Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optisk kontroll av en Neuronal Protein Med hjälp av en genetiskt kodad Unnatural Amino Acid i neuroner

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

Jämfört med konventionell elektrisk stimulering, erbjuder photostimulation större tids- och rumsupplösning med minimal störning av det fysiologiska systemet av prover. Eftersom demonstrationen av att använda laser för att stimulera nervceller 1971 1, har många kreativa sätt uppfunnits för att exogent styra nervaktivitet med ljus. Optisk frisättning av photocaged agonister har länge använts för att studera fysiologiska svaret av det neuronala nätverket till ligander 2,3,4. Denna teknik har begränsad specificitet på grund av diffusion av burar agonister. Genetisk specificitet uppnås genom ektopiskt uttrycker ljuskänsliga opsin kanaler och pumpar 5,6,7, och det har med framgång använts för att modulera utvalda neuronala nätverk i olika modellorganismer. Men skulle det vara svårt att tillämpa denna metod för att optiskt styra olika andra neuronala proteiner, eftersom ympning photoresponsiveness från opsin proteiner till andra proteiner would kräver intensiv teknik som kan förändra de naturliga egenskaperna hos proteinet under utredning. Kemiskt tjudra en exogen Ijuskänsligt ligand till ett protein har visat ett annat sätt att kontrollera funktionaliteten hos kanalproteiner 8,9,10. Liganden presenteras eller dras tillbaka från bindningsstället av proteinet genom fotoisomerisering av azobensen delen. Tjudra kemi begränsas tillämpningen huvudsakligen på den extracellulära sidan av membranproteiner, med undantag för den intracellulära sidan och intracellulära proteiner.

Fotokänsliga Uaas, efter att ha införlivats i proteiner, ge en allmän strategi för att manipulera proteiner med ljus. I tidiga insatser, tRNA kemiskt acyleras med photocaged Uaas mikroinjicerades i Xenopus oocyter infoga Uaas i membranreceptorer och jonkanaler 11, som har ökat kunskapen om deras struktur-funktionssamband 12,13,14.Denna mikroinjektion strategi huvudsakligen begränsad till stora ägg. Genetisk inkorporering av en Uaa kringgår tekniskt utmanande tRNA acylering och mikroinjektion genom att använda en ortogonal tRNA / syntetas par, som införlivar Uaa genom endogena protein översättning i levande celler 15,16,17,18. UAA inkorporering i neuronala proteiner har demonstrerats i primära neuroner och neurala stamceller 19,20. På senare tid har fotokänsliga Uaa blivit genetiskt införlivas i en neuronal protein i däggdjurshjärnan in vivo för första gången 21. Dessa framsteg gör det möjligt att studera neuronala proteiner med Uaas i sin ursprungliga cellmiljön.

Inåt likriktande kaliumkanalen Kir2.1 är en stark likriktare som passerar K + strömmar lättare i än ut ur cellen, och det är viktigt för att reglera fysiologiska processer inklusive cell retbarhet, kärltonus, hjärtfrekvens, renal salt flöde och insulinfrisättning 22. Överexpression av Kir2.1 hyperpolariserar membranpotentialen av målet neuron, som blir mindre retbara 23,24. Att optiskt styra Kir2.1 i sina nativa celler, Kang et al. Genetiskt införlivat en fotokänslig Uaa in Kir2.1 uttryckas i däggdjursceller, neuroner och embryonala mushjärnor 21. En kort ljuspuls kunde omvandla Uaa in i en naturlig aminosyra Cys, på så sätt aktivera målet Kir2.1 proteinet. När denna foto inducerbara inåt likriktande kalium (Pirk) kanalproteinet uttrycktes i rått hippocampus primära neuroner, undertryckte det neuron som svar på ljusaktivering. Dessutom var den Pirk kanalen uttryckt i den embryonala mus neocortex, och ljusaktiverat Pirk ström i kortikala neuroner mättes. Ett framgångsrikt genomförande av Uaa tekniken in vivo i däggdjurshjärnan öppnar dörren till optiskt kontrollera neuronala proteineri deras naturliga miljö, som gör det möjligt optisk dissektion av neuronala processer och mekanismer på molekylär nivå.

I detta protokoll beskriver vi förfaranden för genetisk inkorporering av Uaas i primära neuroner i odling och i den embryonala mus hjärnan in vivo. Den fotokänsliga Uaa Cmn och Kir2.1 används för att illustrera förfarandet. Metoder för att bedöma framgångsrik Uaa inkorporering och optisk kontroll av neuronal proteinaktivitet tillhandahålls. Detta protokoll ger en tydlig guide genetiskt kodar Uaas i neuroner och in vivo, och optiskt reglera neuronal proteinfunktion via en fotokänsliga Uaa. Vi förväntar oss att detta protokoll för att underlätta antagandet av Uaa in vivo teknik för neurovetenskap och optogenetic biologiska studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden i den aktuella studien genomfördes med hjälp av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) godkända protokoll för djurhantering på The Salk Institute of Biological Studies, La Jolla, CA.

1. Uaa Införande i Kir2.1 och uttryck av de resulterande Pirk i primär Neuronala Kultur

  1. DNA Konstruktion
    1. Välj en målplats för Kir2.1 för Uaa inkorporering. Utnyttja tidigare kunskap och information om strukturen och funktionen hos Kir2.1, så att den valda platsen med det fotokänsliga Uaa Incorporated möjliggör optisk modulering av Kir2.1 funktion 21.
    2. Konstruera en rekombinant DNA som kodar för Kir2.1 genen med den valda platsen muterad till TAG amber-stoppkodon. Använda standardkloningstekniker 25 för att klona Kir2.1-TAG-DNA in i en däggdjurs expressionsplasmiden.
    3. Klon tRNA / syntetas gener som är specifika för UAA och införliva Uaa som svar påTAG-stoppkodonet till ett annat däggdjurs-expressionsplasmid 21.
      Obs: För optimal Uaa inkorporering, kan olika promotorer och kombinationer av genkassetterna (för tRNA, syntetas, och Kir2.1) testas i olika plasmider.
    4. Få hög kvalitet plasmid-DNA med hjälp av miniprep eller Maxiprep kommersiella kit enligt tillverkarens protokoll. Omkring 1,9 av 260/280 förhållandet är optimalt för det renade DNA. När det är nödvändigt, utföra en agarosgelelektrofores för att kontrollera renheten hos den prepped DNA 25. Supertvinnade plasmid-DNA med hög renhet är bäst för neuronal transfektion.
  2. Kultur Rat Hippocampus Primär Neurons
    1. Plats glas täckglas (cirklar, 12 mm i diameter) i 24-brunnars plattor, en täckglas på varje brunn, och belägga varje brunn med 250 pl av 0,5 mg / ml poly-D-lysin (i 100 mM boratbuffert: 1,24 g borsyra syra och 1,90 g natriumtetraborat i 400 ml avjoniserat destillerat H2O eller DDH 2
    2. På dagen för dissektion, samla neonatala hjärnor från postnatal råttungar (1-4 postnatal dag) efter anesthetizing dem med isofluran och halshugga. Söva valparna i en anesthetization kammare som innehåller isofluran (2-4%). Vänta tills de förlorar medvetandet och misslyckas med att svara på taktila stimuli och klämning av tassarna.
    3. Med användning av standardteknik 26, dissekera hippocampi från hjärnan i varmt (~ 37 ° C) saltlösning (10 mM HEPES och 20 mM D-glukos tillsätts i Hanks balanserade saltlösning), och samla hippocampi i ett koniskt rör med 4,5 ml varm saltlösning .
    4. Tillsätt 500 pl av 2,5% trypsin till hippocampi (0,25% slutlig trypsinkoncentration), och inkubera under 10 min i ett vattenbad vid 37 ° C.
    5. skölj noggrant vävnaden med saltlösning (3 x 10 ml) och finfördela.
    6. Återställa dissocierade nervceller i 1 ml warm tillväxtmedier innehållande Minimum Essential Medium (MEM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 21,2 mM D-glukos, 2 mM L-glutamin, 2% B-27, och 0,1% serum extender.
      Obs: Lägg L-glutamin och B-27 på dagen för dissektion för att förbereda färskt tillväxtmedia.
    7. Räkna de nervceller med en hemocytometer, och plattan dem på täckglas i 24-brunnars plattor vid 1,0 till 1,5 x 10 5 celler / brunn densitet med 500 | il tillväxtmedium efter filtrerades genom ett 40 | im nylonnät.
    8. Inkubera den neuronala odling vid 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft fuktad inkubator under 2-3 veckor. För bästa resultat, undvika att störa kulturen så mycket som möjligt under inkubation.
  3. Kalciumfosfat (Ca-P) Transfektion av primär Neuronala Kultur
    1. Gör förrådslösningar och förvara vid 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hydroxi-etyl] -2-aminoetansulfonsyra) -buffert (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); steril DDH 2 O; steril 1 N NaOH.
    2. På dagen för transfektion, göra färsk 2,5 M CaCl2-lösning i DDH 2 O och steril filtrering med 0,22 pm filter. Göra färsk 2x BES-buffrad saltlösning (BBS) buffert innehållande 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, och 280 mM NaCl vid pH 7,00 (pH-justering med NaOH) och sterilfilter med 0,22 pm filter.
      Notera: Beräkna mängden CaCl2-lösning och BBS-buffert beroende på antalet av täckglas som skall transfekteras. Titta också på 1.3.4.
    3. Byt odlingstillväxtmediet med 500 pl färsk förvärmda transfektion tillväxtmedier. (Transfektionsexperiment medier kan göras med MEM plus 21,2 mM D-glukos).
      Obs: Släng inte den gamla medier.
    4. Beräkna mängden DDH 2 O och förbereda för att lägga till, för att göra transfektionslösningen (33 pl per varje täckglas) innehållande 1,65 | j, l CaCl2, 0,7 | ig DNA, och 16,5 &# 181; l 2x BBS.
    5. Förbered transfektion lösning omedelbart innan den läggs till kulturen. För att förbereda, först kombinera CaCl2 och DDH 2 O medan långsamt omrörning röret. Fortsätta röra om och tillsätt långsamt DNA in i lösningen. Slutligen till 2x BBS-buffert droppvis under omrörning.
    6. Omedelbart till 30 pl transfektion lösning till varje täck av neuronal kultur.
    7. Vagga kulturen skålen ett par gånger för att blanda lösningen och inkubera vid 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft fuktad inkubator under 45 min-1 tim. Efter nervceller inkuberas med transfektion lösning, skulle mycket fina Ca-P-fällningar bilda ett skikt som täcker nervceller.
    8. Ersätta transfektion media med 500 ^ förvärmda tvättbuffert (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glukos vid pH 7,3, steril filtrerades med 0,22 pm filter) och inkubera vid 356; C i en 5% CO2: 95% luft fuktad inkubator i 15-20 min. Ca-P fällningar skulle försvinna efter tvätt.
    9. Ersätta tvättbuffert med 500 | il färskt tillväxtmedia. Återigen, byt tillväxtmediet med den sparade ursprungliga media.
    10. Tillsätt Uaa Cmn (förblandas i 50 pl varm tillväxt media) till kulturen för att nå 1 mM slutlig koncentration.
    11. Inkubera den transfekterade kulturen vid 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft fuktad inkubator under 12 till 48 h före analyser.
  4. Helcells inspelning med ljusaktivering
    1. Förbered extra / intracellulära lösningar. Den intracellulära lösningen innehåller 135 mM kalium glukonat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP och 0,3 mM Li 2 GTP vid pH 7,4. Den extracellulära registreringslösningen innehåller 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glukos och 10 mM HEPES vid pH 7,4.
    2. Installera en lysdiod (LED) med emission av 385 nm genom mikroskopet vid riggen för att leverera ljus till brännpunkten från 1 cm vid 45 ° vinkel. Kontrollera kraften i LED med en ljuseffektmätare.
  5. Dra patch pipetter från glaselektroder med hjälp av en kommersiell mikropipett avdragare för att ha 3-6 Mohm pipett motstånd. Följ tillverkarens instruktioner för att ställa in mikropipett avdragare.
    1. För att testa pipett motstånd, först fylla pipetten med den intracellulära lösningen och placera den på elektrodhållaren. Doppa pipetten i en 35 mm odlingsskål fylld med extracellulära lösning, placeras på mikroskop platform. Doppa en jordelektrod i skålen för att slutföra en krets.
    2. Slå på förstärkaren / digitizer och starta ett datainsamlingsprogram. Övervaka pipett motstånd med en membrantestprotokoll.
  6. Ta ut ett täckglas av neuron kultur från inkubatorn och skölj en gång i den extracellulära lösningen. Med hjälp av vakuum fett, håll ned täck i mitten av en 35 mm odlingsskål fylld med färska extracellulära lösning.
  7. Placera täck / skålen på elektromikroskopplattformen.
  8. Använda standard patch klämtekniker, lappa en neuron med mCitrine fluorescens 27. Spela nervaktivitet med hjälp av strömtång metod (I-klämma). Först justera vilopotential till ca -72 mV genom att injicera en liten ström. Sedan injicera ett steg ström (10-200 pA) för att inducera kontinuerlig eldning (5-15 Hz) av aktionspotentialer.
  9. Manuellt eller med hjälp av datainsamling programvara, flash en puls (en syndGLE puls på 100 ms -1 sek varaktighet) av LED ljus till neuron under inspelningen, och se om aktionspotentialer påverkas.
  10. Tillsätt 0,5 mM BaCl2 till badet och kontrollera om aktionspotentialer återvinns.

2. Uaa Inkorporering i Kir2.1 och uttryck av de resulterande Pirk i mus embryonal hjärna In Vivo

  1. DNA Konstruktion
    1. Utforma plasmid-DNA på liknande sätt som i steg 1,1. För in vivo-uttryck, använd en stark promotor såsom CAG (kyckling beta-aktin promotor med CMV-förstärkare).
    2. Rena DNA med ett endotoxinfritt maxiprep kommersiellt kit enligt tillverkarens protokoll. Utför fenol-kloroformextraktion följt av etanolutfällning 25 att förvärva extremt hög kvalitet DNA (kondenseras till 2-5 mikrogram / ​​l).
  2. I livmodern elektroporering till Mouse embryonala Neocortex
    Obs: Den grundläggande technique i livmodern elektroporering har beskrivits tidigare 28.
    1. Söva en tidsinställd gravid musen på embryonala dag 14,5 (E14.5) med natrium pentobarbital (intraperitoneal injektion, 50 mikrogram per gram kroppsvikt) eller isofluran (inhalation, 2-4%). Övervaka anestesidjups genom att kontrollera medvetandeförlust och inget svar på taktila stimuli och klämning av tassarna.
    2. Gör ett litet snitt vid den abdominala mittlinjen. exponera försiktigt livmoderhornen med pincett och fingertoppar.
    3. Injicera omkring 1 | j, l DNA-lösning (2-5 ug / ul av varje plasmid, beroende på konstruktionen) in i den laterala ventrikeln hos varje kull med en glaspipett in genom livmoderväggen. I de flesta fall är ca 60-80% av den totala embryon injiceras.
    4. Electroporate embryon med en elektroporator (33-35 V, 50 ms varaktighet, 950 ms intervall, 4-8 pulser).
    5. Avkastning livmoderhornen till bukhålan försiktigt med förCEPS och fingertoppar. Suturera muskelväggen och sedan huden med kirurgisk sutur för att tillåta embryona att fortsätta utveckling.
  3. UAA Mikroinjektion
    1. Gör ett litet snitt i buken mittlinjen igen vid E16.5 och försiktigt utsätta livmodern hornen med pincett och fingertoppar.
    2. Injicera ca 2-5 | j, l Cmn-Ala (500 mM) till electroporated sida eller båda sidor av den laterala ventrikeln med en glaspipett in genom livmoderväggen. För att öka Cmn biotillgänglighet använda dipeptiden Cmn-Ala (Cmn-alanin) för att leverera Cmn in vivo 21.
    3. Återigen tillbaka livmoderhornen till bukhålan försiktigt med pincett och fingertoppar. Suturera muskelväggen och sedan huden med kirurgisk sutur för att tillåta embryona att fortsätta utveckling.
  4. Skaffa Akut hjärnan skivor
    1. Göra en L artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) som innehåller 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCb 2 PO 4, 26,2 mM NaHCOs 3, och 11 mM glukos vid pH 7,3.
    2. Ta 200 ml ACSF och snabb-frysning vid -80 ° C under 20-30 min. Bubbla resten av ACSF med 5% CO2: 95% O2 gas vid rumstemperatur.
    3. Förbered och sterilisera kirurgi verktyg för att skörda hjärnor från embryon. förbereder också en hink med is.
    4. Göra ~ 100 ml 4% lågsmältande agaros-lösning i en kolv genom uppvärmning i en mikrovågsugn. Svalna lösning under ca 5 min innan det börjar stelna.
    5. Avliva musen 12-24 timmar efter Cmn-Ala injektion av CO 2 överdos. Göra stora snitt i buken, och dissekera ut electroporated / mikroinjicerade embryon från livmodern med fina sax och pincett.
    6. Harvest hjärnor från embryon med fina sax och pincett.
    7. Placera varje hjärna på en 10 cm odlingsskål placerad på ishink. Dela upp två halvklot med hjälp av en vass kniv, och placera varjehemisfären på skålen med mittsagittalplan vidrör skålens botten. Snabbt häll över agaroslösningen över hjärnor (cirka 500 l per halvklotet).
    8. Med hjälp av en vass kniv, fyrkantig klippa agarosen runt en hjärna för att göra en hjärna inbäddade agaros blocket.
    9. Med användning av vävnadslim, lim ner mittsagittalplan ytan av agarosen blocket på ett fäste för vibratome. Fyll vibratome kammaren med pre-kyld ACSF och skär 200 um sagittal hjärnan skivor.
    10. Inkubera akut skivor i ACSF kompletterat med 3 mM myo-inositol, 0,4 mM askorbinsyra, och 2 mM natriumpyruvat vid 33 ° C under 42 minuter under bubbling med 5% CO2: 95% O2-gas.
    11. Efter 42 minuter, stänga av värmaren och fortsätta att inkubera skivorna vid rumstemperatur med bubblande. Börja helcells-patch inspelning åtminstone 15 minuter efter att stänga av värmaren.
  5. Helcells inspelning med ljusaktivering
    1. Förbered intracellular lösning innehållande 130 mM kalium glukonat, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM natrium kreatinfosfat och 0,1 mM Na 3 GTP vid pH 7,3 justerat med KOH.
    2. Dra patch pipetter från glaselektroder med hjälp av en kommersiell mikropipett avdragare för att ha 3-6 Mohm pipett motstånd.
    3. Ställ in skiva elektrofysiologi rigg för hel-cell patch fastspänning och superfuse inspelningen kammaren med ACSF vid 2 ml / min hastighet med en perfusion pump. Justera kammartemperaturen till ca 33 ° C.
      Obs! Skiva elektrofysiologi riggen är utrustad med en perfusionskammaren, en vattenimmersionsobjektiv och en temperaturregulator. Dessutom GFP filter (excitation: 480/30 nm, emission: 535/40 nm) och mCherry filtret (excitation: 580/20 nm emission 675/130 nm) som krävs.
      1. Installera en lysdiod med utsläpp av 385 nm genom mikroskopet vid riggen för att leverera ljus till brännpunkten från 1 cm vid 45 °vinkel. Kontrollera kraften i LED med en ljuseffektmätare.
    4. plocka försiktigt upp en hjärna skiva med en glaspipett och plats i perfusionskammaren. Håll ned skiva med en harpa.
    5. Patch en neuron med mCherry / GFP fluorescens från hjärnbarkens regionen 27. Spela Pirk aktivitet med hjälp av spänningsklämmetod (V-klämma). Först håller membranpotentialen vid -60 mV. Sedan spela strömmarna vid fasta negativa membranpotentialer (-100 mV) eller spänningsramper (-100 mV till 40 mV). Specifikt övervakar Kir2.1 specifika för aktiv strömmar vid -100 mV.
    6. Manuellt eller med hjälp av datainsamling programvara, flash en puls (en enda puls av 100 ms -1 sek varaktighet) av LED-ljus till neuron under inspelningen, och se om Pirk proteiner är aktiverade. När Pirk aktiveras, skulle aktiv strömmar vid -100 mV öka avsevärt.
    7. Tillsätt 0,5 mM BaCl2 till badet och kontrollera om Pirk inaktiveras igen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Att genetiskt införliva en Uaa till ett protein i neuroner, är det första viktiga steget för att utforma lämpliga genen konstruerar att leverera och uttrycka gener effektivt i neuroner. Det finns tre genetiska komponenter för Uaa inkorporering: (1) målgenen med TAG amber-stoppkodon introduceras vid den valda platsen för Uaa inkorporering (2) ett ortogonalt tRNA för att känna igen det muterade TAG-stoppkodonet, och (3) en ortogonal aminoacyl -tRNA syntetas att ladda Uaa på ortogonala tRNA. Varje komponent måste drivas av en lämplig promotor. Dessa tre genkassetterna kan inkluderas i en plasmid eller separeras i flera plasmider. För att uttrycka Pirk i nervceller, är fotoreaktiva Uaa Cmn införlivas Kir2.1 med hjälp av ortogonala tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA-syntetas) par utvecklats till att bli specifika för Cmn 21,29. Återstoden Cys169 av Kir2.1 gen är muterad till TAG amber-stoppkodon (Kir2.1-TAG), och det fluorescerande proteinet mCitrine fuseras till C-terminalen av Kir2.1 att visualisera Pirk expression i neuronal kultur (figur 1).

Erhålla god kvalitet neuronal kultur är en förutsättning för lyckade Pirk experiment. Postnatal dag 1-4 Sprague Dawley råttungar används i allmänhet för neuronala kultur förberedelse, men råttembryon används också ofta. När ströks ut på täckglas i 24-brunnars plattor vid 1,0 till 1,5 x 10 5 celler / brunn densitet, bör en se väl separerade friska nervceller med inte alltför stor mikroglia eller annat skräp (Figur 2A). Friska nervceller har omfattande processer, och cellkroppar (soma) är fylligt (Figur 2B). Distinkt synlig suborganelle struktur är vanligtvis ett tecken på ohälsosam kultur. Neuronal kultur kan upprätthållas i 2-3 veckor vid 35 ° C i 5% CO2: 95% luft fuktad inkubator.

Calcium fosfat (Ca-P) transfektion är en mycket mild transfektion metod lämplig för känslig neuronal kultur. Det kräver dock extrem precision och försiktighet för att uppnå hög transfektionseffektivitet i neuroner. Stamlösningar måste lagras vid 4 ° C, och blandades för att göra 2x BBS-buffert på dagen för transfektion. Exakt pH-justering är nyckeln till att reproducerbart få framgångsrika resultat. Den 2,5 M CaCl2-lösning bör också göras färskt på dagen för transfektion. Alla buffertar behöva filtreras. Dessutom färska DNA-plasmider med hög renhet och kvalitet förbättra resultaten. För bästa resultat, kan man få färsk DNA mini-förberedd från inte överväxta Escherichia coli kultur (~ 12 h vid 37 ° C i skakinkubator). Efter att alla buffertar är redo, ta med lösningarna i vävnadsodling huven och förbereda för transfektion. Användning av en vortex med en låg hastighet, agitera transfektionslösningen under blandande. Omedelbart lägga den blandade lösningen till den neuronala culture, och föra kulturen skålen tillbaka till inkubatorn. Stoppa transfektion efter 45 min-1 h, och tillsätt det ursprungliga tillväxtmediet tillbaka till odlingen för kontinuerlig inkubation. De transfekterade nervceller kan visualiseras från 6 h ​​efter transfektion avslutas (figur 3). I närvaro av Cmn i odlingsmediet, är Pirk uttrycks och Pirk-uttryckande neuroner är gröna-fluorescerande på grund av den mCitrine proteinet sammansmält med C-terminalen i Pirk (Figur 3D). Pirk-uttryckande neuroner har normal basal fysiologi och de är kapabla att avfyra aktionspotentialer som svar på inducerad ström (Figur 4). Emellertid är denna serie av aktionspotentialer tryckas omedelbart med en kort ljuspuls lyste till cellen (figur 4A). När 0,5 mM BaCl2, en Kir2.1 specifik inhibitor, sättes till badet, är neuronaktivitet återupptas sedan, vilket indikerar att den föregående undertryckande berodde på aktiveringen av Kir2.1 av light (Figur 4B). Otransfekterade kontroll nervceller inte svara på ljus eller Ba 2+ (Figur 4C, D).

För att uttrycka Pirk in vivo, bör mycket rena och koncentrerade DNA-plasmider (2-5 mikrogram / ​​l) framställas. Specifika plasmider som användes i dessa experiment visas i figur 5A. Förutom den ortogonala tRNA Leu CUA / CmnRS paret och målet Kir2.1-TAG-genen, en gen som kodar grönfluorescerande protein med ett TAG-mutationen (GFP-TAG) är också sam-elektroporer som en fluorescerande reporter. Detektering av GFP fluorescens skulle indikera framgångsrik leverans av alla tre plasmider, eftersom TAG dämpning i GFP skulle kräva både tRNA Leu CUA och CmnRS; Cmn inkorporering i GFP-TAG skulle föreslå Cmn inkorporering i Kir2.1-TAGas bra, eftersom båda generna är närvarande i samma cell. De tre genkonstruktioner är alla Injected i den laterala ventrikeln av musembryon på E14.5 (figur 5B, vänstra panelen). Efter elektroporering, återgå embryona till bukhålan för att medge embryona att fortsätta utveckling. Två dagar senare injicera ungefär 2-5 pl Cmn-Ala (500 mM) till electroporated sidan eller båda sidorna av den laterala ventrikeln, på liknande sätt som DNA-injektion (figur 5B, mellersta panel). Återigen, åter embryon till bukhålan för kontinuerlig utveckling. Embryona kan skördas på E17.5 för avbildning eller elektrofysiologiska analyser. Som väntat, endast med Cmn-Ala injektion, är gröna fluorescerande celler observerades i mus neocortex. Celler med både röd och grön fluorescens borde ha Cmn införlivas Kir2.1-TAG att göra Pirk kanaler (figur 6A). Hela-cell inspelning från embryonala hjärnbarkens skiva sker på samma sätt som det görs på neuronal kultur. De gröna och röda fluorescerande nervceller har ingen aktiv ström vid netivt hållpotential, men en kort ljuspuls aktiverar snabbt inåt ström (Figur 6B). Strömmen helt blockerad genom att tillsätta Ba 2+, vilket bekräftar att det genereras av Pirk.

Figur 1
Figur 1: Pirk expressionsplasmid set för neuron kultur Scheme visar exempel på plasmid design för Pirk uttryck i neuronal kultur.. Top plasmid kodar Kir2.1 genen (grå) med en enda aminosyramutation i C169 platsen under cytomegalovirus (CMV) promotorn. C169 är muterad till TAG amber-stoppkodon, där Uaa Cmn skulle införlivas. Kir2.1 genen följs av mCitrine genen (grön). mCitrine fuseras till C-terminalen på Kir2.1 genen för att visualisera Pirk uttryckande celler. Botten plasmid kodar CmnRS (rosa), den Cmn specifika syntetas, som drivs av musen fosfoglyceratkinas-1 (mPGK) promotor. tRNA > Leu CUA (blå), den rätvinkliga tRNA 21, uttrycks också i samma plasmid drivs av H1 promotorn, men i motsatt riktning.

figur 2
Figur 2: Rat hippocampus primär neuronal kultur Exempel bilder som visar friska råtta hippocampus neuronala kulturer.. (A) En DIC bild av neuronal kultur på 10 dagar in vitro (DIV). Nervceller mogna som de filial ut dendriter och axoner. Mikroglia-celler (små och runda celler utan processer) samexisterar men inte överväldiga kulturen. (B) En förstorad DIC bild av friska odlade nervceller. En frisk neuron uppvisar knubbig cellkroppen (soma) och uttalade Dendrites / axoner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 3
Figur 3:. Pirk expression i odlade primära neuroner DIC och fluorescens bilder av rått hippocampusneuroner odlade in vitro och transfekterade med genkonstruktioner som avbildas i figur 1 för Pirk expression. När Cmn inte tillsätts i odlingen efter transfektion (A och B) behövs ingen grön fluorescens detekteras från neuronerna. I närvaro av Cmn (1 mM) i odlingsmediet, transfekterade nervceller är kapabla att uttrycka fullängds Pirk-mCitrine proteiner, vilket visar grön fluorescens (C och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

.jpg "/>
Figur 4:. Ljus aktivering av Pirk undertrycker Säker råtta hippocampus neuroner (A) En enda ljuspuls dämpar aktiviteten i hippocampus neuron uttrycker Pirk. Representativa spännings spår registreras kontinuerligt i strömklämma. Action potentiell bränning framkallas av 20 pA ströminjektion (I-steg). Ljusexponering (385 nm, 40 mW / cm2, en sekund, indikerat med pil) snabbt och fullständigt undertrycker neuron. Bränning återställs med extracellulärt 500 mM BaCl2, som selektivt hämmar Kir2.1 kanaler. (B) Ultraviolett (UV) belysning (385 nm, 40 mW / cm2, 6 sekunder, angiven med gul ruta) ändrar inte retbarhet av kontroll, otransfekterade nervceller. Action potentiell bränning framkallas med 50 pA aktuella injektion (I-steg). (C och D) Varken UV-belysning eller BaCl2 (500 mM) påverkar retbarhet av kontroll nervceller. handling potentIAL framkallas med 50 pA aktuella injektion (I-steg).

figur 5
Figur 5: Rutiner för Pirk uttryck i mus neocortex in vivo. (A) Pirk expressionsplasmid inställd. Topp plasmid: plasmiden för CmnRS drivs av CAG-promotorn och mCherry via intern plats ribosomen inträde (IRES). mCherry fluorescens skulle kontrollera framgångsrik uttryck för CmnRS. USA plasmid: plasmiden för Kir2.1 gen tillsammans med tre kopior av tRNA Leu CUA, den ortogonala tRNA för Cmn inkorporering 21. Botten plasmid: plasmiden för GFP_Y182 TAG. Genen för GFP är konstruerad med en amber-stoppkodon vid tillåt Tyr182 plats (GFP_Y182 TAG) för att visualisera framgångsrika införlivandet av Cmn till TAG platser 21. (B) tecknad showing en experimentell procedur för Pirk expression in vivo. Genkonstruktioner för Pirk expression injiceras i musen neocortex (E14.5) och elektroporerades in utero (vänster panel). Två dagar senare, är Cmn-Ala injiceras till ventrikeln i electroporated sida eller båda sidor av hjärnhalvorna (mellersta fältet). Slice avbildning och elektrofysiologisk analys kan utföras på E17.5-E18.5 (höger panel).

figur 6
Figur 6: Pirk uttryck i mus neocortex och ljusaktivering. (A) fluorescensbilder av mus embryonala kortikala neuroner visar införlivandet av Cmn till GFP och Kir2.1 proteiner in vivo. De tre genkonstruktioner i figur 5A är elektro i livmodern. mCherry fluorescens demonstrerar framgångsrik expression av Cmn specifika synthetase-genen, CmnRS. GFP fluorescens detekteras endast med Cmn-Ala injektion (botten), vilket indikerar Cmn inkorporering i GFP TAG och sannolikt Cmn inkorporering i Kir2.1 TAG. Således indikerar grönt och röd fluorescens framgångsrik expression av alla tre plasmider och Cmn inkorporering. (B) IV tomt av strömmar som registrerats från möss hjärnbarkens nervceller som visar ljusberoende aktivering av Pirk. Två dagar efter genkonstruktioner i figur 5A var elektro var Cmn-Ala injiceras i livmodern; 12-48 h efter Cmn-Ala injektionen togs hjärnbarkens akut skivor framställes ur embryona. Pirk-uttryckande neuroner i de segment, som detekteras av både röd och grön fluorescens, registreras före (svart) och efter (blå) ljusexponering (385 nm, 8 mW / cm 2, 10 sek för mättad exponering). BaCl2 (500 mM) tillsätts för att kontrollera Pirk specifika strömmarna efter fotoaktivering (orange).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att uppnå en effektiv fotomodulering, är det viktigt första steg för att besluta om att införliva fotokänsliga Uaa i målproteinet. Strukturell och funktionell information av målproteinet är till stor hjälp för att vägleda valet av kandidatplatser. Samtidigt, skulle syftet med ljusreglering bestämma vilken plats som är mest lämpliga. Efter att ha valt kandidatplatser, rekommenderar vi att testa platser i däggdjurscellinjer såsom humana embryonala njur (HEK) celler för enklare kultur och manipulation, innan man går vidare till primära neuroner och in vivo. För att identifiera en plats för Kir2.1 fotoaktivering, flera platser längs por i Kir2.1 har inledningsvis testats i HEK-celler. C169 av Kir2.1 befanns optimal, eftersom Kir2.1 porstorlek där C169 bor är stor nog att rymma Cmn sidokedjor men liten nog för Cmn sidokedjor för att blockera jonisk passage. När Cmn inkorporerades på C169 i Kir2.1 uttryckt i HEK-celler, than resulterande mutant Kir2.1 var inaktiv men blev aktiveras vid en kort Pule av ljus, vilket bekräftar framgångsrik Pirk utveckling 21.

Effektiv expression av den ortogonala tRNA och syntetas är kritisk för att erhålla hög Uaa inkorporering effektivitet i celler och in vivo. Den ortogonala syntetas genen effektivt uttrycks med användning av polymeras II-promotor och poly-A-signaler som ofta används i däggdjursceller och nervceller. För uttryck av den ortogonala tRNA, en speciell typ-3-polymeras Ill-promotorn, såsom H1 promotor som används här, tillsammans med en 3'-flankerande sekvens behövs såsom beskrivits tidigare 18,20. För in vivo-studier, fann vi att tre kopior av tRNA-expressionskassetten ökade Cmn inkorporering verkningsgrad jämfört med en kopia (Figur 5A). I en annan studie i däggdjursceller, öka antalet tRNA expressionskassetten också ökat Uaa inkorporering effektivitet 30. Theröre, vi föreslår att optimera antalet tRNA expressionskassetter för olika Uaas, celler och målproteiner när Uaa inkorporering effektivitet måste förbättras. Biotillgängligheten av Uaas i celler och in vivo är en annan avgörande faktor för Uaa inkorporering. Tidigare studier har visat att förestring av Uaas ökar deras upptag i däggdjursceller 31, och att framställningen av Uaas i dipeptiden form ökar Uaa upptag i celler i Caenorhabditis elegans 32. Vi fann att direkt mata Cmn till neuronala odlingsmedier är tillräcklig för Cmn inkorporering i Kir2.1 uttryckt i odlade primära nervceller, men otillräcklig för införlivande i mushjärna in vivo 21. Därför var dipeptiden Cmn-Ala syntetiserades och injicerades i mushjärna. Oligopeptid transportör PEPT2 starkt uttryckt i gnagare hjärnor 33, som kan underlätta transporten av dipeptiden i nervceller. Den internalis DIPEptide skulle hydrolyseras av cellulära peptidaser att ge Uaa Cmn för inbyggnad. I själva verket, med denna optimering vi uppnått effektiv Cmn inkorporering i neuronala proteiner på flera områden i den framväxande mushjärna, inklusive neocortex, thalamus och hypothalamus 21.

Framgångsrik Pirk uttryck i nervceller är starkt beroende av framställningen av friska neuronala kultur. Varje steg i protokollet ska utföras på ett exakt och noggrann sätt. Efter odling beredning, är det bäst att bibehålla kulturen i inkubatorn utan störningar. Öppning och stängning av inkubatordörren, liksom att flytta odlingsskål i och ut ur inkubatorn, kan lägga till upp till att undergräva kvaliteten på kultur. Lägre inkubatortemperaturen (35 ° C i stället för 37 ° C) bidrar till att minska excitotoxicitet. På ett liknande anmärkning, bör Ca-P transfektion göras med extra försiktighet. Framställning av 2x BBS-buffert är ett kritiskt steg. Det är en bra idé till CaliBrate det optimala pH för 2x BBS-buffert mellan pH 6,90-7,15, eftersom nya DNA-konstruktioner eller preps kunde ändra transfektion villkor. Den pH kan justeras med precision till 0,01 siffror om det bidrar till att uppnå konsekventa resultat. Före transfektion, är tillväxtmediet av neuronal kultur ersattes med färsk ett. Det är viktigt att spara den ursprungliga odlingsmediet, och lägga tillbaka till kulturen efter transfektion för att återställa det ursprungliga tillståndet. Upprätthålla neuron kultur i färskt medium efter transfektion skulle störa neuroner från att återvinna, eftersom det saknar viktiga molekyler för cellproliferation såsom tillväxtfaktorer som frigörs från neuroner.

För ljusaktivering av Pirk i odlade celler och vävnadsskivor, korrekt ljuskälla och leveransmetod behöver bestämmas. Cmn absorberar lång och medellång våg UV-ljus (280-400 nm). Emellertid utvidgas exponering för UV-ljus, särskilt till kortare våglängd UV-ljus, skulle vara skadligt för celler. Vid same tid, långt rött ljus kunde värma upp provet störa cellerna. Därför är en LED med en enda-emissionsvåglängden bäst för Pirk aktivering. För Cmn fotolys, en LED med utsläpp av 385 nm (~ 40 mW, Prizmatix) valdes. Lysdioden är externt installeras i närheten av mikroskopet, och en optisk fiber används för att leverera ljus exakt neuron i fokus. För reproducerbar datainsamling, är den optiska fibern inrätta 1 cm vid 45 ° vinkel från neuron i fokus. Ljuseffekt vid prov mättes 40 mW / cm 2. Det rekommenderas också att regelbundet kontrollera LED prestanda när du använder en optisk effektmätare.

Visar vi att i livmodern elektroporering är en effektiv teknik för att genetiskt införliva Uaas in vivo. In utero elektroporering av plasmid-DNA i musen embryonala neocortex utförs såsom beskrivits tidigare 34, med mindre modifieringar. För att uttrycka Pirk proteiner i neonatal mushjärnor, är två kirurgiska ingrepp krävs (figur 5B). Det första steget är att injicera genkonstruktioner för Pirk expression följt av elektroporering. Två dagar senare, den andra hjärn injektion utförs för att leverera Cmn-Ala. Det skulle kräva praxis att skickligt utföra operationer utan att stressa djuren för mycket. Efter varje operation, bör djuren skötas och kontrolleras regelbundet under hela återhämtningen. Tillräcklig och snabb tillgång till Cmn i hjärnan är ytterst viktigt för Pirk expression. 2-5 | il av Cmn-Ala (500 mM) typiskt injiceras till en embryonal hjärna. Ibland hjälper det att injicera Cmn-Ala i kammaren på både elektro och den motsatta halvklotet, eftersom Cmn-Ala från den motsatta sidan skulle diffundera till electroporated sidan för utökad Cmn försörjning. Med tanke på den allmänna nyttan av i livmodern elektroporering, skulle denna teknik kunna tillämpas inte bara på hjärnbarkens nervceller men också till nervcelleri andra delar av hjärnan såsom striatum, diencephalon och lillhjärnan, när elektroporering / injektionsstället justeras för varje region. Embryonala / neonatal hjärnor är mycket mjukare än vuxna hjärnor, så det skulle vara svårt att få akut skivor för elektrofysiologi experiment. Agaros inbäddning hjälper till att stabilisera den embryonala hjärnans struktur för vibratome kapning. Även låg smältpunkt agaros minimerar temperaturchock till hjärnvävnader behövs försiktig när hälla smält agaros över kalla hjärnor. Effekten av temperaturchock till vävnaden från agaros inbäddning var omärkbart under hela cellen inspelning.

Genetiskt kodning fotokänsliga Uaas i odlade nervceller och in vivo, exemplifieras av Pirk här, kommer att ge en optogenetic teknik för att styra olika neuronala proteinaktiviteter med ljus i sin ursprungliga miljö. Det nuvarande protokollet presenterar ett förfarande steg-för-steg för att utföra Pirk uttryck och aktiveringsexperiment in neuronal kultur in vitro och in gnagare hjärna in vivo, som representerar den första framgångsrik utveckling av Uaa system för användning i däggdjurshjärnor. Den har potential att dra nytta forskning av många naturliga proteiner, såväl som deras implikation i sjukdomar. Till exempel, α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer och N-metyl-D-aspartat (NMDA) receptorer delar liknande transmembrana strukturer med Kir2.1 kanaler. Det skulle därför vara möjligt att tillämpa Pirk metod för att dessa ligandreglerade jonkanaler. Dessutom skulle Pirk teknik också användas för att ta itu med patofysiologin för Kir2.1 relaterade genetiska sjukdomar, såsom Andersens syndrom och hjärt kort QT-syndrom 35,36. I tillägg till "block-och-release" Cys via Cmn, flertal aminosyror såsom tyrosin, serin, lysin, glutamat, aspartat och glycin har bur med olika photoreleasable grupper 37. Således kan liknande strategier vara brukd till foto-reglera dessa aminosyror i neuroner in vitro och in vivo. Dessutom kan reversibel optisk kontroll uppnås med azobensen som innehåller Uaas, och sådana Uaas har nu genetiskt kodad i E. coli och däggdjursceller 38,39.

Sammanfattningsvis utgör detta protokoll en generell metod för att kontrollera aktiviteten av neuronala proteiner i deras nativa inställningar med ljus. I jämförelse med andra optogenetic metoder som involverar opsin-familjen och andra ljuskänsliga proteiner eller domäner, använder denna metod genetiskt kodade ljuskänslig Uaas och förändringar bara en enda återstod. Därför bör det ha minimal störning till funktionen, handel och lokalisering av målproteinet under utredning. Hög ställes selektivitet kan också uppnås med dessa genetiskt kodade ljuskänsliga Uaas för att ge större flexibilitet och specificitet för detaljerad molekylär undersökning. Detta protokoll ger också första comprehensive, lätt att följa förfarandet hur man framgångsrikt införliva Uaas till proteiner i nervceller in vitro och in vivo. Optiska kontrollen av generella proteiner via genetiskt kodad Uaas i neuroner in vitro och in vivo har en stor potential att gynna både grundläggande och translationell forskning, och detta protokoll skulle bidra till att främja dess tillämpning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Tags

Neuroscience onaturlig aminosyra genetiska koden bärnsten suppression jonkanal optogenetik ljus-aktivering optisk kontroll photocage neuron nervaktivitet hjärna
Optisk kontroll av en Neuronal Protein Med hjälp av en genetiskt kodad Unnatural Amino Acid i neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. … More

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter