5 मिमी BaCl 2 स्नान में जोड़े और सत्यापित करें कि कार्रवाई क्षमता बरामद कर रहे हैं।

2. Kir2.1 में UAA निगमन और माउस भ्रूण मस्तिष्क विवो में परिणामी Pirk की अभिव्यक्ति

  1. डीएनए निर्माण
    1. इसी तरह से डिजाइन प्लास्मिड डीएनए 1.1 चरण में के रूप में। इन विवो अभिव्यक्ति के लिए, इस तरह के नियंत्रक एवं महालेखा परीक्षक (सीएमवी बढ़ाने के साथ चिकन बीटा actin प्रमोटर) के रूप में एक मजबूत प्रमोटर का उपयोग करें।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक endotoxin मुक्त maxiprep वाणिज्यिक किट के साथ डीएनए शुद्ध। फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण अत्यंत उच्च गुणवत्ता डीएनए (2-5 माइक्रोग्राम / μl के लिए सघन) प्राप्त करने के लिए इथेनॉल वर्षा 25 के द्वारा पीछा किया प्रदर्शन करना।
  2. माउस भ्रूणीय Neocortex को utero electroporation में
    नोट: बुनियादी तकनीकutero में electroporation के लिए कुए में पहले 28 में वर्णित किया गया है।
    1. सोडियम pentobarbital (intraperitoneal इंजेक्शन, प्रति ग्राम शरीर के वजन 50 ग्राम) या isoflurane (साँस लेना, 2-4%) के साथ भ्रूण दिन 14.5 (E14.5) पर एक समय पर गर्भवती माउस anesthetize। चेतना की हानि और स्पर्श उत्तेजनाओं को कोई जवाब नहीं की जाँच करके और पंजे के बन्द रखो के लिए संवेदनाहारी गहराई मॉनिटर।
    2. पेट midline पर एक छोटा सा चीरा। धीरे संदंश और उंगलियों के साथ गर्भाशय सींग का पर्दाफाश।
    3. एक गिलास पिपेट गर्भाशय की दीवार के माध्यम से डाला के साथ प्रत्येक littermate के पार्श्व वेंट्रिकल में लगभग 1 μl डीएनए समाधान (प्रत्येक प्लाज्मिड के 2-5 माइक्रोग्राम / μl, निर्माण पर निर्भर करता है) इंजेक्षन। ज्यादातर मामलों में, कुल भ्रूण के 60-80% के बारे में इंजेक्ट किया जाता है।
    4. एक electroporator (33-35 वी, 50 मिसे अवधि, 950 मिसे अंतराल, 4-8 दालों) के साथ भ्रूण Electroporate।
    5. के लिए के साथ धीरे उदर गुहा को गर्भाशय सींग लौटेंCeps और उंगलियों। पेशी दीवार सिवनी और तब शल्य सीवन के साथ त्वचा भ्रूण विकास जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए।
  3. UAA Microinjection
    1. पेट midline पर एक छोटा सा चीरा E16.5 पर फिर से बनाने के लिए, और धीरे संदंश और उंगलियों के साथ गर्भाशय सींग का पर्दाफाश।
    2. electroporated पक्ष या एक गिलास पिपेट गर्भाशय की दीवार के माध्यम से डाला साथ पार्श्व वेंट्रिकल के दोनों पक्षों के बारे में 2-5 μl CMN-अला (500 मिमी) इंजेक्षन। CMN जैव उपलब्धता बढ़ाने के लिए, dipeptide CMN-अला (CMN-alanine) का उपयोग विवो 21 में CMN देने के लिए।
    3. फिर, संदंश और उंगलियों के साथ धीरे उदर गुहा को गर्भाशय सींग वापसी। पेशी दीवार सिवनी और तब शल्य सीवन के साथ त्वचा भ्रूण विकास जारी रखने के लिए अनुमति देने के लिए।
  4. प्राप्त तीव्र मस्तिष्क स्लाइस
    1. 1 एल कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) युक्त 119 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1.3 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी CaCl बनाओ 2 4 पीओ, 26.2 मिमी 3 NaHCO, और 11 मिमी ग्लूकोज।
    2. 20-30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 200 मिलीलीटर ACSF और तेजी से जमाना ले लो। बुलबुला 5% सीओ 2 के साथ ACSF के बाकी: 95% 2 हे गैस कमरे के तापमान पर।
    3. तैयार है और शल्य चिकित्सा उपकरण जीवाणुरहित भ्रूण से दिमाग फसल के लिए। इसके अलावा बर्फ की एक बाल्टी तैयार करते हैं।
    4. ~ 100 मिलीलीटर 4% कम पिघलने बिंदु agarose एक फ्लास्क में हीटिंग द्वारा एक माइक्रोवेव में समाधान करें। के बारे में 5 मिनट के लिए समाधान शांत हो जाओ इससे पहले कि यह जमना शुरू होता है।
    5. सीओ 2 की अधिक मात्रा से CMN-आला इंजेक्शन के बाद माउस 12-24 मानव संसाधन euthanize। पेट के क्षेत्र में बड़ी चीरों बनाओ, और ठीक कैंची और संदंश के साथ गर्भाशय से Electroporated / microinjected भ्रूण काटना।
    6. ठीक कैंची और संदंश के साथ भ्रूण से हार्वेस्ट दिमाग।
    7. एक 10 सेमी संस्कृति बर्फ बाल्टी पर रखा पकवान पर प्रत्येक मस्तिष्क रखें। एक तेज ब्लेड का उपयोग कर दो गोलार्द्धों फूट डालो, और हर जगहmidsagittal विमान डिश के तल को छूने के साथ पकवान पर गोलार्द्ध। जल्दी से दिमाग के ऊपर agarose समाधान (गोलार्द्ध प्रति 500 ​​μl के आसपास) पर डाल देना।
    8. एक तेज ब्लेड का उपयोग करना, वर्ग एक मस्तिष्क एम्बेडेड agarose ब्लॉक बनाने के लिए एक मस्तिष्क के आसपास agarose काटा।
    9. ऊतक चिपकने का उपयोग, vibratome के लिए एक पहाड़ पर agarose ब्लॉक की midsagittal विमान सतह के नीचे गोंद। पूर्व ठंडा ACSF के साथ vibratome चैम्बर भरें और कटौती 200 माइक्रोन बाण मस्तिष्क स्लाइस।
    10. 42 मिनट के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिमी म्यो -inositol, 0.4 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, और 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक ACSF में तीव्र स्लाइस सेते 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती जबकि: 95% 2 हे गैस।
    11. 42 मिनट के बाद, हीटर बंद कर देते हैं और बुदबुदाती के साथ कमरे में अस्थायी पर स्लाइस सेते जारी है। हीटर बंद करने के बाद पूरे सेल पैच रिकॉर्डिंग शुरू में कम से कम 15 मिनट।
  5. प्रकाश सक्रियण के साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग
    1. INTRAC तैयारellular समाधान 130 मिमी पोटेशियम gluconate, 4 मिमी MgCl 2, 5 मिमी HEPES, 1.1 मिमी EGTA, 3.4 मिमी ना 2 एटीपी, 10 मिमी सोडियम creatine फॉस्फेट, और पीएच 7.3 KOH के साथ समायोजित पर 0.1 मिमी ना 3 जीटीपी हैं।
    2. एक वाणिज्यिक micropipette खींचने का उपयोग 3-6 MΩ पिपेट प्रतिरोध करने की कांच इलेक्ट्रोड से पैच pipettes खींचो।
    3. पूरे सेल पैच clamping के लिए टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग सेट अप और 2 मिलीग्राम / एक छिड़काव पंप के साथ न्यूनतम दर पर ACSF के साथ रिकार्डिंग कक्ष superfuse। लगभग 33 डिग्री सेल्सियस के लिए कक्ष के तापमान को समायोजित करें।
      नोट: टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग एक छिड़काव चैम्बर, एक पानी विसर्जन उद्देश्य और एक तापमान नियंत्रक के साथ सुसज्जित है। इसके अलावा, GFP फिल्टर (उत्तेजना: 480/30 एनएम, उत्सर्जन: 535/40 एनएम) और mCherry फिल्टर (उत्तेजना: 580/20 एनएम उत्सर्जन: 675/130 एनएम) के लिए आवश्यक हैं।
      1. एक एक 45 डिग्री पर 1 सेमी दूर से केन्द्र बिन्दु को प्रकाश देने के लिए रिग पर माइक्रोस्कोप से 385 एनएम के उत्सर्जन के साथ एलईडी स्थापितकोण। एक प्रकाश बिजली मीटर के साथ एलईडी की शक्ति की जाँच करें।
    4. ध्यान से एक गिलास पिपेट और छिड़काव कक्ष में जगह के साथ एक मस्तिष्क टुकड़ा उठा। वीणा के साथ टुकड़ा दबाए रखें।
    5. Neocortical क्षेत्र 27 से mCherry / GFP प्रतिदीप्ति के साथ एक न्यूरॉन पैच। रिकार्ड Pirk गतिविधि वोल्टेज दबाना (वि दबाना) विधि का उपयोग कर। सबसे पहले, -60 एम वी पर झिल्ली क्षमता होती है। फिर, तय नकारात्मक झिल्ली क्षमता (-100 एम वी) या वोल्टेज रैंप (-100 एम वी 40 एम वी) पर रिकॉर्ड धाराओं। विशेष रूप से, -100 एम वी पर Kir2.1 विशिष्ट आवक धाराओं की निगरानी।
    6. मैन्युअल, या डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, न्यूरॉन के लिए एलईडी प्रकाश की एक नाड़ी (100 मिसे -1 सेकंड की अवधि की एक नाड़ी) फ्लैश जबकि रिकॉर्डिंग, और देखो अगर Pirk प्रोटीन सक्रिय कर रहे हैं। एक बार जब Pirk सक्रिय होता है, -100 एम वी पर आवक धाराओं में काफी वृद्धि होगी।
    7. 0.5 मिमी BaCl 2 स्नान में जोड़े और सत्यापित करें कि Pirk फिर से निष्क्रिय है।

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Representative Results

आनुवंशिक रूप से न्यूरॉन्स में एक प्रोटीन में एक UAA को शामिल करने के लिए, पहला महत्वपूर्ण कदम उचित जीन देने और न्यूरॉन्स में कुशलता जीन व्यक्त करने के लिए का निर्माण डिजाइन करने के लिए है। वहाँ UAA शामिल करने के लिए तीन आनुवंशिक घटक हैं: (1) टैग एम्बर रोक UAA समावेश (2) उत्परिवर्तित टैग स्टॉप कोडोन पहचान करने के लिए एक orthogonal tRNA, और (3) एक orthogonal अमीनोएसिल के लिए चुना स्थल पर शुरू की कोडोन के साथ लक्ष्य जीन -tRNA synthetase orthogonal tRNA पर UAA चार्ज करने के लिए। प्रत्येक घटक उचित प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाना चाहिए। ये तीन जीन कैसेट एक प्लाज्मिड में शामिल या कई plasmids में विभाजित किया जा सकता है। न्यूरॉन्स में Pirk को व्यक्त करने के लिए, फोटो प्रतिक्रियाशील UAA CMN orthogonal tRNA लियू CUA / CmnRS (CMN-tRNA synthetase) CMN 21,29 के लिए विशिष्ट होना करने के लिए विकसित जोड़ी का उपयोग Kir2.1 में शामिल किया है। Kir2.1 जीन के अवशेषों Cys169 टैग एम्बर स्टॉप कोडोन (Kir2 उत्परिवर्तित है।1-टैग), और फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCitrine Kir2.1 की सी टर्मिनस से जुड़े हुए है न्यूरोनल संस्कृति में Pirk अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए (चित्रा 1)।

अच्छी गुणवत्ता वाले न्यूरोनल संस्कृति प्राप्त करने के सफल Pirk प्रयोगों के लिए एक शर्त है। प्रसव के बाद दिन 1-4 Sprague Dawley चूहे पिल्ले आम तौर पर न्यूरोनल संस्कृति तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, अभी तक चूहे के भ्रूण को भी बार बार उपयोग किया जाता है। जब 1.0-1.5 x 10 5 सेल / अच्छी तरह घनत्व में 24 अच्छी तरह प्लेटें में coverslips पर चढ़ाया, एक बहुत ज्यादा नहीं microglia या अन्य मलबे (2A चित्रा) के साथ अच्छी तरह से अलग स्वस्थ न्यूरॉन्स को देखना चाहिए। स्वस्थ न्यूरॉन्स व्यापक प्रक्रिया है, और सेल निकायों (सोम) छप रहे हैं (चित्रा 2 बी)। विशिष्ट दिखाई suborganelle संरचना आम तौर पर अस्वस्थ संस्कृति का एक संकेत है। Neuronal संस्कृति 5% सीओ 2 में 35 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 सप्ताह के लिए बनाए रखा जा सकता है: 95% हवा humidified इनक्यूबेटर।

सीalcium फॉस्फेट (सीए-पी) अभिकर्मक एक बहुत ही सौम्य अभिकर्मक विधि संवेदनशील neuronal संस्कृति के लिए उपयुक्त है। हालांकि, यह न्यूरॉन्स में उच्च अभिकर्मक दक्षता हासिल करने के लिए चरम परिशुद्धता और सावधानी की आवश्यकता है। स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा करने के लिए, और अभिकर्मक के दिन पर 2x बीबीएस बफर बनाने के लिए मिलाया जरूरत है। सटीक पीएच समायोजन reproducibly सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। 2.5 एम 2 CaCl समाधान भी अभिकर्मक के दिन पर ताजा किया जाना चाहिए। सभी बफ़र्स फ़िल्टर किया जा करने की जरूरत है। इसके अलावा, उच्च शुद्धता और गुणवत्ता के साथ नए सिरे से डीएनए plasmids परिणामों में सुधार होगा। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक ताजा डीएनए मिनी तैयार नहीं प्राप्त कर ऊंचा हो गया कोलाई संस्कृति से कर सकते हैं (~ मिलाते इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा)। के बाद सभी बफ़र्स तैयार हैं, टिशू कल्चर हुड में समाधान लाने और अभिकर्मक के लिए तैयार करते हैं। एक कम गति पर एक भंवर का उपयोग, अभिकर्मक समाधान आंदोलन मिश्रण है। इसके तत्काल बाद न्यूरोनल घन को मिश्रित समाधान जोड़नेlture, और संस्कृति पकवान वापस इनक्यूबेटर लाने के लिए। 45 मिनट -1 घंटे के बाद अभिकर्मक बंद करो, और मूल विकास मीडिया निरंतर ऊष्मायन के लिए संस्कृति को वापस जोड़ने। ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स 6 घंटा से देखे जा सकते हैं के बाद अभिकर्मक (चित्रा 3) समाप्त होता है। संस्कृति मीडिया में CMN की उपस्थिति में, Pirk व्यक्त किया है और Pirk व्यक्त न्यूरॉन्स mCitrine प्रोटीन Pirk के सी टर्मिनल (चित्रा 3 डी) से जुड़े हुए होने के कारण हरी फ्लोरोसेंट हैं। Pirk व्यक्त न्यूरॉन्स सामान्य बेसल शरीर क्रिया विज्ञान है और वे इंजेक्शन धाराओं (चित्रा 4) के जवाब में कार्रवाई की क्षमता फायरिंग में सक्षम हैं। हालांकि, कार्रवाई क्षमता की इस श्रृंखला में एक संक्षिप्त प्रकाश नाड़ी सेल (चित्रा -4 ए) के चमकने के साथ तुरंत दबा दिया जाता है। 0.5 मिमी BaCl 2, एक Kir2.1 विशिष्ट अवरोध, स्नान के लिए कहा जाता है, neuronal फायरिंग तो फिर से शुरू है, यह दर्शाता है कि पिछले दमन एल द्वारा Kir2.1 के सक्रियण की वजह से थाight (चित्रा 4 बी)। Untransfected नियंत्रण न्यूरॉन्स प्रकाश या बीए 2 + (चित्रा 4C, डी) का जवाब नहीं है।

विवो में Pirk को व्यक्त करने के लिए, अत्यधिक शुद्ध और केंद्रित डीएनए plasmids (2-5 माइक्रोग्राम / μl) तैयार किया जाना चाहिए। इन प्रयोगों में इस्तेमाल विशिष्ट plasmids चित्रा 5 ए में दिखाया जाता है। Orthogonal tRNA लियू CUA / CmnRS जोड़ी और लक्ष्य Kir2.1 टैग जीन, एक जीन एक टैग उत्परिवर्तन (GFP-टैग) के साथ हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोडिंग के अलावा भी एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के रूप में सह-electroporated है। GFP प्रतिदीप्ति का पता लगाने, सभी तीन plasmids के सफल प्रसव का संकेत होता है के बाद से GFP में टैग दमन की आवश्यकता होगी दोनों tRNA लियू CUA और CmnRS; GFP टैग में CMN समावेश अच्छी तरह Kir2.1-Tagas में CMN समावेश सुझाव है, क्योंकि दोनों जीन एक ही सेल में मौजूद हैं। तीन जीन निर्माणों सभी Inje हैंE14.5 पर माउस भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल (चित्रा 5 ब, बाएं पैनल) में cted। electroporation के बाद, भ्रूण के विकास को जारी रखने की अनुमति देने के लिए उदर गुहा को भ्रूण वापसी। दो दिन बाद, electroporated पक्ष या पार्श्व वेंट्रिकल के दोनों पक्षों के बारे में 2-5 μl CMN-अला (500 मिमी) इंजेक्षन डीएनए इंजेक्शन (चित्रा 5 ब, मध्यम पैनल) के रूप में समान तरीके से। फिर, सतत विकास के लिए उदर गुहा को भ्रूण वापसी। भ्रूण इमेजिंग या electrophysiological assays के लिए E17.5 पर काटा जा सकता है। जैसी कि उम्मीद थी, केवल CMN-आला इंजेक्शन के साथ, हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं माउस नियोकॉर्टेक्स में मनाया जाता है। दोनों लाल और हरे रंग की रोशनी के साथ कोशिकाओं CMN Kir2.1 टैग में शामिल किया जाना चाहिए था Pirk चैनल (चित्रा 6A) बनाने के लिए। भ्रूण neocortical टुकड़ा से पूरे सेल रिकॉर्डिंग इसी तरह से किया जाता है क्योंकि यह न्यूरोनल संस्कृति पर किया जाता है। हरे और लाल फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स ne में कोई आवक चालू हैgative संभावित पकड़े, लेकिन प्रकाश की एक संक्षिप्त नाड़ी तेजी से आवक वर्तमान (चित्रा 6B) को सक्रिय करता है। वर्तमान में पूरी तरह से बा 2 + उनका कहना है, इस बात की पुष्टि की कि वह Pirk द्वारा उत्पन्न होता है द्वारा अवरुद्ध है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Pirk न्यूरॉन संस्कृति योजना न्यूरोनल संस्कृति में Pirk अभिव्यक्ति के लिए अनुकरणीय प्लाज्मिड डिजाइन दिखाने के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड सेट। शीर्ष प्लाज्मिड के तहत cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर C169 साइट में एक भी अमीनो एसिड उत्परिवर्तन के साथ Kir2.1 जीन (ग्रे) encodes। C169 टैग एम्बर स्टॉप कोडोन, जहां UAA CMN शामिल किया जाएगा करने के लिए उत्परिवर्तित है। Kir2.1 जीन mCitrine जीन (हरा) द्वारा पीछा किया जाता है। mCitrine Pirk व्यक्त कोशिकाओं कल्पना करने के लिए Kir2.1 जीन के सी टर्मिनल से जुड़े हुए है। नीचे प्लाज्मिड CmnRS (गुलाबी), CMN विशिष्ट synthetase, माउस phosphoglycerate काइनेज-1 (mPGK) प्रमोटर द्वारा संचालित encodes। tRNA > लियू CUA (नीला), orthogonal tRNA 21, भी एच 1 प्रमोटर द्वारा संचालित एक ही प्लाज्मिड में व्यक्त किया जाता है, लेकिन एक विपरीत दिशा में।

चित्र 2
चित्रा 2: चूहे के हिप्पोकैम्पस प्राथमिक neuronal संस्कृति अनुकरणीय स्वस्थ चूहे हिप्पोकैम्पस neuronal संस्कृतियों तस्वीरें दिखा।। (ए) एक डीआईसी इन विट्रो में 10 दिनों पर न्यूरोनल संस्कृति की छवि (DIV)। के रूप में वे dendrites और एक्सोन बाहर शाखा न्यूरॉन्स परिपक्व। Microglia कोशिकाओं (प्रक्रियाओं के बिना छोटे और गोल कोशिकाओं) एक समय में होना है, लेकिन संस्कृति डूब नहीं है। (बी) स्वस्थ सभ्य न्यूरॉन्स के एक बढ़ाया डीआईसी छवि। एक स्वस्थ न्यूरॉन मोटा सेल शरीर (सोम) दर्शाती है और स्पष्ट डेन्ड्राइट / एक्सोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3:। सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स में Pirk अभिव्यक्ति डीआईसी और इन विट्रो में सुसंस्कृत और Pirk अभिव्यक्ति के लिए चित्र 1 में दर्शाया जीन निर्माणों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चूहे hippocampal न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति छवियों। CMN अभिकर्मक (ए और बी) के बाद संस्कृति में नहीं जोड़ा जाता है, कोई हरी प्रतिदीप्ति न्यूरॉन्स से पता चला है। विकास मीडिया में CMN (1 मिमी) की उपस्थिति में, ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स, पूर्ण लंबाई Pirk-mCitrine प्रोटीन व्यक्त करने में सक्षम हैं इस प्रकार दिखा हरी प्रतिदीप्ति (सी और डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4:। Pirk के प्रकाश सक्रियण चूहे hippocampal न्यूरॉन्स से फायरिंग दबा (ए) एक प्रकाश नाड़ी हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन Pirk व्यक्त की गतिविधि को रोकता है। प्रतिनिधि वोल्टेज निशान वर्तमान दबाना में लगातार दर्ज हैं। कार्रवाई संभावित फायरिंग 20 पीए वर्तमान इंजेक्शन (आई-कदम) द्वारा पैदा की है। प्रकाश जोखिम (385 एनएम, 40 मेगावाट / 2 सेमी, 1 सेकंड, तीर के साथ संकेत) तेजी से और पूरी तरह से neuronal फायरिंग दबा। फायरिंग बाह्य 500 मिमी BaCl 2, जो चुनिंदा Kir2.1 चैनलों को रोकता के साथ बहाल है। (बी) पराबैंगनी (यूवी) रोशनी (385 एनएम, 40 मेगावाट / 2 सेमी, 6 सेकंड; पीले बॉक्स के साथ संकेत) नियंत्रण, untransfected न्यूरॉन्स की उत्तेजना को बदल नहीं है। कार्रवाई संभावित फायरिंग में 50 पीए वर्तमान इंजेक्शन (आई-कदम) द्वारा पैदा की है। (सी और डी) न तो यूवी रोशनी है और न ही BaCl 2 (500 मिमी) नियंत्रण न्यूरॉन्स की उत्तेजना को प्रभावित करता है। कार्रवाई शक्तिशालीial 50 पीए वर्तमान इंजेक्शन (आई-कदम) द्वारा पैदा की है।

चित्रा 5
चित्रा 5: विवो में माउस नियोकॉर्टेक्स में Pirk अभिव्यक्ति के लिए प्रक्रियाओं। (ए) Pirk प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की स्थापना की। शीर्ष प्लाज्मिड: सीएजी प्रमोटर और mCherry आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) के माध्यम से संचालित CmnRS के लिए प्लाज्मिड। mCherry प्रतिदीप्ति CmnRS के सफल अभिव्यक्ति को सत्यापित करेंगे। मध्य प्लाज्मिड: tRNA लियू CUA, CMN समावेश 21 के लिए ओर्थोगोनल tRNA के तीन प्रतियों के साथ मिलकर Kir2.1 जीन के लिए प्लाज्मिड। नीचे प्लाज्मिड: GFP_Y182 टैग के लिए प्लाज्मिड। GFP के लिए जीन साइटों 21 को टैग करने CMN के सफल समावेश कल्पना करने के लिए अनुमोदक Tyr182 स्थल पर एक एम्बर स्टॉप कोडोन (GFP_Y182 टैग) के साथ इंजीनियर है। (बी) कार्टून थानेदारविंग विवो में Pirk अभिव्यक्ति के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया। Pirk अभिव्यक्ति के लिए जीन निर्माणों माउस नियोकॉर्टेक्स (E14.5) में इंजेक्शन कर रहे हैं और गर्भाशय (बाएं पैनल) में electroporated। दो दिन बाद, CMN-आला electroporated पक्ष में वेंट्रिकल या मस्तिष्क गोलार्द्धों के दोनों ओर (मध्यम पैनल) को इंजेक्ट किया जाता है। स्लाइस इमेजिंग और electrophysiological परख E17.5-E18.5 (सही पैनल) पर प्रदर्शन किया जा सकता है।

चित्रा 6
चित्रा 6: माउस नियोकॉर्टेक्स और प्रकाश सक्रियण में Pirk अभिव्यक्ति। माउस भ्रूण cortical GFP और इन विवो में Kir2.1 प्रोटीन में CMN के समावेश दिखा न्यूरॉन्स की (ए) प्रतिदीप्ति छवियों। चित्रा 5 ए में तीन जीन निर्माणों गर्भाशय में electroporated रहे हैं। mCherry प्रतिदीप्ति CMN विशिष्ट Synthe के सफल अभिव्यक्ति को दर्शाता हैTase जीन, CmnRS। GFP प्रतिदीप्ति केवल CMN-आला इंजेक्शन (नीचे) के साथ पाया जाता है, GFP टैग और Kir2.1 टैग में होने की संभावना CMN समावेश में CMN समावेश का संकेत है। इस प्रकार, हरे और लाल प्रतिदीप्ति सभी तीन प्लास्मिड और CMN समावेश के सफल अभिव्यक्ति इंगित करता है। (बी) neocortical Pirk की रोशनी पर निर्भर सक्रियण दिखा न्यूरॉन्स चूहों से दर्ज की धाराओं के चतुर्थ साजिश है। दो दिनों के बाद चित्रा 5 ए में जीन निर्माणों electroporated थे, CMN-आला गर्भाशय में इंजेक्ट किया गया था; CMN-आला इंजेक्शन के बाद 12-48 घंटा, neocortical तीव्र स्लाइस भ्रूण से तैयार थे। Pirk व्यक्त स्लाइस में न्यूरॉन्स, दोनों लाल और हरे रंग की रोशनी से पता लगाया है, इससे पहले (काला) दर्ज कर रहे हैं और (नीला) प्रकाश जोखिम (385 एनएम, 8 मेगावाट / 2 सेमी, संतृप्त तक पहुंचाने के लिए 10 सेकंड) के बाद। BaCl 2 (500 मिमी) photoactivation (नारंगी) के बाद Pirk विशेष धाराओं को सत्यापित करने के लिए कहा है।

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Discussion

प्रभावी तस्वीर-मॉडुलन को प्राप्त करने के लिए, महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम के बारे में फैसला करने के लिए जहां लक्ष्य प्रोटीन में photoresponsive UAA शामिल है। लक्ष्य प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी के उम्मीदवार साइटों के चयन के मार्गदर्शन के लिए बहुत उपयोगी है। इसी समय, प्रकाश विनियमन के उद्देश्य का निर्धारण होता है जो साइट सबसे उपयुक्त है। उम्मीदवार साइटों को चुनने के बाद, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए और इन विवो में आगे बढ़ने से पहले इस तरह के मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) आसान संस्कृति और हेरफेर के लिए कोशिकाओं, के रूप में स्तनधारी सेल लाइनों में साइटों का परीक्षण करने के लिए सलाह देते हैं। Kir2.1 photoactivation के लिए एक साइट की पहचान करने के लिए, Kir2.1 की ताकना साथ कई साइटों के शुरू में HEK कोशिकाओं में परीक्षण किया गया है। Kir2.1 की C169 इष्टतम पाया गया था, क्योंकि Kir2.1 ताकना आकार जहां C169 रहता काफी बड़ा CMN पक्ष श्रृंखला को समायोजित करने के लिए, लेकिन छोटे पर्याप्त है CMN पक्ष श्रृंखला आयनिक पारित होने को ब्लॉक करने के लिए। CMN Kir2.1 में C169 पर शामिल किया गया था जब HEK कोशिकाओं में व्यक्त, टीवह परिणामी उत्परिवर्ती Kir2.1 निष्क्रिय था, लेकिन प्रकाश की एक छोटी pule पर सक्रिय है, सफल Pirk विकास 21 की पुष्टि हो गया।

Orthogonal tRNA के कुशल अभिव्यक्ति और synthetase कोशिकाओं में और vivo में उच्च UAA समावेश दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। orthogonal synthetase जीन कुशलता पोलीमर्स द्वितीय प्रमोटर और पाली-ए संकेतों अक्सर स्तनधारी कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में प्रयोग किया जाता का उपयोग कर व्यक्त किया है। ऐसे एच 1 यहां इस्तेमाल प्रमोटर के रूप में ओर्थोगोनल tRNA, एक विशेष प्रकार -3 पोलीमर्स III प्रमोटर की अभिव्यक्ति, एक साथ एक 3'-flanking अनुक्रम के साथ के लिए के रूप में पहले 18,20 वर्णित की जरूरत है। इन विवो पढ़ाई के लिए, हमने पाया है कि tRNA अभिव्यक्ति कैसेट की तीन प्रतियां एक प्रतिलिपि (चित्रा 5 ए) की तुलना में वृद्धि हुई CMN समावेश दक्षता। स्तनधारी कोशिकाओं में एक अन्य अध्ययन में tRNA अभिव्यक्ति कैसेट की संख्या में वृद्धि भी UAA समावेश दक्षता 30 की वृद्धि हुई। थेरefore, हम अलग अलग UAAS, कोशिकाओं, और लक्ष्य प्रोटीन के लिए tRNA अभिव्यक्ति कैसेट की संख्या के अनुकूलन सुझाव है कि जब UAA समावेश दक्षता में सुधार की जरूरत है। कोशिकाओं में और vivo में UAAS की bioavailability UAA शामिल करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि UAAS की एस्टरीफिकेशन स्तनधारी कोशिकाओं 31 में अपने तेज बढ़ता है, और dipeptide रूप में UAAS की है कि तैयारी Caenorhabditis एलिगेंस 32 में कोशिकाओं में UAA तेज बढ़ जाती है। हमने पाया है कि सीधे न्यूरोनल संस्कृति मीडिया के लिए CMN खिलाने के लिए पर्याप्त के लिए Kir2.1 में CMN समावेश सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स में व्यक्त की, लेकिन इन विवो 21 में माउस मस्तिष्क में शामिल करने के लिए अपर्याप्त है। इसलिए, dipeptide CMN-आला संश्लेषित और माउस मस्तिष्क में इंजेक्ट किया गया था। Oligopeptide ट्रांसपोर्टर PEPT2 अत्यधिक कृंतक दिमाग 33 है, जो न्यूरॉन्स में dipeptide के परिवहन की सुविधा हो सकती में व्यक्त किया जाता है। भाँति Dipeptide शामिल करने के लिए UAA CMN उपज के लिए सेलुलर peptidases द्वारा hydrolyzed किया जाएगा। दरअसल, इस अनुकूलन के साथ हम कुशल CMN समावेश न्यूरोनल प्रोटीन में भ्रूण माउस मस्तिष्क के कई क्षेत्रों, नियोकॉर्टेक्स, चेतक और हाइपोथेलेमस 21 सहित कम से हासिल की।

न्यूरॉन्स में सफल Pirk अभिव्यक्ति स्वस्थ neuronal संस्कृति की तैयारी पर दृढ़ता से निर्भर करता है। प्रोटोकॉल में हर कदम पर एक सटीक और सूक्ष्म तरीके से किया जाना चाहिए। संस्कृति तैयारी के बाद, यह अशांति के बिना इनक्यूबेटर में संस्कृति को बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा है। खुलने और इनक्यूबेटर दरवाजा बंद करने के साथ ही साथ में और इनक्यूबेटर से बाहर संस्कृति पकवान चलती है, संस्कृति की गुणवत्ता को कम करने के लिए जोड़ सकते हैं। लोअर इनक्यूबेटर तापमान (35 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस के बजाय) में मदद करता है excitotoxicity कम। एक समान पर ध्यान दें, CA-पी अभिकर्मक अतिरिक्त सावधानी से किया जाना चाहिए। 2x बीबीएस बफर की तैयारी एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एक अच्छा विचार है कैलीपीएच 6.90-7.15 के बीच 2x बीबीएस बफर के लिए इष्टतम पीएच brate, के बाद से नए डीएनए निर्माणों या preps अभिकर्मक शर्तों को बदल सकता है। बफर पीएच 0.01 अंक में परिशुद्धता के साथ समायोजित किया जा सकता है अगर यह अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए मदद करता है। अभिकर्मक के लिए पहले, न्यूरोनल संस्कृति का विकास मीडिया ताजा एक साथ बदल दिया है। यह मूल विकास मीडिया बचाने के लिए, और मूल स्थिति बहाल करने के लिए संस्कृति को वापस जोड़ने अभिकर्मक के बाद करने के लिए महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक के बाद नए सिरे से मीडिया में न्यूरॉन संस्कृति को बनाए रखने, ठीक से न्यूरॉन्स के साथ हस्तक्षेप के बाद से यह इस तरह के न्यूरॉन्स से रिहा वृद्धि कारक के रूप में सेल प्रसार के लिए महत्वपूर्ण अणुओं का अभाव होता है।

संवर्धित कोशिकाओं और ऊतकों स्लाइस में Pirk के प्रकाश सक्रियण, समुचित प्रकाश स्रोत और वितरण पद्धति के लिए निर्धारित किए जाने की जरूरत है। CMN लंबी और मध्यम लहर यूवी लाइट (280-400 एनएम) अवशोषित। हालांकि, यूवी प्रकाश के संपर्क बढ़ा है, खासकर छोटी तरंग दैर्ध्य यूवी प्रकाश के लिए, कोशिकाओं के लिए हानिकारक होगा। सैम परई समय, दूर-लाल बत्ती नमूना कोशिकाओं perturbing गर्मी सकता। इसलिए, एक एकल तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन के साथ एक एलईडी Pirk सक्रियण के लिए सबसे अच्छा है। चयनित किया गया था; CMN photolysis के लिए, एक 385 एनएम (Prizmatix ~ 40 मेगावाट) के उत्सर्जन के साथ एलईडी। एलईडी बाह्य माइक्रोस्कोप के पास स्थापित किया गया है, और एक ऑप्टिकल फाइबर ध्यान में न्यूरॉन को ठीक प्रकाश देने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डाटा अधिग्रहण के लिए, ऑप्टिकल फाइबर 1 सेमी ध्यान में न्यूरॉन से एक 45 डिग्री के कोण पर दूर की स्थापना की है। नमूना पर प्रकाश की शक्ति 40 मेगावाट / 2 सेमी मापा गया था। यह भी समय समय पर एलईडी प्रदर्शन एक ऑप्टिकल बिजली मीटर का उपयोग कर जांच करने के लिए सिफारिश की है।

हम दिखाना आनुवंशिक रूप से विवो में UAAS शामिल करने के लिए एक प्रभावी तकनीक है कि utero electroporation में। माउस भ्रूण नियोकॉर्टेक्स में प्लाज्मिड DNAs की utero electroporation में के रूप में पहले 34 में वर्णित है, मामूली संशोधनों के साथ किया जाता है। neonata में Pirk प्रोटीन व्यक्त करनेएल माउस दिमाग, दो सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं (चित्रा 5 ब)। पहला कदम electroporation द्वारा पीछा किया Pirk अभिव्यक्ति के लिए जीन निर्माणों इंजेक्षन है। दो दिन बाद, दूसरा दिमाग इंजेक्शन CMN-आला देने के लिए किया जाता है। यह अभ्यास की आवश्यकता होती प्रवीण भी ज्यादा जानवरों बल देते हुए बिना सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए होगा। प्रत्येक सर्जरी के बाद, जानवरों के बाद देखा और वसूली के दौरान एक नियमित आधार पर जाँच की जानी चाहिए। मस्तिष्क में CMN की पर्याप्त और समय पर उपलब्धता उचित Pirk अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है। CMN-अला (500 मिमी) के 2-5 μl आम तौर पर एक भ्रूण के मस्तिष्क को इंजेक्ट किया जाता है। कभी कभी, उस पर दोनों electroporated और विपरीत गोलार्द्ध, CMN-आला के बाद से विपरीत दिशा से वेंट्रिकल में CMN-आला इंजेक्षन करने के लिए विस्तारित CMN आपूर्ति के लिए electroporated पक्ष को फैलाना होगा मदद करता है। Utero electroporation में के सामान्य उपयोगिता को देखते हुए, इस तकनीक neocortical न्यूरॉन्स के लिए, लेकिन यह भी न्यूरॉन्स के लिए न केवल लागू किया जा सकताऐसे स्ट्रिएटम, diencephalon, और सेरिबैलम, जब electroporation / इंजेक्शन साइट प्रत्येक क्षेत्र के लिए निकाला जाता है के रूप में मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में। भ्रूण / नवजात दिमाग वयस्क दिमाग से बहुत नरम हैं, तो यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए तीव्र स्लाइस पाने के लिए मुश्किल होगा। Agarose embedding vibratome काटने के लिए भ्रूण मस्तिष्क संरचना को स्थिर मदद करता है। हालांकि कम पिघलने बिंदु agarose मस्तिष्क के ऊतकों को तापमान सदमे को कम करता है, सावधानी जब agarose ठंड दिमाग पर पिघल डालने का कार्य की जरूरत है। agarose embedding से ऊतकों को तापमान सदमे का असर पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान unnoticeable था।

आनुवंशिक रूप से सभ्य न्यूरॉन्स में और vivo में photoresponsive UAAS एन्कोडिंग, यहाँ Pirk द्वारा उदाहरण, होगा उनके पैतृक वातावरण में प्रकाश के साथ विभिन्न न्यूरोनल प्रोटीन गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए एक optogenetic तकनीक बनती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल Pirk अभिव्यक्ति और सक्रियण प्रयोगों मैं प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया को प्रस्तुत करता हैn इन विट्रो और इन विवो में कृंतक दिमाग, स्तनधारी दिमाग में उपयोग के लिए UAA प्रणाली की पहली सफल विकास का प्रतिनिधित्व करने में neuronal संस्कृति। यह कई प्राकृतिक प्रोटीन के अनुसंधान, साथ ही रोगों में अपने निहितार्थ के लाभ के लिए क्षमता है। उदाहरण के लिए, α अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर्स और एन मिथाइल-D-aspartate (NMDA) रिसेप्टर्स Kir2.1 चैनलों के साथ इसी तरह transmembrane संरचनाओं का हिस्सा है। यह इसलिए इन ligand-गेटेड आयन चैनल को Pirk पद्धति लागू करने के लिए संभव होगा। इसके अलावा, Pirk तकनीक को भी इस तरह के एंडरसन की सिंड्रोम और हृदय कम क्यूटी सिंड्रोम 35,36 के रूप में Kir2.1 संबंधित आनुवंशिक रोगों के pathophysiology संबोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। करने के लिए "ब्लॉक और रिलीज" इसके अलावा CMN के माध्यम से Cys, ऐसे tyrosine, सेरीन, लाइसिन, ग्लूटामेट, aspartate, और ग्लाइसिन के रूप में कई अमीनो एसिड अलग photoreleasable समूह 37 के साथ बंदी किया गया है। इस प्रकार, इसी तरह की रणनीति उपयोग किया जा सकताघ इन विट्रो में और vivo में न्यूरॉन्स में इन अमीनो एसिड तस्वीर-विनियमित। इसके अलावा, प्रतिवर्ती ऑप्टिकल नियंत्रण UAAS azobenzene युक्त साथ प्राप्त किया जा सकता है, और इस तरह के UAAS अब आनुवंशिक रूप से ई में इनकोडिंग कर दिया गया है कोलाई और स्तनधारी कोशिकाओं 38,39।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल एक सामान्य विधि प्रकाश के साथ उनके पैतृक सेटिंग्स में neuronal प्रोटीन की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए प्रस्तुत करता है। अन्य optogenetic opsin-परिवार और अन्य प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन या डोमेन को शामिल तरीकों की तुलना में, इस विधि आनुवंशिक रूप से प्रकाश के प्रति संवेदनशील UAAS और परिवर्तन केवल एक ही अवशेषों इनकोडिंग उपयोग करता है। इसलिए, यह समारोह, तस्करी और अध्ययन के तहत लक्ष्य प्रोटीन का स्थानीयकरण करने के लिए कम से कम हस्तक्षेप करना चाहिए था। उच्च साइट-चयनात्मकता भी इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रकाश उत्तरदायी UAAS साथ प्राप्त किया जा सकता है अधिक से अधिक लचीलापन और विस्तृत आणविक जांच के लिए विशिष्टता प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल भी पहली सह प्रदान करता हैmprehensive, आसान करने के लिए का पालन करें प्रक्रिया कैसे सफलतापूर्वक इन विट्रो में और vivo में न्यूरॉन्स में प्रोटीन में UAAS शामिल करने के लिए। इन विट्रो में न्यूरॉन्स और इन विवो में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग UAAS के माध्यम से सामान्य प्रोटीन के ऑप्टिकल नियंत्रण एक महान क्षमता दोनों बुनियादी और translational विज्ञान के लाभ के लिए है, और इस प्रोटोकॉल के अपने आवेदन को बढ़ावा देने में मदद मिलेगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 109 अप्राकृतिक अमीनो एसिड आनुवंशिक कोड एम्बर दमन आयन चैनल optogenetics प्रकाश सक्रियण ऑप्टिकल नियंत्रण photocage न्यूरॉन neuronal गतिविधि मस्तिष्क
एक neuronal प्रोटीन न्यूरॉन्स में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग अप्राकृतिक एमिनो एसिड का उपयोग की ऑप्टिकल नियंत्रण
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Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

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