Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

مقارنة التحفيز الكهربائي التقليدي، ضوئي يقدم أكبر القرار الزماني والمكاني مع الحد الأدنى من التدخل في النظام الفسيولوجي للعينات. منذ المظاهرة استخدام الليزر لتحفيز الخلايا العصبية في عام 1971 1، وقد تم اختراع العديد من الطرق الإبداعية للسيطرة خارجيا نشاط الخلايا العصبية مع الضوء. وقد استخدمت الافراج البصري للمنبهات photocaged فترة طويلة لدراسة الاستجابة الفسيولوجية للشبكة العصبية للجين 2،3،4. هذه التقنية محدودة خصوصية بسبب نشر منبهات قفص. ويتحقق خصوصية الوراثية بالإعراب عن ectopically قنوات أوبسين حساسة للضوء ومضخات 5،6،7، وقد تم تطبيقه بنجاح لتعديل الشبكات العصبية مختارة في الكائنات نموذج متنوعة. ومع ذلك، فإنه سيكون من الصعب تطبيق هذه الطريقة للسيطرة بصريا مختلف البروتينات العصبية الأخرى، منذ تطعيم photoresponsiveness من البروتينات أوبسين للبروتينات أخرى عواد تتطلب الهندسة المكثفة التي قد تغير الخصائص الطبيعية للبروتين قيد الدراسة. الربط كيميائيا ليجند حساس خارجي إلى البروتين وقد أثبتت طريقة أخرى للسيطرة على وظائف بروتينات قناة 8،9،10. وقدم يجند أو سحبها من موقع ملزم من البروتين من خلال الايزوميرة الضوئية شاردة آزوبنزين. الكيمياء الربط يحد من تطبيق أساسا إلى الجانب خارج الخلية من بروتينات الغشاء، باستثناء الجانب داخل الخلايا والبروتينات داخل الخلايا.

Photoresponsive Uaas، بعد أن تدرج في البروتينات، وتوفير استراتيجية عامة لمعالجة البروتينات مع الضوء. في الجهود المبكرة، tRNAs acylated كيميائيا مع وmicroinjected Uaas photocaged إلى البويضات القيطم لدمج Uaas إلى مستقبلات الغشاء والقنوات الأيونية 11، التي تقدمت فهم العلاقات هيكل وظيفتها 12،13،14.ويقتصر هذا النهج حقن مكروي أساسا إلى البويضات كبيرة. التأسيس الجيني للUAA يتجاوز تحديا تقنيا الحمض الريبي النووي النقال أسيلة وحقن مكروي باستخدام زوج الحمض الريبي النووي النقال / مخلقة متعامد، الذي يتضمن UAA عن طريق الترجمة البروتين الذاتية في الخلايا الحية 15،16،17،18. وقد تجلى UAA التأسيس إلى بروتينات الخلايا العصبية في الخلايا العصبية الأولية والخلايا الجذعية العصبية 19،20. وفي الآونة الأخيرة، تم دمج photoresponsive UAA وراثيا في بروتين الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات في الجسم الحي لأول مرة 21. هذه التطورات تجعل من الممكن لدراسة البروتينات العصبية مع Uaas في البيئة الخلوية الأصلية الخاصة بهم.

تصحيح باطنه قناة البوتاسيوم Kir2.1 هو المعدل القوي الذي يمر K + التيارات بسهولة أكبر إلى من خارج الخلية، وأنه من الضروري في تنظيم العمليات الفسيولوجية بما في ذلك استثارة الخلايا، لهجة الأوعية الدموية ومعدل ضربات القلب، وإعادةتدفق الملح نال والأنسولين إطلاق سراح 22. overexpression من Kir2.1 hyperpolarizes إمكانات غشاء الخلايا العصبية المستهدفة، والتي تصبح أقل منفعل 23،24. للسيطرة على بصريا Kir2.1 في الخلايا موطنه الأصلي، كانغ وآخرون. أدرجت وراثيا، صور تستجيب أوا إلى Kir2.1 أعرب في خلايا الثدييات، الخلايا العصبية وأدمغة فئران جنينية 21. وكان نبضة قصيرة من ضوء قادرة على تحويل أوا إلى الأحماض الأمينية الطبيعية السيستئين، وبالتالي تفعيل الهدف البروتين Kir2.1. عندما أعرب عن هذا الصورة محرض تصحيح باطنه البوتاسيوم (PIRK) بروتين قناة في الفئران الخلايا العصبية الأولية الحصين، قمعت إطلاق الخلايا العصبية في استجابة لتفعيل الضوء. وبالإضافة إلى ذلك، أعرب عن قناة PIRK في القشرة المخية الحديثة الماوس الجنينية، وتم قياس PIRK الحالية تفعيلها للضوء في الخلايا العصبية القشرية. التنفيذ الناجح للتكنولوجيا UAA في الجسم الحي في أدمغة الثدييات يفتح الباب للسيطرة على بصريا بروتينات الخلايا العصبيةفي بيئتهم المحلية، الأمر الذي سيمكن تشريح البصرية من العمليات والآليات العصبية على المستوى الجزيئي.

في هذا البروتوكول وصفنا إجراءات التأسيس الجيني للUaas في الخلايا العصبية الأولية في الثقافة وفي مخ الفأر الجنينية في الجسم الحي. وتستخدم photoresponsive UAA CMN وKir2.1 لتوضيح هذه العملية. طرق لتقييم نجاح التأسيس UAA والسيطرة البصرية من نشاط البروتين الخلايا العصبية يتم توفيرها. هذا البروتوكول يوفر دليلا واضحا على ترميز وراثيا Uaas في الخلايا العصبية وفي الجسم الحي، وتنظيم بصريا وظيفة بروتين الخلايا العصبية عن طريق UAA photoresponsive. ونحن نتوقع هذا البروتوكول لتسهيل اعتماد تكنولوجيا في الجسم الحي أوا لعلم الأعصاب وعلم البصريات الوراثي الدراسات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات في الدراسة الحالية باستخدام المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وافق بروتوكولات التعامل مع الحيوانات في معهد سالك للدراسات البيولوجية، لا جولا، كاليفورنيا.

1. UAA التأسيس في Kir2.1 والتعبير عن الناتجة PIRK في الخلايا العصبية الثقافة الابتدائية

  1. البناء الحمض النووي
    1. تحديد موقع الهدف من Kir2.1 لأوا التأسيس. استغلال المعرفة السابقة والمعلومات حول بنية ووظيفة Kir2.1، حتى أن الموقع المختار مع photoresponsive UAA إنكوربوريتد يمكن تعديل البصرية وظيفة Kir2.1 21.
    2. بناء المؤتلف ترميز الحمض النووي Kir2.1 الجينات مع الموقع المختار تحور إلى TAG العنبر وقف كودون. استخدام تقنيات الاستنساخ القياسية 25 إلى استنساخ الحمض النووي Kir2.1-TAG إلى التعبير البلازميد الثدييات.
    3. الجينات / مخلقة استنساخ الحمض الريبي النووي النقال التي هي محددة لUAA ودمج UAA ردا علىكودون وقف TAG إلى التعبير الثدييات آخر البلازميد 21.
      ملاحظة: للحصول على أفضل التأسيس UAA والمروجين ومجموعات من أشرطة الجينات مختلف (على الحمض الريبي النووي النقال، مخلقة، وKir2.1) يمكن اختبارها في البلازميدات مختلفة.
    4. الحصول السلطات الوطنية المعينة بلازميد عالية الجودة باستخدام miniprep أو maxiprep مجموعات تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. حوالي 1.9 نسبة 260/280 هو الأمثل لالحمض النووي المنقى. عند الضرورة، إجراء الكهربائي للهلام الاغاروز للتحقق نقاء هيأهم DNA 25. Supercoiled السلطات الوطنية المعينة بلازميد مع نقاء عالية هي أفضل لترنسفكأيشن الخلايا العصبية.
  2. ثقافة الجرذ الحصين الابتدائية الخلايا العصبية
    1. coverslips مكان الزجاج (الدوائر، و 12 ملم في القطر) في 24 لوحات جيدة، ساترة واحدة على كل جانب، ومعطف كل بئر مع 250 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل بولي-D-ليسين (في 100 ملي العازلة بورات: 1.24 ز البوريك حامض و1.90 ز بورات ثنائي الصوديوم في 400 مل من منزوع الأيونات المقطر H 2 O أو [ده 2
    2. في يوم من تشريح، وجمع أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران الوليدة بعد الولادة (1-4 يوم ما بعد الولادة) بعد التخدير لهم مع isoflurane، وقطع رأس. تخدير الجراء في غرفة التخدير التي تحتوي على الأيزوفلورين (2-4٪). الانتظار حتى يفقد وعيه وتفشل في الاستجابة للمؤثرات عن طريق اللمس ومعسر من الكفوف.
    3. باستخدام تقنية القياسية 26، تشريح الحصين من المخ في الحارة (~ 37 درجة مئوية) المالحة (10 ملي HEPES و 20 ملي مد الجلوكوز وأضاف في محلول ملحي متوازن هانك)، وجمع الحصين في أنبوب مخروطي مع 4.5 مل المالحة الدافئة .
    4. إضافة 500 ميكرولتر من التربسين 2.5٪ إلى الحصين (0.25٪ تركيز التربسين النهائي)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    5. شطف جيدا الأنسجة بمحلول ملحي (3 × 10 مل)، ويسحن.
    6. استعادة الخلايا العصبية فصلها في 1 مل ثوسائط النمو الذراع التي تحتوي على الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 21.2 ملم مد الجلوكوز، 2 مم L-الجلوتامين، 2٪ B-27، و 0.1٪ الموسع المصل.
      ملاحظة: إضافة L-الجلوتامين وB-27 في يوم تشريح لإعداد وسائط النمو الطازجة.
    7. عدد الخلايا العصبية مع عدادة الكريات، ولوحة منها على coverslips في 24 لوحات جيدا في 1،0-1،5 × 10 5 خلية / جيد كثافة مع وسائل الإعلام نمو 500 ميكرولتر بعد تصفيتها من خلال شبكة من النايلون 40 ميكرون.
    8. احتضان ثقافة العصبية في 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية حاضنة مرطب لمدة 2-3 أسابيع. للحصول على أفضل نتيجة، وتجنب إزعاج ثقافة قدر الإمكان أثناء الحضانة.
  3. فوسفات الكالسيوم (كا-P) ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الثقافة الابتدائية
    1. جعل الحلول الأسهم وتخزينها في 4 درجة مئوية: 0.5 M BES (N، N -bis [2-هيدروكسي إيثيل] -2-aminoethanesulfonic حامض) عازلة (10X)؛ 150 ملي نا 2 هبو 4 (100X)؛ 2.8 M كلوريد الصوديوم (10X)؛ ده العقيمة 2 O؛ معقم 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
    2. يوم ترنسفكأيشن، وجعل الطازجة 2.5 M CaCl 2 الحل في ده 2 O وتصفية العقيمة مع 0.22 ميكرون فلتر. جعل عازلة مخزنة BES-2X جديدة المالحة (BBS) يحتوي على 50 BES ملم، 1.5 ملم نا 2 هبو 4، و 280 ملي مول كلوريد الصوديوم في درجة الحموضة 7.00 (ضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم) وتصفية العقيمة مع 0.22 ميكرون فلتر.
      ملاحظة: حساب كمية CaCl 2 حل وعازلة BBS اعتمادا على عدد من coverslips أن transfected. ننظر أيضا في 1.3.4.
    3. استبدال وسائط النمو الثقافة مع 500 سائط النمو ترنسفكأيشن جديدة ميكرولتر قبل تحسنت. (وسائل الإعلام ترنسفكأيشن يمكن إجراء مع MEM بالإضافة إلى 21.2 ملي مد الجلوكوز).
      ملاحظة: لا تجاهل وسائل الإعلام القديمة.
    4. حساب كمية ده 2 O والاستعداد لإضافة لجعل الحل ترنسفكأيشن (33 ميكرولتر لكل ساترة) التي تحتوي على 1.65 ميكرولتر CaCl 2 و 0.7 ميكروغرام الحمض النووي، و 16.5 &# 181؛ ل 2X BBS.
    5. إعداد الحل ترنسفكأيشن فورا قبل إضافتها إلى الثقافة. لإعداد، والجمع بين أول CaCl 2 و ده 2 O بينما تهييج ببطء الأنبوب. تواصل التحريض وببطء إضافة الحمض النووي في حل. وأخيرا، إضافة العازلة 2X BBS قطرة من الحكمة في حين التحريض.
    6. على الفور إضافة 30 ميكرولتر من محلول ترنسفكأيشن إلى كل ساترة للثقافة العصبية.
    7. صخرة الطبق الثقافة عدة مرات لخلط الحل واحتضان عند 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية ترطيب الحاضنة لمدة 45 دقيقة، 1 ساعة. بعد يتم تحضين الخلايا العصبية مع الحل ترنسفكأيشن، فإن الجميلة جدا رواسب الكالسيوم ف تشكل طبقة تغطي الخلايا العصبية.
    8. استبدال وسائل الاعلام ترنسفكأيشن مع 500 ميكرولتر قبل تحسنت غسل العازلة (135 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 20 ملي HEPES، 4 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم نا 2 هبو 4، 10 ملي الجلوكوز في الرقم الهيدروجيني 7.3، عقيم تصفيتها مع 0.22 ميكرون فلتر) واحتضان عند 356؛ مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية ترطيب الحاضنة لمدة 15-20 دقيقة. أن رواسب الكالسيوم ف تختفي بعد الخطوة غسل.
    9. استبدال غسل العازلة مع 500 ميكرولتر وسائط النمو الطازجة. مرة أخرى، استبدال وسائط النمو مع وسائل الإعلام الأصلي المحفوظة.
    10. إضافة UAA CMN (قبل مختلطة في 50 ميكرولتر وسائط النمو الحار) للثقافة ليصل إلى 1 ملي تركيز النهائي.
    11. احتضان الثقافة transfected عند 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية حاضنة مرطب ل12-48 ساعة قبل المقايسات.
  4. تسجيل خلية كاملة مع تنشيط ضوء
    1. إعداد حلول إضافية / داخل الخلايا. يحتوي الحل داخل الخلايا 135 ملي غلوكونات البوتاسيوم، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم MgCl 2 و 10 ملي HEPES، 1 ملي EGTA، 2.56 ملي K 2 ATP، و 0.3 ملي لي 2 GTP في درجة الحموضة 7.4. يحتوي الحل تسجيل خارج الخلية 150 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي بوكل، 5 ملي MgCl 2، 0.5 ملي CaCl 2 و 5 ملي الجلوكوز، و 10 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4.
    2. تثبيت الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) مع انبعاث 385 نانومتر بواسطة المجهر في تلاعب لتحقيق الضوء على نقطة محورية من 1 سم بعيدا في زاوية 45 درجة. تحقق قوة LED مع السلطة متر ضوء.
  5. سحب ماصات التصحيح من أقطاب الزجاج باستخدام مجتذب micropipette التجاري لديها 3-6 MΩ المقاومة ماصة. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لإعداد مجتذب micropipette.
    1. لاختبار مقاومة ماصة، أولا ملء ماصة مع الحل داخل الخلايا وضعه على حامل الكهربائي. تراجع ماصة في صحن الثقافة 35 ملم مليئة حل خارج الخلية، وضعت على المجهر صlatform. تزج القطب الأرض في طبق لإكمال الدائرة.
    2. تشغيل مكبر للصوت / التحويل الرقمي وبدء برنامج الحصول على البيانات. مراقبة مقاومة ماصة مع اختبار البروتوكول الغشاء.
  6. إخراج ساترة للثقافة العصبية من الحاضنة وشطف مرة واحدة في حل خارج الخلية. استخدام الشحوم فراغ، اضغط باستمرار على ساترة في منتصف صحن الثقافة 35 ملم مليئة حل خارج الخلية الطازجة.
  7. ضع ساترة / طبق على منصة الكهربية المجهر.
  8. باستخدام تقنيات التصحيح لقط القياسية، والتصحيح الخلايا العصبية مع mCitrine مضان 27. نشاط الخلايا العصبية قياسي باستخدام المشبك الحالي (I-الشبك) الأسلوب. أولا، ضبط إمكانات يستريح إلى حوالي -72 بالسيارات عن طريق حقن تيار صغير. ثم، وضخ خطوة الحالية (10-200 باسكال) للحث على اطلاق النار المستمر (5-15 هرتز) من إمكانات العمل.
  9. يدويا أو باستخدام برنامج الحصول على البيانات، وميض نبض (خطيئةغلي نبض 100 ميللي ثانية -1 مدة ثانية) للضوء LED لالخلايا العصبية أثناء التسجيل، ومعرفة ما إذا كان تتأثر إمكانات العمل.
  10. إضافة 0.5 ملي بووتون 2 إلى الحمام، وتحقق ما إذا كان يتم استرداد إمكانات العمل.

2. UAA التأسيس في Kir2.1 والتعبير عن PIRK الناتجة في مخ الفأر الجنينية في فيفو

  1. البناء الحمض النووي
    1. تصميم DNA البلازميد بالمثل كما في الخطوة 1.1. في الجسم الحي التعبير، استخدم أحد المروجين قوي مثل المساعدة النقدية (الدجاج بيتا أكتين المروج مع CMV محسن).
    2. تنقية الحمض النووي مع maxiprep عدة التجارية خالية من الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أداء استخراج الفينول كلوروفورم تليها الإيثانول هطول الأمطار 25 للحصول على الحمض النووي ذات جودة عالية للغاية (مختصرة إلى 2-5 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. في الرحم Electroporation لللالجنينية الماوس القشرة المخية الحديثة
    ملاحظة: TECHNI الأساسيوقد وصفت كيو لفي الرحم Electroporation للسابقا 28.
    1. تخدير ماوس الحوامل توقيت في اليوم الجنينية 14.5 (E14.5) مع بنتوباربيتال الصوديوم (الحقن داخل الصفاق، 50 ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم) أو الأيزوفلورين (استنشاق، 2-4٪). رصد عمق التخدير عن طريق فحص فقدان الوعي وعدم الاستجابة للمؤثرات عن طريق اللمس ومعسر من الكفوف.
    2. إجراء شق صغير في خط الوسط في البطن. فضح بلطف قرون الرحم مع ملقط وأطراف الأصابع.
    3. ضخ نحو 1 حل ميكرولتر الحمض النووي (2-5 ميكروغرام / ميكرولتر من كل البلازميد، اعتمادا على بناء) إلى البطين الجانبي من كل littermate مع ماصة الزجاج عبارة عن طريق جدار الرحم. في معظم الحالات، يتم حقن حوالي 60-80٪ من إجمالي الأجنة.
    4. Electroporate الأجنة مع electroporator (33-35 V، 50 ميللي ثانية مدتها، 950 مللي ثانية الفاصلة، 4-8 البقول).
    5. العودة قرون الرحم الى تجويف البطن برفق مع لالفطر الابيض وأطراف الأصابع. خياطة جدار العضلات ومن ثم الجلد مع خياطة الجراحية للسماح للأجنة لمواصلة التنمية.
  3. أوا حقن مكروي
    1. إجراء شق صغير في البطن خط الوسط مرة أخرى في E16.5، وفضح بلطف قرون الرحم مع ملقط وأطراف الأصابع.
    2. حقن حوالي 2-5 ميكرولتر CMN العلاء (500 ملم) على الجانب electroporated أو كلا الجانبين من البطين الجانبي مع ماصة الزجاج عبارة عن طريق جدار الرحم. لزيادة التوافر البيولوجي CMN، استخدم ثنائي الببتيد CMN علاء (CMN ألانين) لتسليم CMN في الجسم الحي 21.
    3. مرة أخرى، والعودة قرون الرحم الى تجويف البطن برفق مع ملقط وأطراف الأصابع. خياطة جدار العضلات ومن ثم الجلد مع خياطة الجراحية للسماح للأجنة لمواصلة التنمية.
  4. الحصول الحاد الدماغ شرائح
    1. جعل 1 لتر السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على 119 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.3 ملي MgCl 2، 2.5 ملي CaCl 2 ص 4، 26.2 ملم NaHCO 3، و 11 ملي الجلوكوز في درجة الحموضة 7.3.
    2. خذ 200 ACSF مل وسريع للتجمد عند -80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. فقاعة بقية ACSF مع 5٪ CO 2: 95٪ O 2 الغاز في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد وتعقيم أدوات الجراحة لحصاد العقول من الأجنة. أيضا بإعداد دلو من الجليد.
    4. جعل ~ 100 مل 4٪ انخفاض درجة انصهار الحل الاغاروز في قارورة عن طريق تسخين في الميكروويف. تهدئة حل لنحو 5 دقائق قبل أن تبدأ لترسيخ.
    5. الموت ببطء ساعة الماوس 12-24 بعد الحقن CMN علاء بواسطة CO 2 جرعة زائدة. جعل شقوق كبيرة في منطقة البطن، وتشريح خارج الأجنة electroporated / microinjected من الرحم مع مقص الجميلة وملقط.
    6. أدمغة الحصاد من الأجنة مع مقص الجميلة وملقط.
    7. وضع كل الدماغ على طبق ثقافة 10 سم وضعت على دلو الجليد. تقسيم نصفين باستخدام شفرة حادة، ووضع كلنصف الكرة على طبق مع المستوى السهمي النصفي لمس قاع الطبق. صب بسرعة على حل الاغاروز على العقل (حوالي 500 ميكرولتر في نصف الكرة الأرضية).
    8. باستخدام شفرة حادة، وقطع ساحة الاغاروز حول الدماغ لجعل كتلة الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الدماغ.
    9. باستخدام لاصق الأنسجة، والغراء أسفل سطح الطائرة السهمي النصفي من كتلة agarose على جبل لvibratome. ملء غرفة vibratome مع ACSF قبل المبردة وقطع 200 ميكرون شرائح الدماغ السهمي.
    10. احتضان شرائح الحادة في ACSF تستكمل مع 3 مم -inositol ميو، 0.4 ملي حمض الأسكوربيك، و2 مم البيروفات الصوديوم عند 33 درجة مئوية لمدة 42 دقيقة في حين ظهرت على السطح مع 5٪ CO 2: 95٪ O 2 الغاز.
    11. بعد 42 دقيقة، وإيقاف سخان والاستمرار في احتضان شرائح في درجة حرارة الغرفة مع السطح. بدء خلية كاملة التصحيح تسجيل 15 دقيقة على الأقل بعد إيقاف تشغيل جهاز التدفئة.
  5. تسجيل خلية كاملة مع تنشيط ضوء
    1. إعداد إنتراكحل ellular تحتوي على 130 ملي غلوكونات البوتاسيوم، 4 مم MgCl 2 و 5 ملي HEPES، 1.1 ملي EGTA، 3.4 ملي نا 2 ATP، 10 ملي الكرياتين فوسفات الصوديوم، و 0.1 ملي نا 3 GTP في درجة الحموضة 7.3 تعديلها مع KOH.
    2. سحب ماصات التصحيح من أقطاب الزجاج باستخدام مجتذب micropipette التجاري لديها 3-6 MΩ المقاومة ماصة.
    3. إعداد الكهربية تلاعب شريحة لكامل الخلية التصحيح لقط وsuperfuse غرفة تسجيل مع ACSF في 2 مل / دقيقة معدل مع مضخة نضح. ضبط درجة حرارة الغرفة إلى حوالي 33 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم تجهيز تلاعب شريحة الكهربية مع غرفة التروية، وهو الهدف الغمر بالماء وتحكم في درجة الحرارة. أيضا، مرشح GFP مطلوبة (675/130 نانومتر الإثارة: 580/20 نانومتر الانبعاثات) (الإثارة: 480/30 نانومتر، وانبعاث 535/40 نانومتر) وmCherry التصفية.
      1. تثبيت الصمام مع انبعاث 385 نانومتر بواسطة المجهر في تلاعب لتحقيق الضوء على نقطة محورية من 1 سم بعيدا في 45 °زاوية. تحقق قوة LED مع السلطة متر ضوء.
    4. اختيار بعناية شريحة الدماغ مع ماصة الزجاج ووضعه في غرفة نضح. اضغط باستمرار على شريحة مع القيثارة.
    5. التصحيح الخلايا العصبية مع مضان mCherry / GFP من منطقة القشرة المخية الحديثة 27. النشاط PIRK سجل باستخدام المشبك الجهد (V-الشبك) الأسلوب. أولا، مع الاستمرار على غشاء المحتملة في -60 بالسيارات. ثم، والتيارات سجل في إمكانات الثابتة السلبية غشاء (-100 بالسيارات) أو سلالم الجهد (-100 بالسيارات إلى +40 بالسيارات). على وجه التحديد، ومراقبة Kir2.1 التيارات الداخل محددة في -100 بالسيارات.
    6. يدويا أو باستخدام برنامج الحصول على البيانات، وميض النبض (نبضة واحدة من 100 ميللي ثانية -1 مدة ثانية) للضوء LED لالخلايا العصبية أثناء التسجيل، ومعرفة ما إذا كان يتم تنشيط بروتينات PIRK. مرة واحدة يتم تنشيط PIRK، فإن التيارات الداخل في -100 بالسيارات زيادة كبيرة.
    7. إضافة 0.5 ملي بووتون 2 إلى الحمام، وتحقق ما إذا كان هو المعطل PIRK مرة أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدمج وراثيا أوا إلى البروتين في الخلايا العصبية، فإن الخطوة الهامة الأولى هي لتصميم الجينات المناسبة يبني لتقديم والتعبير عن الجينات بكفاءة في الخلايا العصبية. هناك ثلاثة مكونات وراثية لأوا التأسيس: (1) هذا الجين الهدف مع TAG العنبر وقف كودون قدم في الموقع الذي تم اختياره لأوا التأسيس (2) والحمض الريبي النووي النقال متعامد على التعرف على تحور توقف TAG كودون، و (3) وأمينوأسيل متعامد -tRNA مخلقة لتوجيه الاتهام الى UAA على الحمض الريبي النووي النقال متعامد. يجب أن تكون مدفوعة من قبل المروج المناسب لكل مكون. هذه الأشرطة الجينات الثلاثة يمكن أن تدرج في البلازميد واحدة أو فصل في العديد من البلازميدات. للتعبير عن PIRK في الخلايا العصبية، وأدرجت-صورة رد الفعل UAA CMN إلى Kir2.1 باستخدام متعامد الحمض الريبي النووي النقال لوي CUA / CmnRS (CMN-الحمض الريبي النووي النقال مخلقة) زوج تطورت إلى أن تكون محددة لCMN 21،29. يتحور بقايا Cys169 من الجينات Kir2.1 إلى المحطة TAG العنبر كودون (Kir2.1-TAG)، والبروتين الفلوري وتنصهر mCitrine إلى C-محطة من Kir2.1 لتصور التعبير PIRK في ثقافة العصبية (الشكل 1).

الحصول على نوعية جيدة من ثقافة العصبية هو شرط أساسي لإجراء التجارب PIRK ناجحة. وتستخدم يوم بعد الولادة 1-4 الفئران الوليدة سبراغ داولي عموما لإعداد ثقافة العصبية، ولكن كما تستخدم أجنة الفئران في كثير من الأحيان. عندما مطلي على coverslips في 24 لوحات جيدا في 1،0-1،5 × 10 5 خلية / جيد الكثافة، ينبغي للمرء أن يرى الخلايا العصبية السليمة فصل جيدا مع الخلايا الدبقية الصغيرة ليس كثيرا أو غيرها من الحطام (الشكل 2A). الخلايا العصبية السليمة لها عمليات واسعة النطاق، وأجسام الخلايا (سوما) هي طبطب (الشكل 2B). متميز هيكل suborganelle مرئية وعادة ما يكون علامة على ثقافة غير صحية. يمكن الحفاظ على ثقافة العصبية لمدة 2-3 أسابيع عند 35 درجة مئوية في 5٪ CO 2: 95٪ الجوية حاضنة مرطب.

Cالفوسفات alcium (كا-P) ترنسفكأيشن هي طريقة ترنسفكأيشن لطيف جدا المناسب لثقافة العصبية الحساسة. ومع ذلك، فإنه يتطلب الدقة الشديدة والحذر لتحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية في الخلايا العصبية. تحتاج إلى تخزينها في 4 درجات مئوية، ويخلط لجعل عازلة BBS 2X يوم ترنسفكأيشن الحلول المالية. ضبط الأس الهيدروجيني الدقيق هو مفتاح للحصول على بتكاثر نتائج ناجحة. وينبغي أيضا أن يتم M CaCl 2 حل 2.5 الطازجة في يوم ترنسفكأيشن. لا بد من تصفية جميع المخازن. وعلاوة على ذلك، البلازميدات الحمض النووي جديدة مع نقاء وجودة عالية تحسين النتائج. للحصول على أفضل النتائج، يمكن للمرء الحصول مصغرة هيأهم الحمض النووي جديدة من عدم متضخمة ثقافة القولونية (~ 12 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الهز). بعد كل مخازن جاهزة، وجلب الحلول في نسيج الثقافة هود والاستعداد لترنسفكأيشن. باستخدام الدوامة بسرعة منخفضة، وتستنهض الهمم الحل ترنسفكأيشن في حين خلط. على الفور إضافة محلول مختلطة إلى مكعب العصبيةlture، وتقديم طبق ثقافة العودة إلى الحاضنة. وقف ترنسفكأيشن بعد 45 دقيقة، 1 ساعة، وإضافة وسائل الإعلام نمو الأصلي مرة أخرى إلى ثقافة للحضانة مستمرة. الخلايا العصبية transfected يمكن تصور من 6 ساعات بعد إنهاء ترنسفكأيشن (الشكل 3). في ظل وجود CMN في وسائل الإعلام والثقافة، وأعرب عن PIRK والخلايا العصبية، معربا عن PIRK والأخضر الفلورسنت بسبب بروتين mCitrine تنصهر إلى C-محطة من PIRK (الشكل 3D). الخلايا العصبية، معربا عن PIRK لها علم وظائف الأعضاء القاعدية العادي وأنها قادرة على إطلاق إمكانات العمل ردا على التيارات حقن (الشكل 4). ومع ذلك، يتم إعاقة هذه السلسلة من إمكانات العمل فورا مع نبضة ضوئية قصيرة أشرق إلى الخلية (الشكل 4A). عندما 0.5 ملي بووتون 2، مثبط محددة Kir2.1، يضاف إلى الحمام، ثم يتم استئناف إطلاق الخلايا العصبية، مشيرا إلى أن قمع السابق يعود إلى تفعيل Kir2.1 من قبل لآيت (الشكل 4B). الخلايا العصبية السيطرة Untransfected لا تستجيب للضوء أو با 2+ (الشكل 4C، D).

للتعبير عن PIRK في الجسم الحي، البلازميدات الحمض النووي نقية للغاية وتتركز (2-5 ميكروغرام / ميكرولتر) يجب أن تكون مستعدة. وترد البلازميدات المحددة المستخدمة في هذه التجارب في الشكل 5A. بالإضافة إلى الزوج الحمض الريبي النووي النقال لوي CUA / CmnRS متعامد والهدف الجينات Kir2.1-TAG، جين ترميز البروتين الفلوري الأخضر مع طفرة TAG (GFP-TAG) هو أيضا شارك electroporated-كمراسلة الفلورسنت. أن الكشف عن مضان GFP تشير إلى النجاح في إيصال جميع البلازميدات الثلاثة، منذ قمع TAG في GFP يتطلب كل من الحمض الريبي النووي النقال لوي CUA وCmnRS. سوف CMN التأسيس في GFP-TAG يقترح دمج CMN في Kir2.1-TAGas جيدا، لأن كلا من الجينات موجودة في نفس الخلية. يبني الجينات الثلاثة كلها إنجيالمديرية إلى البطين الجانبي من أجنة الفئران في E14.5 (الشكل 5B، غادر لوحة). بعد Electroporation لل، والعودة الأجنة إلى تجويف البطن للسماح للأجنة لمواصلة التنمية. بعد ذلك بيومين، حقن حوالي 2-5 ميكرولتر CMN العلاء (500 ملم) على الجانب electroporated أو كلا الجانبين من البطين الجانبي، في بطريقة مماثلة لحقن الحمض النووي (الشكل 5B، لوحة المتوسطة). مرة أخرى، والعودة الأجنة إلى تجويف البطن عن التطوير المستمر. الأجنة يمكن حصاده على E17.5 للتصوير أو المقايسات الكهربية. كما هو متوقع، فقط مع حقن CMN علاء، ويلاحظ خلايا الفلورية الخضراء في القشرة المخية الحديثة الماوس. الخلايا مع مضان كل من الأحمر والأخضر يجب أن CMN دمجها Kir2.1-TAG لجعل قنوات PIRK (الشكل 6A). يتم تسجيل خلية كاملة من شريحة القشرة المخية الحديثة الجنينية بالمثل كما هو الحال على ثقافة العصبية. الخلايا العصبية الفلورية الخضراء والحمراء ليس لها التيار الداخل في شمال شرقسلبية للعقد المحتملة، ولكن نبضة قصيرة من ضوء ينشط بسرعة التيار الداخل (الشكل 6B). تم منع التيار تماما بإضافة با 2+، مؤكدا الذي تم إنشاؤه من قبل PIRK.

الشكل 1
الشكل 1: PIRK مجموعة التعبير البلازميد لالخلايا العصبية الثقافة مخطط يبين تصميم البلازميد المثالي للتعبير PIRK في ثقافة العصبية. البلازميد كبار بترميز الجينات Kir2.1 (الرمادي) مع طفرة حمض أميني واحد في الموقع C169 تحت الفيروس المضخم للخلايا (CMV) مروج. يتحور C169 إلى TAG العنبر وقف كودون، حيث ستدرج في أوا CMN. ويتبع الجينات Kir2.1 التي كتبها mCitrine الجين (الخضراء). وتنصهر mCitrine إلى C-محطة من الجين Kir2.1 لتصور PIRK الخلايا معربا. البلازميد السفلي بترميز CmnRS (الوردي)، ومخلقة محدد CMN، مدفوعا (mPGK) المروج كيناز-1 الماوس فسفوغليسرات. الحمض الريبي النووي النقال > وأعرب ليو CUA (الأزرق)، ومتعامد الحمض الريبي النووي النقال 21، وأيضا في نفس بلازميد مدفوعا المروج H1، ولكن في الاتجاه المعاكس.

الشكل 2
الشكل 2: الجرذ الحصين ثقافة العصبية الأولية الصور المثالية تظهر الفئران صحي الثقافات العصبية قرن آمون. (أ) صورة مدينة دبي للإنترنت من ثقافة العصبية في 10 يوما في المختبر (DIV). الخلايا العصبية الناضجة لأنها فرع من أصل التشعبات والمحاور. الخلايا الدبقية الصغيرة (خلايا صغيرة ومستديرة دون العمليات) تتعايش ولكن لا تطغى على الثقافة. (ب) صورة مدينة دبي للإنترنت تضخيم الخلايا العصبية مثقف صحي. والخلايا العصبية السليمة المعارض خلايا الجسم ممتلئ الجسم (سوما) وينطق التشعبات / محاور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (3)
الرقم 3: التعبير PIRK في الخلايا العصبية الأولية مثقف مدينة دبي للإنترنت والصور مضان من الخلايا العصبية الفئران الحصين مثقف في المختبر، وtransfected مع ثوابت الجين هو مبين في الشكل رقم 1 للتعبير PIRK. عندما لا يتم إضافة CMN في الثقافة بعد ترنسفكأيشن (A و B)، لم يتم الكشف عن مضان أخضر من الخلايا العصبية. في ظل وجود CMN (1 ملم) في وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية transfected قادرة على التعبير عن كامل طول البروتينات PIRK-mCitrine، مما يدل على مخضر (C و D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

.jpg و"/>
الرقم 4: تفعيل خفيفة من PIRK يقمع يطلقون النار من الخلايا العصبية الفئران قرن آمون (A) نبضة ضوء واحد يقمع نشاط الخلايا العصبية الحصين معربا عن PIRK. يتم تسجيل آثار الجهد التمثيلية بشكل مستمر في المشبك الحالي. وأثار عمل اطلاق محتمل بنسبة 20 السلطة الفلسطينية حقن الحالي (I-خطوة). التعرض للضوء (385 نانومتر، 40 ميغاواط / سم 2، 1 ثانية؛ أشار مع السهم) بسرعة وبشكل كامل يقمع إطلاق الخلايا العصبية. استعادة اطلاق النار مع الخلية 500 ملي بووتون 2، والذي يحول دون انتقائية القنوات Kir2.1. (ب) الأشعة فوق البنفسجية (UV) إضاءة (385 نانومتر، 40 ميغاواط / سم 2، 6 ثانية؛ أشار مع مربع أصفر) لا يغير استثارة عن نطاق السيطرة، الخلايا العصبية untransfected. وأثار عمل اطلاق محتمل بنسبة 50 حقن الجارية للسلطة الفلسطينية (I-خطوة). (C و D) لا إضاءة الأشعة فوق البنفسجية ولا بووتون 2 (500 ملم) يؤثر على استثارة الخلايا العصبية السيطرة. عمل قويوأثار الاتحاد العالمي للتعليم بنسبة 50 حقن الجارية للسلطة الفلسطينية (I-خطوة).

الرقم 5
الرقم 5: إجراءات للتعبير PIRK في القشرة المخية الحديثة الماوس في الجسم الحي. (A) PIRK التعبير البلازميد تعيين. كبار البلازميد: البلازميد لCmnRS مدفوعا المروج CAG وmCherry عبر الداخلي دخول موقع الريبوسوم (IRES). سوف mCherry مضان تحقق التعبير الناجح لCmnRS. البلازميد الأوسط: البلازميد لجين Kir2.1 إلى جانب ثلاث نسخ من الحمض الريبي النووي النقال لوي CUA، والحمض الريبي النووي النقال متعامد لCMN التأسيس 21. البلازميد القول: البلازميد لGFP_Y182 TAG. تم تصميم هذا الجين لGFP مع كودون وقف العنبر في موقع Tyr182 متساهل (GFP_Y182 TAG) لتصور التأسيس الناجح لCMN إلى أبو غزالة المواقع 21. (ب) شو الكرتونالجناح إجراء التجارب للتعبير PIRK في الجسم الحي. يتم حقن يبني الجينات للتعبير PIRK في الماوس القشرة المخية الحديثة (E14.5) و electroporated في الرحم (اللوحة اليسرى). وبعد يومين، يتم حقن CMN علاء إلى البطين في الجانب electroporated أو كلا الجانبين من نصفي الكرة المخية (لوحة المتوسطة). التصوير شريحة والفحص الكهربية لا يمكن أن يؤديها على E17.5-E18.5 (اللوحة اليمنى).

الشكل (6)
الشكل 6: التعبير PIRK في القشرة المخية الحديثة الماوس وتفعيل الضوء. الصور (A) الإسفار من الماوس العصبونات القشرية الجنينية تبين إدراج CMN إلى GFP والبروتينات Kir2.1 في الجسم الحي. وelectroporated يبني الجينات الثلاثة في الشكل 5A في الرحم. يوضح mCherry مضان التعبير الناجح لسينت محدد CMNTASE الجينات، CmnRS. تم الكشف عن GFP مضان فقط مع حقن CMN علاء (القاع)، مشيرا إلى التأسيس CMN في TAG GFP ومن المرجح التأسيس CMN في TAG Kir2.1. وهكذا، مضان الأخضر والأحمر يشير التعبير الناجح لجميع البلازميدات الثلاثة وCMN التأسيس. (ب) رابعا مؤامرة من التيارات المسجلة من الفئران الخلايا العصبية القشرة المخية الحديثة تظهر تفعيل تعتمد خفيفة من PIRK. بعد يومين من electroporated بنيات الجينات في الشكل 5A، تم حقن CMN علاء في الرحم. 12-48 ساعة بعد الحقن CMN علاء، أعدت شرائح الحادة القشرة المخية الحديثة من الأجنة. PIRK، معربا عن الخلايا العصبية في شرائح، الكشف عن كل من مضان أحمر وأخضر، وسجلت من قبل (أسود) وبعد (الأزرق) التعرض للضوء (385 نانومتر، 8 ميغاواط / سم 2، 10 ثانية للتعرض المشبعة). وأضاف بووتون 2 (500 ملم) للتحقق من تيارات PIRK محددة بعد تنشيط ضوئي (برتقالي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحقيق فعال الصورة التشكيل، فإن الخطوة الأولى المهمة هي أن تقرر أين دمج UAA photoresponsive في البروتين المستهدف. المعلومات الهيكلية والوظيفية للبروتين المستهدفة هي مفيدة جدا لتوجيه اختيار المواقع المرشحة. وفي الوقت نفسه، فإن الغرض من التنظيم ضوء تحديد الموقع الذي هو الأكثر ملاءمة. بعد اختيار المواقع المرشحة، ونحن نوصي لاختبار المواقع في خطوط خلايا الثدييات مثل الكلى الجنينية البشرية (كلوة) خلايا لتسهيل الثقافة والتلاعب، وذلك قبل الشروع في الخلايا العصبية الأولية وفي الجسم الحي. لتحديد موقع لتنشيط ضوئي Kir2.1، وقد تم اختبارها عدة مواقع على طول المسام من Kir2.1 في البداية في الخلايا كلوة. تم العثور على C169 من Kir2.1 الأمثل، لأن حجم المسام Kir2.1 حيث يقيم C169 هو كبير بما يكفي لاستيعاب السلاسل الجانبية CMN ولكن صغيرة بما يكفي لسلاسل الجانب CMN لمنع مرور الأيونية. عندما تأسست CMN في C169 في Kir2.1 أعرب في الخلايا كلوة، رانه الناتجة كان متحولة Kir2.1 غير نشطة ولكنها أصبحت تفعيلها بناء على نشج قصيرة من الضوء، مما يؤكد التطور ناجحة PIRK 21.

التعبير كفاءة من الحمض الريبي النووي النقال متعامد ومخلقة أمر بالغ الأهمية للحصول على ارتفاع UAA كفاءة التأسيس في الخلايا وفي الجسم الحي. يتم التعبير عن الجينات مخلقة متعامد بكفاءة باستخدام البلمرة الثاني المروج وإشارات بولي-A غالبا ما تستخدم في خلايا الثدييات والخلايا العصبية. للتعبير عن الحمض الريبي النووي النقال متعامد، وهو نوع خاص-3 البلمرة الثالث المروج، مثل المروج H1 المستخدمة هنا، جنبا إلى جنب مع تسلسل المرافقة 3'هناك حاجة كما هو موضح سابقا 18،20. للدراسة في الجسم الحي، وجدنا أن ثلاث نسخ من التعبير كاسيت الحمض الريبي النووي النقال زادت CMN كفاءة التأسيس بالمقارنة مع نسخة واحدة (الشكل 5A). وفي دراسة أخرى في خلايا الثدييات، وزيادة عدد من الحمض الريبي النووي النقال التعبير كاسيت زادت أيضا UAA كفاءة التأسيس 30. ذرefore، نقترح الاستفادة المثلى من عدد من أشرطة التعبير الحمض الريبي النووي النقال لمختلف Uaas، والخلايا، والبروتينات المستهدفة عندما تحتاج UAA كفاءة التأسيس التحسن. التوافر البيولوجي للUaas في الخلايا وفي الجسم الحي هو عامل حاسم آخر لأوا التأسيس. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الأسترة من Uaas يساعد على امتصاص في خلايا الثدييات 31، وأن إعداد Uaas في شكل ثنائي الببتيد يزيد UAA امتصاص إلى خلايا في انواع معينة ايليجانس 32. لقد وجدنا أن تغذية مباشرة CMN إلى وسائل الإعلام ثقافة العصبية غير كافية لCMN التأسيس في Kir2.1 أعرب في الخلايا العصبية الأولية مثقف، ولكن غير كافية لإدراجها في مخ الفأر في الجسم الحي 21. لذلك، تم تصنيعه لثنائي الببتيد CMN علاء وحقنه في مخ الفأر. وأعرب عن PEPT2 قليل الببتيد نقل عالية في أدمغة القوارض 33، الذي يمكن أن يسهل نقل من ثنائي الببتيد في الخلايا العصبية. وdipe المنضويةسوف ptide أن تحلل من قبل peptidases الخلوي لتسفر عن UAA CMN لإدراجها. في الواقع، مع هذا التحسين حققنا كفاءة التأسيس CMN إلى بروتينات الخلايا العصبية في مناطق متعددة من مخ الفأر الجنينية، بما في ذلك القشرة المخية الحديثة، المهاد وتحت المهاد 21.

التعبير PIRK ناجحة في الخلايا العصبية يعتمد بقوة على إعداد ثقافة العصبية السليمة. يجب أن يتم تنفيذ كل خطوة في البروتوكول بطريقة دقيقة ودقيقة. بعد إعداد ثقافة، فمن الأفضل للحفاظ على الثقافة في الحاضنة دون اضطراب. فتح وإغلاق الباب الحاضنة، وكذلك تحريك الطبق الثقافة والخروج من الحاضنة، يمكن أن تضيف ما يصل الى تقويض نوعية الثقافة. انخفاض درجة الحرارة حاضنة (35 درجة مئوية بدلا من 37 درجة مئوية) يساعد في تقليل التحفيز الزائدة. وعلى صعيد مشابه، وينبغي أن يتم كا ف ترنسفكأيشن بمزيد من الحذر. إعداد العازلة 2X BBS هو خطوة حاسمة. انها فكرة جيدة لكاليbrate الرقم الهيدروجيني الأمثل للالعازلة 2X BBS بين درجة الحموضة 6،90-7،15، منذ يبني الحمض النووي جديدة أو محضرات يمكن أن تتغير الظروف ترنسفكأيشن. ويمكن تعديل درجة الحموضة عازلة بدقة إلى 0.01 الأرقام إذا كان ذلك يساعد على تحقيق نتائج متسقة. قبل ترنسفكأيشن، يتم استبدال وسائل الإعلام نمو ثقافة العصبية مع واحدة جديدة. ومن الأهمية بمكان توفير وسائل النمو الأصلي، وإضافة إلى الثقافة بعد ترنسفكأيشن لاستعادة حالتها الأصلية. ان الحفاظ على ثقافة العصبية في وسائل الإعلام الجديدة بعد ترنسفكأيشن تتداخل مع الخلايا العصبية من استعادة، لأنه يفتقر إلى الجزيئات الأساسية لتكاثر الخلايا مثل عوامل النمو التي صدرت من الخلايا العصبية.

لتنشيط ضوء PIRK في الخلايا المستزرعة وشرائح الأنسجة، مصدر ضوء مناسب وطريقة التسليم يجب أن يتم تحديده لاحقا. CMN يمتص طويلة ومتوسطة أضواء موجة الأشعة فوق البنفسجية (280-400 نانومتر). ومع ذلك، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية طويلة، خصوصا في أقصر طول موجي ضوء الأشعة فوق البنفسجية، سوف تكون ضارة للخلايا. على وسامالساعة الإلكترونية، يمكن أن ضوء بعيدة الحمراء تسخن العينة تشويش الخلايا. ومن هنا، فإن الصمام مع الانبعاثات الطول الموجي واحد هو الأفضل لتفعيل PIRK. لCMN التحلل الضوئي، وهو الصمام مع انبعاث 385 نانومتر (~ 40 ميغاواط، Prizmatix) وقد تم اختيار. تثبيت الصمام خارجيا قرب المجهر، وتستخدم الألياف البصرية لتقديم الضوء على وجه التحديد إلى الخلايا العصبية في التركيز. للحصول على البيانات قابلة للتكرار، يتم تعيين الألياف البصرية بنسبة 1 سم بعيدا في زاوية 45 درجة من الخلايا العصبية في التركيز. وقد تم قياس قوة الضوء في العينة 40 ميغاواط / سم 2. ويوصى أيضا للتحقق بشكل دوري أداء الصمام باستخدام السلطة متر البصرية.

علينا أن نبرهن على electroporation في الرحم هو أسلوب فعال لدمج وراثيا Uaas في الجسم الحي. electroporation في الرحم من السلطات الوطنية المعينة بلازميد في الماوس القشرة المخية الحديثة الجنينية يتم تنفيذ كما هو موضح سابقا 34، مع تعديلات طفيفة. للتعبير عن البروتينات PIRK في neonataل أدمغة فئران، يطلب من اثنين من العمليات الجراحية (الشكل 5B). الخطوة الأولى هي لحقن يبني الجينات للتعبير PIRK تليها Electroporation لل. وبعد يومين، يتم إجراء حقن الدماغ الثاني لتقديم CMN العلاء. فإن ذلك يتطلب الممارسة لأداء ببراعة العمليات الجراحية دون مشددا على الحيوانات كثيرا. بعد كل جراحة، ينبغي النظر إلى هذه الحيوانات بعد والتحقق على أساس منتظم في جميع أنحاء الانتعاش. توافر ما يكفي في الوقت المناسب من CMN في الدماغ ضروري للتعبير PIRK السليم. وعادة ما يتم حقن 2-5 ميكرولتر من CMN العلاء (500 ملم) إلى الدماغ الجنيني. في بعض الأحيان، فإنه يساعد على ضخ CMN علاء في البطين على كل من electroporated ونصف الكرة الآخر، منذ CMN علاء من الجانب الآخر من شأنه نزع فتيل إلى الجانب electroporated لتوريد CMN الموسعة. وبالنظر إلى المنفعة العامة للelectroporation في الرحم، ويمكن تطبيق هذه التقنية ليس فقط للخلايا العصبية القشرة المخية الحديثة ولكن أيضا لالخلايا العصبيةفي مناطق أخرى من الدماغ مثل المخطط، الدماغ البيني، والمخيخ، عندما يتم ضبط لكل منطقة Electroporation للموقع / الحقن. العقول الجنينية / الوليدية هي ليونة بكثير من أدمغة البالغين، لذلك سيكون من الصعب للحصول على شرائح الحادة للتجارب الكهربية. تضمين الاغاروز يساعد على تحقيق الاستقرار في بنية الدماغ الجنيني لvibratome القطع. وعلى الرغم من انخفاض الاغاروز نقطة ذوبان يقلل من صدمة درجة الحرارة إلى أنسجة المخ، وهناك حاجة الحذر عند صب agarose ذاب على العقول الباردة. كان تأثير صدمة درجة الحرارة إلى الأنسجة من تضمين الاغاروز ملحوظ خلال تسجيل خلية كاملة.

ترميز وراثيا photoresponsive Uaas في الخلايا العصبية مثقف وفي الجسم الحي، ومن أمثلته PIRK هنا، سوف تحمل تقنية علم البصريات الوراثي للسيطرة على مختلف الأنشطة بروتين الخلايا العصبية مع الضوء في بيئتهم المحلية. يقدم البروتوكول الحالي إجراء خطوة بخطوة لأداء التعبير PIRK وتفعيل التجارب طن ثقافة العصبية في المختبر، وفي أدمغة القوارض في الجسم الحي، وهو ما يمثل أول مشروع الناجحة لنظام أوا لاستخدامها في أدمغة الثدييات. لديها القدرة على الاستفادة بحث العديد من البروتينات الطبيعية، فضلا عن تورطهم في الأمراض. على سبيل المثال، α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا) مستقبلات وN-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA) مستقبلات حصة الهياكل الغشاء مماثلة مع قنوات Kir2.1. ولذلك سيكون من الممكن تطبيق منهجية PIRK إلى القنوات الأيونية بوابات يجند هؤلاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم تقنية PIRK لمعالجة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض الوراثية Kir2.1 ذات الصلة، مثل متلازمة أندرسن ومتلازمة القلب QT قصيرة 35،36. بالإضافة إلى "كتلة والافراج عن" السيستئين عبر CMN، وقد قفص متعددة الأحماض الأمينية مثل التيروزين، سيرين، ليسين، الغلوتامات، اسبارتاتي، والجلايسين مع مختلف المجموعات photoreleasable 37. وهكذا، يمكن للاستراتيجيات مماثلة يكون الاستخدامد إلى الصور تنظيم هذه الأحماض الأمينية في الخلايا العصبية في المختبر والمجراة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحقيق السيطرة البصرية عكسها مع آزوبنزين التي تحتوي على Uaas، ومثل Uaas والآن تم ترميز وراثيا في E. القولونية وخلايا الثدييات 38،39.

وباختصار، ويعرض هذا البروتوكول طريقة عامة لمراقبة نشاط بروتينات الخلايا العصبية في الإعدادات الخاصة بها الأم مع الضوء. في مقارنة لأساليب علم البصريات الوراثي الأخرى التي تنطوي أوبسين للأسرة وغيرهم الضوء البروتينات الحساسة أو المجالات، يستخدم هذا الأسلوب المشفرة وراثيا Uaas حساسة للضوء والتغيرات سوى بقايا واحدة. ولذلك، ينبغي أن يكون الحد الأدنى من التدخل في وظيفة، والاتجار وتوطين البروتين المستهدف قيد الدراسة. ويمكن أيضا عالية الانتقائية الموقع أن يتحقق مع هذه Uaas ضوء استجابة المشفرة وراثيا لتوفير قدر أكبر من المرونة وخصوصية لتحقيق الجزيئي تفصيلا. يوفر هذا البروتوكول أيضا على التعاون الأولmprehensive وسهلة لمتابعة الإجراء كيفية دمج بنجاح Uaas إلى البروتينات في الخلايا العصبية في المختبر والمجراة. التحكم البصري من البروتينات العامة عبر Uaas المشفرة وراثيا في الخلايا العصبية في المختبر والمجراة لديها امكانات كبيرة للاستفادة العلم على حد سواء الأساسية ومتعدية، وهذا من شأنه أن يساعد في تعزيز بروتوكول تطبيقه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Tags

علم الأعصاب، العدد 109، الأحماض الأمينية غير طبيعي، الشفرة الوراثية، وقمع العنبر، قناة أيون، علم البصريات الوراثي، وعلى ضوء تفعيل ومراقبة بصرية، photocage، الخلايا العصبية، نشاط الخلايا العصبية والمخ
مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. … More

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter