Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optisk kontrol af en neuronal protein under anvendelse af en genetisk indkodede naturlig aminosyre i neuroner

Published: March 28, 2016 doi: 10.3791/53818
Automatic Translation
1, 2, 3
1Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, 2Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Introduction

Sammenlignet med konventionel elektrisk stimulation, photostimulation giver større tidsmæssig og rumlig opløsning med mindst mulig gene for den fysiologiske system prøver. Da demonstrationen for at bruge lasere til at stimulere neuroner i 1971 en, har mange kreative måder blevet opfundet til eksogent styre neuronal aktivitet med lys. Optisk frigivelse af photocaged agonister har længe været anvendt til at undersøge fysiologiske respons af den neuronale netværk til ligander 2,3,4. Denne teknik har begrænset specificitet skyldes diffusion af bur agonister. Genetisk specificitet opnås ved ektopisk udtrykker lysfølsomme opsin kanaler og pumper 5,6,7, og det er blevet anvendt med succes til at modulere udvalgte neuronale netværk i forskellige modelorganismer. Det ville imidlertid være vanskeligt at anvende denne metode på optisk styre forskellige andre neuronale proteiner, eftersom podning photoresponsiveness fra opsin proteiner til andre proteiner would kræve intens teknik, som kan ændre de fysiske egenskaber af proteinet under undersøgelse. Kemisk tøjring et eksogent lysfølsomme ligand til et protein har vist en anden måde at kontrollere funktionaliteten af kanalproteiner 8,9,10. Liganden præsenteres eller trækkes tilbage fra bindingsstedet af proteinet gennem fotoisomerisering af azobenzen delen. Tethering kemi begrænser anvendelsen hovedsageligt til det ekstracellulære side af membranproteiner, bortset fra det intracellulære side og intracellulære proteiner.

Photoresponsive Uaas, efter at være blevet inkorporeret i proteiner, giver en generel strategi for at manipulere proteiner med lys. I tidlig indsats, tRNA'er kemisk acyleret med photocaged Uaas blev mikroinjiceret i Xenopus oocytter til at optage Uaas i membranreceptorer og ionkanaler 11, som har avancerede forståelse af deres struktur og funktion relationer 12,13,14.Denne mikroinjektion tilgang er hovedsageligt begrænset til store oocytter. Genetisk inkorporering af en ULA omgår teknisk udfordrende tRNA acyleringen og mikroinjektion ved hjælp af en ortogonal tRNA / syntetase par, som inkorporerer ULA gennem endogent protein oversættelse i levende celler 15,16,17,18. UAA inkorporering i neuronale proteiner er blevet påvist i primære neuroner og neurale stamceller 19,20. For nylig er photoresponsive ULA blevet genetisk inkorporeret i en neuronal protein i pattedyrs hjerne in vivo for første gang 21. Disse fremskridt gør det muligt at studere neuronale proteiner med Uaas i deres native cellulære miljø.

Indad rektifikation kaliumkanal Kir2.1 er en stærk ensretter, der passerer K + -strømme lettere ind end ud af cellen, og det er vigtigt i reguleringen fysiologiske processer herunder celle uro, vaskulær tonus, puls, renal salt flow og insulin frigive 22. Overekspression af Kir2.1 hyperpolariserer membranpotentialet af målet neuron, som bliver mindre overgearet 23,24. Til optisk kontrol Kir2.1 i dets native celler, Kang et al. Genetisk inkorporeret et fotofølsomt ULA i Kir2.1 udtrykkes i pattedyrceller, neuroner og embryonale musehjerner 21. En kort puls af lys var i stand til at konvertere ULA til en naturlig aminosyre Cys og dermed aktivere target Kir2.1-proteinet. Når dette billede-inducerbare indad rektifikation kalium (Pirk) kanalprotein blev udtrykt i rotte hippocampale primære neuroner, det undertrykte neuronfyring som reaktion på lys aktivering. Desuden blev Pirk kanal udtrykt i den embryoniske mus neocortex, og lysaktiveret Pirk strøm i corticale neuroner blev målt. En vellykket gennemførelse af ULA teknologi in vivo i pattedyrs hjerne åbner døren til optisk kontrollere neuronale proteineri deres native miljø, som gør det muligt optisk dissektion af neuronale processer og mekanismer på molekylært niveau.

I denne protokol beskriver vi procedurer for genetisk inkorporering af Uaas i primære neuroner i kultur og i embryonale musehjerne in vivo. Den photoresponsive ULA CMN og Kir2.1 bruges til at illustrere processen. Metoder til at vurdere succes ULA inkorporering og optisk kontrol af neuronal protein aktivitet leveres. Denne protokol giver en klar vejledning til genetisk koder Uaas i neuroner og in vivo, og at optisk regulering neuronal protein funktion via en photoresponsive ULA. Vi forventer, at denne protokol til at lette vedtagelsen af in vivo ULA teknologi til neurovidenskab og optogenetic biologiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer i den aktuelle undersøgelse blev udført ved hjælp af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte protokoller for håndtering af dyr på The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.

1. ULA Indbygning i Kir2.1 og Ekspression af Resulterende Pirk i Primary Neuronal Kultur

  1. DNA Byggeri
    1. Vælg et målområde i Kir2.1 for ULA inkorporering. Udnytte forudgående viden og information om strukturen og funktionen af Kir2.1, således at den valgte sted med photoresponsive ULA indbygget muliggør optisk modulation af Kir2.1 funktion 21.
    2. Konstruere en rekombinant DNA, der koder Kir2.1-genet med den valgte sted muteret til TAG amber stopkodonen. Bruge standard kloningsteknikker 25 at klone Kir2.1-TAG DNA i en mammal ekspressionsplasmid.
    3. Klon tRNA / syntetase gener, der er specifikke for ULA og inkorporerer ULA som svar påTAG stopcodonet til et andet pattedyr ekspressionsplasmid 21.
      Bemærk: For optimal ULA inkorporering, kan forskellige initiativtagere og kombinationer af gen-kassetter (for tRNA, syntetase, og Kir2.1) testes i forskellige plasmider.
    4. Opnå en høj kvalitet plasmid-DNA'er under anvendelse af miniprep eller Maxiprep kommercielle kit ifølge producentens protokol. Omkring 1,9 af forholdet på 260/280 er optimal for det rene DNA. Når det er nødvendigt, udføre en agarosegelelektroforese at kontrollere renheden af det prepped DNA 25. Supersnoet plasmid-DNA'er med høj renhed er bedst for neuronal transfektion.
  2. Kultur rottehippokampale Primær Neuroner
    1. Sted dækglas (cirkler, 12 mm i diameter) i plader med 24 brønde, én dækglas på hver brønd, og pels hver brønd med 250 pi 0,5 mg / ml poly-D-lysin (i 100 mM boratpuffer: 1,24 g borsyre syre og 1,90 g natriumtetraborat i 400 ml deioniseret destilleret H2O eller Hedeselskabet 2
    2. På dagen for dissektion, indsamle neonatale hjerner fra postnatal rotteunger (1-4 postnatal dag) efter bedøve dem med isofluran, og skar hovedet. Bedøver hvalpe i en bedøvelse kammer indeholdende isofluran (2-4%). Vent, indtil de mister bevidstheden og undlader at reagere på taktile stimuli og at klemme af poterne.
    3. Brug af standard teknik 26, dissekere hippocampi fra hjernen i varmt (~ 37 ° C) saltvand (10 mM HEPES og 20 mM D-glucose tilsættes i Hanks balancerede saltopløsning), og indsamle hippocampi i et konisk rør med 4,5 ml varm saltopløsning .
    4. Der tilsættes 500 pi 2,5% trypsin til hippocampi (0,25% endelig trypsin koncentration), og der inkuberes i 10 minutter i et vandbad ved 37 ° C.
    5. Skyl vævet med saltvand (3 x 10 ml) og tritureres.
    6. Gendan de dissocierede neuroner i 1 ml warm vækstmedier indeholdende Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 5% kalvefosterserum (FBS), 21,2 mM D-glucose, 2 mM L-glutamin, 2% B-27 og 0,1% serum forlænger.
      Bemærk: Læg L-glutamin og B-27 på dagen for dissektion at forberede frisk vækstmedium.
    7. Tæl neuroner med et hæmocytometer, og pladen dem på dækglas i 24-brønds plader ved 1,0-1,5 x 10 5 celler / brønd densitet med 500 pi vækstmedier efter filtreret gennem et 40 um nylonnet.
    8. Inkubér den neuronale kultur ved 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft-befugtet inkubator i 2-3 uger. For det bedste resultat, undgå at forstyrre kulturen så meget som muligt under inkubation.
  3. Calciumphosphat (Ca-P) Transfektion af primær Neuronal Kultur
    1. Gør stamopløsninger og opbevares ved 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hydroxy-ethyl] -2-aminoethansulfonsyre) buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); sterilt Hedeselskabet 2 O; steril 1 N NaOH.
    2. På dagen for transfektion, lave frisk 2,5 M CaCl2-opløsning i Hedeselskabet 2 O og sterilt filter med 0,22 um filter. Lave frisk 2x BES-saltvand (BBS) buffer indeholdende 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, og 280 mM NaCI ved pH 7,00 (justering af pH med NaOH) og sterilt filter med 0,22 um filter.
      Bemærk: Beregn mængden af CaCl2-opløsning og BBS-buffer afhængigt af antallet af dækglas, der skal transficeres. Også se på 1.3.4.
    3. Udskift vækst dyrkningsmedier med 500 pi frisk forvarmet transfektion vækstmedier. (Transfektion medier kan gøres med MEM plus 21,2 mM D-glucose).
      Bemærk: Du må ikke kassere den gamle medier.
    4. Beregne mængden af Hedeselskabet 2 O og klar til at tilføje for at gøre transfektionen opløsning (33 pi per hver dækglas) indeholdende 1,65 pi CaCI2, 0,7 ug DNA, og 16,5 &# 181; l 2x BBS.
    5. Forbered transfektion opløsning umiddelbart før du tilføjer den til kulturen. For at forberede, første mejetærsker CaCl2 og Hedeselskabet 2 O under langsom omrøring af røret. Fortsæt omrøring og tilsæt langsomt DNA i opløsningen. Til sidst tilsættes 2x BBS buffer dråbevist under omrøring.
    6. Umiddelbart tilsættes 30 pi af transfektion opløsning til hver dækglas af neuronal kultur.
    7. Rock dyrkningsskålen en par gange for at blande opløsningen og inkuberes ved 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft-befugtet inkubator i 45 min-1 time. Efter neuroner inkuberes med transfektion opløsning, ville meget fine Ca-P præcipitater danner et lag, der dækker neuroner.
    8. Erstatte transfektion medier med 500 pi forvarmet vaskebuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glucose ved pH 7,3, steril filtreret med 0,22 um filter) og inkuberes ved 356; C i en CO 5% 2: 95% luft-befugtet inkubator i 15-20 min. Ca-P præcipitater ville forsvinde efter vasketrinnet.
    9. Udskift vaskebufferen med 500 pi frisk vækstmedier. Igen, udskifte vækstmediet med den gemte originale medier.
    10. Tilsæt UAA CMN (forblandet i 50 pi varm vækst medier) til kulturen til at nå 1 mM slutkoncentration.
    11. Inkubér det transficerede kultur ved 35 ° C i en 5% CO2: 95% luft-befugtet inkubator i 12-48 timer før assays.
  4. Hele Cell Optagelse med lys Aktivering
    1. Forbered ekstra / intracellulære løsninger. Den intracellulære opløsning indeholder 135 mM kaliumgluconat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP og 0,3 mM Li 2 GTP ved pH 7,4. Den ekstracellulære optagelse opløsning indeholder 150 mM NaCl, 3 mM KCI, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glucose og 10 mM HEPES ved pH 7,4.
    2. Installer en lysdiode (LED) med emission på 385 nm ved mikroskop ved riggen til at levere lys til omdrejningspunktet fra 1 cm væk i en 45 ° vinkel. Kontroller magt LED med en lys powermeter.
  5. Træk patch pipetter fra glaselektroder bruger kommerciel mikropipette aftrækker at have 3-6 MOhm pipette modstand. Følg producentens anvisninger for at oprette mikropipetten aftrækker.
    1. For at teste pipette modstand, først fylde pipetten med den intracellulære løsning, og placere den på holderen elektroden. Dyp pipetten i en 35 mm dyrkningsskål fyldt med den ekstracellulære opløsning, som er tilføjet på mikroskopet platform. Fordyb en jordelektrode i skålen til at fuldføre et kredsløb.
    2. Tænd for forstærkeren / digitizer og starte en dataindsamling software. Overvåg pipette modstand med en membran testprotokol.
  6. Tag et dækglas af neuron kultur fra inkubatoren og skyl gang i den ekstracellulære opløsning. Ved hjælp af vakuum fedt, holde dækglasset i midten af ​​en 35 mm dyrkningsskål fyldt med friske ekstracellulære løsning.
  7. Placer dækglasset / skål på elektrofysiologi mikroskop platformen.
  8. Brug af standard patch fastspænding teknikker, lappe en neuron med mCitrine fluorescens 27. Optag neuronal aktivitet ved hjælp af strømtang (I-clamp) metode. Først justeres hvilende potentiale til omkring -72 mV ved injektion af en lille strøm. Derefter injicere et skridt strøm (10-200 pA) for at inducere kontinuerlig fyring (5-15 Hz) af aktionspotentialer.
  9. Manuelt, eller ved hjælp af datafangst software, flash en puls (en syndGLE puls på 100 ms -1 sek varighed) af LED lys til neuron under optagelse, og se, om aktionspotentialer er berørt.
  10. Tilsæt 0,5 mM BaCI2 til bad og kontrollere, om aktionspotentialer inddrives.

2. ULA Indbygning i Kir2.1 og Ekspression af Resulterende Pirk i mus embryonale Brain in vivo

  1. DNA Byggeri
    1. Design plasmid-DNA'et på lignende måde som i trin 1.1. Til in vivo-ekspression, bruge en stærk promotor såsom CAG (kylling beta-actin promotor med CMV forstærker).
    2. Oprensning af DNA med et endotoksin-frit maxiprep kommercielt kit ifølge producentens protokol. Udfør phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning 25 til at erhverve kvalitet DNA ekstremt høj (kondenseret til 2-5 pg / pl).
  2. I Utero Elektroporation til mus embryonale neocortex
    Bemærk: Den grundlæggende Technique for in utero elektroporation er tidligere 28 beskrevet.
    1. Bedøver en tidsindstillet gravid musen på den embryonale dag 14.5 (E14.5) med natrium pentobarbital (intraperitoneal injektion, 50 ug per gram kropsvægt) eller isofluran (inhalation, 2-4%). Overvåg bedøvelse dybde ved at kontrollere tab af bevidsthed og ingen respons på taktile stimuli og at klemme af poterne.
    2. Lave et lille snit på den abdominale midterlinjen. Forsigtigt udsætte livmoderhornene med pincet og fingerspidser.
    3. Der indsprøjtes ca. 1 pi DNA-opløsning (2-5 pg / pl af hvert plasmid, afhængigt af konstruktionen) i den laterale ventrikel i hvert kuld med en glaspipette indført gennem livmodervæggen. I de fleste tilfælde er omkring 60-80% af de samlede embryoner injiceret.
    4. Elektroporere embryoner med en elektroporator (33-35 V, 50 ms varighed, 950 ms interval, 4-8 pulser).
    5. Retur livmoderhornene til bughulen forsigtigt med forCEPS og fingerspidser. Sutur musklen væg og derefter huden med kirurgisk sutur at tillade embryoner til fortsat udvikling.
  3. ULA Mikroinjektion
    1. Lave et lille snit på abdominale midterlinjen igen ved E16.5, og forsigtigt udsætte livmoderhornene med pincet og fingerspidser.
    2. Injicer omkring 2-5 pi CMN-Ala (500 mM) til den elektroporerede side eller på begge sider af laterale ventrikel med en glaspipette indført gennem livmodervæggen. For at øge CMN biotilgængelighed, bruge dipeptid CMN-Ala (CMN-alanin) til at levere CMN in vivo 21.
    3. Igen, returnere livmoderhornene til bughulen forsigtigt med pincet og fingerspidserne. Sutur musklen væg og derefter huden med kirurgisk sutur at tillade embryoner til fortsat udvikling.
  4. Opnå Akut Brain Skiver
    1. Lav 1 L kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) indeholdende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCI 2 PO4, 26,2 mM NaHCO3, og 11 mM glucose ved pH 7,3.
    2. Tag 200 ml ACSF og hurtigt fryse ved -80 ° C i 20-30 min. Bubble resten af ACSF med 5% CO2: 95% O2 gas ved stuetemperatur.
    3. Forberede og sterilisere kirurgi værktøjer til at høste hjerner fra fostre. forberede Også en spand is.
    4. Gør ~ 100 ml 4% agarose med lavt smeltepunkt opløsning i en kolbe ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Afkøle opløsningen i ca. 5 min, før den begynder at størkne.
    5. Aflive musen 12-24 timer efter CMN-Ala injektion af CO 2 overdosis. Lav store indsnit i maveregionen, og dissekere de elektroporerede / mikroinjicerede embryoner fra livmoderen med fine saks og pincet.
    6. Harvest hjerner fra fostre med fine saks og pincet.
    7. Placer hver hjerne på en 10 cm dyrkningsskål placeret på ice bucket. Divider to halvkugler med en skarp kniv, og læg hverhalvkugle på skålen med midsagittal plan, der berører bunden af ​​skålen. Hurtigt hæld det over agarose opløsning over hjerner (ca. 500 pi per halvkugle).
    8. Ved hjælp af en skarp klinge, firkantet skåret agarosen omkring en hjerne til at gøre en hjerne-embedded agarose blok.
    9. Ved hjælp af væv lim, lim ned midsagittal plane overflade agarose blok på en holder til vibratome. Fyld vibratome kammer med præ-kølet ACSF og sender 200 um sagittal hjernen skiver.
    10. Inkuber akutte skiver i ACSF suppleret med 3 mM myo-inositol, 0,4 mM ascorbinsyre og 2 mM natriumpyruvat ved 33 ° C i 42 min, mens gennembobling med 5% CO2: 95% O2 gas.
    11. Efter 42 min, slukke ovnen og fortsætter med at inkubere skiverne ved stue temp med boblende. Start hel-celle patch optagelse mindst 15 minutter efter at slukke for varmeapparatet.
  5. Hele Cell Optagelse med lys Aktivering
    1. Forbered Intracellular opløsning indeholdende 130 mM kaliumgluconat, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM natrium creatinphosphat og 0,1 mM Na 3 GTP ved pH 7,3 justeret med KOH.
    2. Træk patch pipetter fra glaselektroder bruger kommerciel mikropipette aftrækker at have 3-6 MOhm pipette modstand.
    3. Opsæt skive elektrofysiologi rig til hel-celle patch fastspænding og superfuse optagelsen kammer med ACSF på 2 ml / min sats med en perfusion pumpe. Juster temperaturen i kammeret til 33 ° C.
      Bemærk: Den skive elektrofysiologi Riggen er udstyret med en perfusion kammer, en nedsænkning i vand objektiv og en temperatur controller. Også, GFP filter (excitation: 480/30 nm, emission: 535/40 nm) og mCherry filteret (excitation:: 580/20 nm emission 675/130 nm), der kræves.
      1. Installer en LED med emission på 385 nm ved mikroskop ved riggen til at levere lys til omdrejningspunktet fra 1 cm væk på en 45 °vinkel. Kontroller magt LED med en lys powermeter.
    4. plukke forsigtigt en hjerne skive med et glas pipette og plads i perfusion kammer. Hold skive med en harpe.
    5. Lappe en neuron med mCherry / GFP fluorescens fra neocorticale region 27. Optag Pirk aktivitet under anvendelse af spænding clamp (V-clamp) metode. Hold først membranpotentialet ved -60 mV. Derefter optage strømme ved faste negative membranpotentialer (-100 mV) eller spænding ramper (-100 mV til +40 mV). Specifikt overvåge Kir2.1 specifikke indadgående strømme ved -100 mV.
    6. Manuelt, eller ved hjælp af datafangst software, flash en puls (en enkelt puls på 100 ms -1 sek varighed) af LED-lys til neuron under optagelse, og se, om Pirk proteiner aktiveres. Når Pirk er aktiveret, vil indadgående strømme på -100 mV stige betydeligt.
    7. Tilsæt 0,5 mM BaCI2 til bad og kontrollere, om Pirk inaktiveres igen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til genetisk indarbejde en ULA til et protein i neuroner, det første vigtige skridt er at designe passende gen konstruerer at levere og udtrykke gener effektivt i neuroner. Der er tre genetiske komponenter til UAA inkorporering: (1) målgenet med TAG amber-stopkodon indført ved den valgte site for UAA inkorporering (2) en ortogonal tRNA til at genkende den muterede TAG stopkodon og (3) et ortogonalt aminoacyl -tRNA syntetase at oplade ULA på ortogonale tRNA. Hver komponent skal drives af en passende promotor. Disse tre genkassetter kan indbefattes i én plasmid eller adskilt i flere plasmider. For at udtrykke Pirk i neuroner, er foto-reaktive ULA CMN inkorporeret i Kir2.1 ved hjælp af de ortogonale tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA-syntetase) pair udviklet sig til at være specifik for CMN 21,29. Resten Cys169 af Kir2.1-genet er muteret til TAG amber-stopkodon (Kir2.1-TAG), og det fluorescerende protein mCitrine er fusioneret til C-terminalen af Kir2.1 at visualisere Pirk ekspression i neuronal kultur (figur 1).

Indhentning af god kvalitet neuronal kultur er en forudsætning for en vellykket Pirk eksperimenter. Postnatal dag 1-4 Sprague Dawley rotteunger anvendes generelt til neuronal forberedelse kultur, men rotteembryoer anvendes også ofte. Når udpladet på dækglas i 24-brønds plader ved 1,0-1,5 x 10 5 celler / brønd densitet, bør man se godt adskilte raske neuroner med ikke for meget mikroglia eller andet affald (figur 2A). Sunde neuroner har omfattende processer, og celle organer (Soma) er buttet (figur 2B). Markant synlig suborganelle struktur er normalt et tegn på usund kultur. Neuronal kultur kan opretholdes i 2-3 uger ved 35 ° C i 5% CO2: 95% luft befugtet inkubator.

Calcium phosphat (Ca-P) transfektion er en meget blid transfektion metode passende til følsom neuronal kultur. Men det kræver, ekstrem præcision og forsigtighed for at opnå høj transfektionseffektivitet i neuroner. Stamopløsninger skal opbevares ved 4 ° C, og blandes for at gøre 2x BBS-buffer på dagen for transfektion. Præcis pH-justering er nøglen til reproducerbart få vellykkede resultater. 2,5 M CaCl2-opløsning bør også gøres fersk på dagen for transfektion. Alle puffere skal filtreres. Endvidere friske DNA plasmider med høj renhed og kvalitet forbedre resultaterne. For de bedste resultater, kan man få friske DNA mini-prepped fra ikke tilgroet Escherichia coli kultur (~ 12 timer ved 37 ° C i rysteinkubator). Efter alle de buffere er klar, bringe løsninger i vævskultur hætte og forberede transfektion. Anvendelse af en vortex ved lav hastighed, omrøre transfektion opløsning under blanding. Tilføj straks den blandede opløsning til den neuronale culture, og bringe dyrkningsskålen tilbage til inkubatoren. Stop transfektion efter 45 min-1 time, og tilsæt den oprindelige vækstmedium tilbage til kulturen til kontinuerlig inkubation. De transficerede neuroner kan visualiseres fra 6 timer efter transfektion afsluttes (figur 3). I nærværelse af CMN i dyrkningsmedierne, er Pirk udtrykkes og Pirk-udtrykkende neuroner er Green Fluorescent grundet mCitrine proteinet fusioneret til C-terminalen af Pirk (figur 3D). Pirk-udtrykkende neuroner har normal basal fysiologi, og de ​​er i stand til at affyre aktionspotentialer i afhængighed af inducerede strømme (figur 4). Imidlertid er denne serie af aktionspotentialer undertrykkes straks med en kort lysimpuls skinnede til cellen (figur 4A). Når 0,5 mM BaCI2, et Kir2.1 specifik inhibitor, sættes til badet, er neuronfyring derefter genoptaget, hvilket indikerer, at den tidligere suppression skyldes aktiveringen af Kir2.1 af light (figur 4B). Utransficerede kontrol neuroner reagerer ikke på lys eller Ba2 + (figur 4C, D).

For at udtrykke Pirk in vivo, bør meget rene og koncentrerede DNA plasmider (2-5 ug / pi) være forberedt. Specifikke plasmider, der anvendes i disse forsøg er vist i figur 5A. Ud over den ortogonale tRNA Leu CUA / CmnRS pair og målet Kir2.1-TAG-genet, et gen kodende for grønt fluorescerende protein med en TAG-mutation (GFP-TAG) er også co-elektroporeret som en fluorescerende reporter. Påvisning af GFP-fluorescens ville indikere en vellykket gennemførelse af alle tre plasmider, da TAG undertrykkelse i GFP ville kræve både tRNA Leu CUA og CmnRS; CMN inkorporering i GFP-TAG vil foreslå CMN inkorporering i Kir2.1-TAGas godt, fordi begge gener er til stede i den samme celle. De tre genkonstruktioner er alle InjeCTED i den laterale ventrikel i musefostre på E14.5 (figur 5B, venstre panel). Efter elektroporering, returnere embryoner til bughulen for at tillade embryonerne at fortsætte udviklingen. To dage senere injiceres omkring 2-5 pi CMN-Ala (500 mM) til den elektroporerede side eller på begge sider af den laterale ventrikel, på lignende måde som DNA injektion (figur 5B, midterste panel). Igen, returnere embryoner til bughulen for kontinuerlig udvikling. De embryoner kan høstes på E17.5 til billedbehandling eller elektrofysiologiske analyser. Som forventet, kun med CMN-Ala injektion grønne fluorescerende celler observeret i muse neocortex. Celler med både rød og grøn fluorescens burde have CMN inkorporeret i Kir2.1-TAG at gøre Pirk kanaler (figur 6A). Helcelle-optagelse fra den embryoniske neocorticale skive sker på samme måde som det gøres på neuronal kultur. De grønne og røde fluorescerende neuroner har nogen indadgående strøm ved neunderbalance holdepotentiale, men en kort puls af lys aktiverer hurtigt den indadgående strøm (figur 6B). Den nuværende er helt blokeret ved tilsætning Ba2 +, bekræfter, at det er genereret ved Pirk.

figur 1
Figur 1: Pirk ekspressionsplasmid sæt til neuron kultur Scheme viser eksemplarisk plasmid design for Pirk ekspression i neuronal kultur.. Top plasmid koder Kir2.1-genet (grå) med en enkelt aminosyre mutation i C169 websted under cytomegalovirus (CMV) promotor. C169 er muteret til TAG amber-stopkodon, hvor ULA CMN ville inkorporeres. Kir2.1 gen efterfølges af mCitrine genet (grøn). mCitrine er fusioneret til C-terminalen af ​​den Kir2.1-genet at visualisere Pirk udtrykkende celler. Bottom plasmid koder CmnRS (lyserød), den CMN specifikke syntetase, drevet af muse phosphoglyceratkinasepromotor-1 (mPGK) promotor. tRNA > Leu CUA (blå), den ortogonale tRNA 21, kommer også til udtryk i det samme plasmid drevet af H1-promotoren, men i modsat retning.

Figur 2
Figur 2: Rat hippocampal primær neuronal kultur Eksempler billeder viser sund rotte hippocampale neuronale kulturer.. (A) En DIC billede af neuronal kultur på 10 dage in vitro (DIV). Neuroner modnes som de forgrener dendritter og axoner. Mikroglia celler (små og runde celler uden processer) sameksistere, men ikke overvælde kulturen. (B) En forstørret DIC billede af sunde dyrkede neuroner. En sund neuron udviser buttet celle krop (soma) og udtalt dendritter / axoner. Klik her for at se en større version af dette tal.

_content "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 3
Figur 3:. Pirk ekspression i dyrkede primære neuroner DIC og fluorescens billeder af rotte hippocampale neuroner dyrket in vitro og transficeret med genkonstruktioner afbildet i figur 1 for Pirk ekspression. Når CMN ikke tilsættes i kulturen efter transfektion (A og B), er ikke grøn fluorescens detekteret fra neuronerne. Ved tilstedeværelse af CMN (1 mM) i væksten medier, transfekterede neuroner er i stand til at udtrykke fuld længde Pirk-mCitrine proteiner, hvilket viser grøn fluorescens (C og D). Klik her for at se en større version af dette tal.

.jpg "/>
Figur 4:. Let aktivering af Pirk undertrykker skud fra rotte hippocampale neuroner (A) En enkelt lysimpuls undertrykker aktiviteten af hippocampale neuroner udtrykker Pirk. Repræsentative spænding spor registreres kontinuerligt i strøm-klemme. Action potentiel fyring er fremkaldt af 20 pA nuværende injektion (I-trin). Lyseksponering (385 nm, 40 mW / cm2, 1 sek indikeret med pil) hurtigt og fuldstændigt undertrykker neuronal fyring. Brændingen er restaureret med ekstracellulær 500 mM BaCI2, som selektivt hæmmer Kir2.1 kanaler. (B) Ultraviolet (UV) lys (385 nm, 40 mW / cm2, 6 sek angivet med gult felt) ændrer ikke ophidselse af kontrol, utransficerede neuroner. Action potentiel fyring er fremkaldt af 50 pA nuværende injektion (I-trin). (C og D) Hverken UV-belysning eller BaCI2 (500 mM) påvirker excitabilitet af kontrol- neuroner. Action potentIAL er fremkaldt af 50 pA nuværende injektion (I-trin).

Figur 5
Figur 5: Procedurer for Pirk udtryk i mus neocortex in vivo. (A) Pirk ekspressionsplasmid indstillet. Top plasmid: plasmidet for CmnRS drevet af CAG-promotoren og mCherry via intern ribosom entry site (IRES). mCherry fluorescens ville kontrollere vellykket udtryk for CmnRS. Mellemøsten plasmid: plasmidet til Kir2.1 gen kombineret med tre kopier af tRNA Leu CUA, den ortogonale tRNA for CMN inkorporering 21. Nederst plasmid: plasmidet for GFP_Y182 TAG. Genet for GFP er konstrueret med en amber-stopkodon ved den permissive Tyr182 stedet (GFP_Y182 TAG) for at visualisere vellykket inkorporering af CMN til TAG sites 21. (B) Cartoon shofløj en eksperimentel procedure for Pirk udtryk in vivo. Genkonstruktioner til Pirk ekspression injiceres i musen neocortex (E14.5) og elektroporeret i livmoderen (venstre panel). To dage senere, er CMN-Ala injiceret til ventriklen i den elektroporerede side eller begge sider af cerebrale hemisfærer (midterste panel). Skive billeddannelse og elektrofysiologisk assay kan udføres på E17.5-E18.5 (højre panel).

Figur 6
Figur 6: Pirk ekspression i muse neocortex og lys aktivering. (A) Fluorescens billeder af mus embryonale kortikale neuroner viser inkorporeringen af CMN i GFP og Kir2.1 proteiner in vivo. De tre genkonstruktioner i figur 5A elektroporeres i livmoderen. mCherry fluorescens demonstrerer vellykket udtryk for CMN specifikke synthetase gen, CmnRS. GFP-fluorescens detekteres kun med CMN-Ala injektion (nederst), der angiver CMN indbygning i GFP TAG og sandsynligvis CMN indbygning i Kir2.1 TAG. , Grøn og rød fluorescens indikerer således vellykket ekspression af alle tre plasmider og CMN inkorporering. (B) IV plot af strømme optaget fra mus neocorticale neuroner viser lys-afhængig aktivering af Pirk. To dage efter genkonstruktioner i figur 5A blev elektroporeret blev CMN-Ala injiceret i livmoderen; 12-48 timer efter CMN-Ala injektion blev neocortical akutte skiver fremstillet ud fra embryonerne. Pirk-udtrykkende neuroner i de skiver, der detekteres af både rød og grøn fluorescens, registreres før (sort) og efter (blå) lyseksponering (385 nm, 8 mW / cm2, 10 sekunder ved mættet eksponering). BaCI2 (500 mM) sættes til verificere Pirk-specifikke strømme efter fotoaktivering (orange).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå en effektiv foto-modulation, det vigtige første skridt er at beslutte, hvor at indarbejde photoresponsive ULA i målproteinet. Strukturel og funktionel information af target protein er meget nyttigt at vejlede valg af kandidat sites. Samtidig ville formålet med lysregulering bestemme hvilket websted er mest egnet. Når du har valgt kandidat sites, anbefaler vi at teste de steder i mammale cellelinjer, såsom humane embryonale Kidney (HEK) celler til lettere kultur og manipulation, før du fortsætter til primære neuroner og in vivo. For at identificere et site for Kir2.1 fotoaktivering, har flere steder langs pore i Kir2.1 oprindeligt testet i HEK celler. C169 af Kir2.1 blev fundet optimal, fordi den Kir2.1 porestørrelse hvor C169 bor er stor nok til at rumme CMN sidekæder men lille nok til CMN sidekæder til at blokere ionisk passage. Når CMN blev inkorporeret i C169 i Kir2.1 udtrykt i HEK-celler, than dannede mutante Kir2.1 var inaktiv, men blev aktiveret ved en kort pule af lys, der bekræfter Pirk udvikling 21.

Effektiv ekspression af den ortogonale tRNA og syntetase er kritisk for at opnå høj UAA inkorporeringseffektivitet i celler og in vivo. Den ortogonale synthetase-genet udtrykt effektivt ved anvendelse polymerase II-promotor og poly-A-signaler anvendes ofte i mammale celler og neuroner. Til ekspression af den ortogonale tRNA, en særlig type-3 polymerase III-promotor, såsom H1 anvendte promotor her, sammen med en 3'-flankerende sekvens er nødvendig som tidligere 18,20 beskrevet. Til in vivo undersøgelser, fandt vi, at tre kopier af tRNA ekspressionskassetten øget CMN inkorporeringseffektivitet sammenlignet med en kopi (figur 5A). I en anden undersøgelse i pattedyrceller, øge antallet af tRNA ekspressionskassetten også steget UAA inkorporeringseffektiviteten 30. Therør, foreslår vi at optimere antallet af tRNA ekspressionskassetter til forskellige Uaas, celler og målproteiner når ULA iblanding effektivitet skal forbedres. Biotilgængelighed af Uaas i celler og in vivo er en anden afgørende faktor for ULA inkorporering. Tidligere undersøgelser har vist, at forestring af Uaas øger deres optagelse i pattedyrceller 31, og at fremstillingen af Uaas i dipeptidform øger UAA optagelse i celler i Caenorhabditis elegans 32. Vi fandt, at direkte fodring CMN til neuronal dyrkningsmedier er tilstrækkelig for CMN indbygning i Kir2.1 udtrykt i dyrkede primære neuroner, men utilstrækkelig til indbygning i musen hjernen in vivo 21. Derfor blev dipeptidet CMN-Ala syntetiseret og injiceret i mus hjernen. Oligopeptid transportør PEPT2 er stærkt udtrykt i gnaverhjerner 33, der kan lette transporten af dipeptid i neuroner. Den internaliserede DIPEptide ville blive hydrolyseret af cellulære peptidaser at give ULA CMN til indbygning. Faktisk med denne optimering vi opnået effektiv CMN inkorporering i neuronale proteiner på flere områder af den embryoniske musehjerne, herunder neocortex, thalamus og hypothalamus 21.

Vellykket Pirk udtryk i neuroner afhænger stærkt af forberedelsen af ​​sunde neuronal kultur. Hvert trin i protokollen skal udføres på en præcis og omhyggelig måde. Efter fremstilling kultur, er det bedst at opretholde kulturen i inkubatoren uden forstyrrelser. Åbning og lukning af inkubatoren dør, såvel som at flytte dyrkningsskålen ind og ud af inkubatoren, kan tilføje op til at underminere kvaliteten af ​​kulturen. Lavere inkubator temperatur (35 ° C i stedet for 37 ° C) hjælper med at reducere excitotoksicitet. På en lignende bemærkning, bør Ca-P transfektion ske med ekstra forsigtighed. Fremstilling af 2x BBS-buffer er et kritisk trin. Det er en god idé til Calibrate den optimale pH for 2x BBS-buffer mellem pH 6,90-7,15, da nye DNA-konstruktioner eller preps kunne ændre transfektionsbetingelser. Den pH kan modificeres med præcision til de 0,01 cifre, hvis det bidrager til at opnå ensartede resultater. Før transfektion, er vækstmediet af neuronal kultur erstattet med frisk én. Det er afgørende at gemme den oprindelige vækstmedium, og tilføj tilbage til kulturen efter transfektion for at genoprette den oprindelige tilstand. Fastholdelse neuron kultur i frisk medium efter transfektion ville forstyrre neuroner i at inddrive, da det mangler vigtige molekyler til celleproliferation såsom vækstfaktorer, der frigives fra neuroner.

For let aktivering af Pirk i dyrkede celler og væv skiver, ordentlig lyskilde og levering metode skal bestemmes. CMN absorberer lange og mellemstore bølge UV lys (280-400 nm). Imidlertid forlænget udsættelse for UV-lys, især til kortere bølgelængde UV-lys, ville være skadeligt for celler. Ved same tid, kunne langt-rødt lys varme op modellen forstyrrende cellerne. Derfor er en LED med en enkelt bølgelængde emission er bedst for Pirk aktivering. For CMN fotolyse, en LED med emission på 385 nm (~ 40 mW Prizmatix) blev valgt. Lysdioden er eksternt installeret i nærheden af ​​mikroskop, og en optisk fiber bruges til at levere lys nøjagtigt til neuron i fokus. For reproducerbar dataopsamling, er den optiske fiber oprettet 1 cm væk i en 45 ° vinkel fra neuron i fokus. Lys effekt ved prøven blev målt 40 mW / cm2. Det anbefales også at regelmæssigt kontrollere LED ydelse med et optisk powermeter.

Vi viser, at in utero elektroporation er en effektiv teknik til genetisk inkorporere Uaas in vivo. In utero elektroporering af plasmid-DNA'er i musen embryonale neocortex udføres som tidligere beskrevet 34, med mindre modifikationer. For at udtrykke Pirk proteiner i neonatal musehjerner, er to kirurgiske procedurer kræves (figur 5B). Det første trin er at injicere genkonstruktioner for Pirk ekspression efterfulgt af elektroporering. To dage senere, er den anden hjerne injektion udføres for at levere CMN-Ala. Det ville kræve praksis at dygtig udføre operationer uden at stresse dyrene for meget. Efter hver operation, bør dyrene passes og kontrolleres regelmæssigt gennem hele opsvinget. Tilstrækkelig og tide CMN i hjernen er afgørende for korrekt Pirk udtryk. 2-5 pi CMN-Ala (500 mM) indsprøjtes typisk til en embryonisk hjerne. Nogle gange hjælper det at injicere CMN-Ala i ventriklen på både den elektroporerede og den modsatte halvkugle, idet CMN-Ala fra den modsatte side ville diffundere til den elektroporerede side for udvidet CMN forsyning. I betragtning generel anvendelighed af i livmoderen elektroporation, kunne denne teknik anvendes ikke blot til neocorticale neuroner, men også til neuroneri andre områder af hjernen, såsom striatum, diencephalon, og lillehjernen, når elektroporation / injektionsstedet justeres for hver region. Embryonale / neonatale hjerner er meget blødere end voksne hjerner, så det ville være svært at få akut skiver for elektrofysiologi eksperimenter. Agarose indlejring hjælper med at stabilisere den embryonale hjerne struktur for vibratome skæring. Selv lavt smeltepunkt agarose minimerer temperatur chok for hjernevæv, er der behov for forsigtighed, når hælde smeltet agarose i kolde hjerner. Virkningen af ​​temperatur chok for væv fra agarose indlejring var unnoticeable under hele celle optagelsen.

Genetisk koder photoresponsive Uaas i dyrkede neuroner og in vivo, eksemplificeret ved Pirk her, vil give en optogenetic teknik til at styre forskellige neuronale protein aktiviteter med lys i deres oprindelige miljø. Den nuværende protokol præsenterer en trin-for-trin procedure til at udføre Pirk udtryk og aktivering eksperimenter in neuronal kultur in vitro og in gnaverhjerner in vivo, der repræsenterer den første succesfulde udvikling af ULA til brug i mammale hjerner. Det har potentiale til at gavne forskningen af ​​mange naturlige proteiner, såvel som deres implikation i sygdomme. For eksempel α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) -receptorer og N-methyl-D-aspartat (NMDA) -receptorer deler lignende transmembrane strukturer med Kir2.1 kanaler. Det vil derfor være muligt at anvende Pirk metodologi til disse ligandstyrede ionkanaler. Desuden kunne Pirk teknik også anvendes til at behandle patofysiologien af Kir2.1 relaterede genetiske sygdomme, såsom Andersens syndrom og kardial kort QT-syndrom 35,36. Ud over "blok-and-release" Cys via CMN, flere aminosyrer, såsom tyrosin, serin, lysin, glutamat, aspartat, og glycin er bur med forskellige photoreleasable gruppe 37. Således kan lignende strategier være brugd til foto-regulere disse aminosyrer i neuroner in vitro og in vivo. Endvidere kan reversibel optisk kontrol opnås med azobenzen-holdige Uaas, og sådanne Uaas er nu blevet genetisk kodet i E. coli og pattedyrceller 38,39.

Sammenfattende denne protokol udgør en generel metode til at kontrollere aktiviteten af ​​neuronale proteiner i deres oprindelige indstillinger med lys. I sammenligning med andre optogenetic metoder med opsin-familien og andre lysfølsomme proteiner eller domæner, bruger denne metode genetisk kodet lysfølsomme Uaas og ændringer kun en enkelt rest. Derfor bør den have minimal indblanding til funktionen, menneskehandel og lokalisering af målproteinet under undersøgelse. Høj site-selektivitet kan også opnås med disse genetisk kodede lys-responsive Uaas at give større fleksibilitet og specificitet for detaljeret molekylær undersøgelse. Denne protokol giver også den første comprehensive, nem at følge proceduren, hvordan man med succes integrere Uaas i proteiner i neuroner in vitro og in vivo. Optisk kontrollere de almindelige proteiner via genetisk kodet Uaas i neuroner in vitro og in vivo har et stort potentiale til gavn for både grundlæggende og translationel videnskab, og denne protokol ville bidrage til at fremme dens anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm Carolina Biologicals 633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysine Corning Discovery Labware 354210
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769
Iris Spatula-curved Fine Science Tool 10092-12
Dissecting Knife - Fine Angled Tip Fine Science Tool 10056-12
GlutaMAX-I Supplement Life Technologies 35050-061
MITO+ Serum Extender BD Biosciences 355006
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning Life Sciences 352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) Sigma-Aldrich B6420
LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 Prizmatix Ltd.
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega V2111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
  2. Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
  3. Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
  4. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  5. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
  6. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  8. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  9. Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
  10. Szobota, S., Isacoff, E. Y. Optical control of neuronal activity. Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
  13. Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
  14. Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
  15. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
  16. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  17. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).
  18. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
  19. Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
  20. Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  21. Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
  22. Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
  23. Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
  24. Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  26. Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  27. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  28. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
  29. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  30. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  31. Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
  32. Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
  33. Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
  34. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  35. Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
  36. Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
  37. Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
  38. Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  39. Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).

Tags

Neuroscience naturlig aminosyre genetiske kode rav undertrykkelse ionkanal optogenetics lys-aktivering optisk kontrol photocage neuron neuronal aktivitet hjerne
Optisk kontrol af en neuronal protein under anvendelse af en genetisk indkodede naturlig aminosyre i neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. … More

Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J. Vis. Exp. (109), e53818, doi:10.3791/53818 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter