Introduction
Vergeleken met conventionele elektrische stimulatie, fotostimulering biedt meer temporele en ruimtelijke resolutie met een minimum aan interferentie met de fysiologische systeem van specimens. Sinds de demonstratie van het gebruik van lasers om neuronen te stimuleren in 1971 1, zijn veel creatieve manieren bedacht om exogeen controle neuronale activiteit met licht. Optische afgifte van photocaged agonisten is lange tijd gebruikt om fysiologische respons van het neuronale netwerk liganden 2,3,4 bestuderen. Deze techniek heeft een beperkte specificiteit door diffusie van gekooide agonisten. Genetische specificiteit wordt bereikt door ectopisch tot expressie lichtgevoelige opsin kanalen en pompen 5,6,7, en is met succes toegepast op geselecteerde neuronale netwerken in verschillende modelorganismen moduleren. Toch zou het moeilijk zijn om deze methode toe te passen optisch controleren van bepaalde neuronale eiwitten, aangezien enten photoresponsiveness van opsin eiwitten aan andere eiwitten would intense techniek die de natuurlijke eigenschappen van het eiwit kunnen veranderen bestudeerd vereisen. Chemisch tethering een exogene fotogevoelige ligand een eiwit is een andere manier om de functionaliteit van kanaalproteïnen 8,9,10 controle aangetoond. Het ligand wordt gepresenteerd of de bindingsplaats van het eiwit onttrokken door de foto-isomerisatie van het azobenzeen groep. Tethering chemie beperkt de toepassing voornamelijk aan de extracellulaire zijde van membraaneiwitten, exclusief de intracellulaire kant en intracellulaire eiwitten.
Licht aansprekend Uaas, na te zijn opgenomen in eiwitten, zorgen voor een algemene strategie om eiwitten te manipuleren met licht. In het begin van de inspanningen, tRNA chemisch geacyleerd met photocaged Uaas werden micro-injectie in Xenopus oöcyten om de Uaas nemen in membraan receptoren en ion kanalen 11, die aan het inzicht in de structuur-functie relaties 12,13,14.Deze micro-injectie aanpak is vooral beperkt tot grote eicellen. Genetische incorporatie van een UAA omzeilt de technisch uitdagende tRNA acylering en micro-injectie met behulp van een orthogonaal tRNA / synthetase paar, waarin de UAA verwerkt door middel van endogene eiwit vertaling in levende cellen 15,16,17,18. UAA incorporatie in neuronale eiwitten is aangetoond in primaire neuronen en neurale stamcellen 19,20. Recenter licht aansprekend UAA genetisch is opgenomen in een neuronaal eiwit in de hersenen van zoogdieren in vivo voor het eerst 21. Deze ontwikkelingen maken het mogelijk om neuronale eiwitten met Uaas bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving.
Binnenwaarts rectificatie kaliumkanaal kir2.1 is een sterke gelijkrichter die K + stromen gemakkelijker overgaat in dan uit de cel, en het is essentieel bij het reguleren van fysiologische processen zoals mobiele exciteerbaarheid, vaattonus, hartslag, renal zout stroom en insuline vrij te geven 22. Overexpressie van kir2.1 hyperpolariseert de membraanpotentiaal van de doelwit neuron, minder prikkelbaar 23,24 wordt. Optisch kir2.1 beheersen zijn natieve cellen, Kang et al. Genetisch opgenomen een fotogevoelig UAA in kir2.1 expressie in zoogdierlijke cellen, neuronen en embryonale muizenhersenen 21. Een korte lichtpuls kon de UAA zetten in een natuurlijk aminozuur Cys, waardoor het activeren van het doelwit eiwit kir2.1. Toen deze foto-induceerbare innerlijk rectificeren kalium (Pirk) kanaal eiwit werd uitgedrukt in de rat hippocampus primaire neuronen, is onderdrukt neuronale afvuren in reactie op licht activering. Bovendien werd de Pirk kanaal tot expressie gebracht in embryonale muis neocortex, en het licht-geactiveerde Pirk stroom in corticale neuronen werd gemeten. De succesvolle implementatie van de OCG technologie in vivo in de hersenen van zoogdieren opent de deur naar optisch controle neuronale eiwittenin hun natieve omgeving, waardoor optische dissectie van neuronale processen en mechanismen op moleculair niveau mogelijk te maken.
In dit protocol beschrijven we de procedures voor genetische incorporatie van Uaas in primaire neuronen in cultuur en in de embryonale muizenhersenen in vivo. Het licht aansprekend UAA Cmn en kir2.1 worden gebruikt om het proces te illustreren. Methoden om succesvolle UAA integratie en optische controle van neuronale eiwit activiteit zijn voorzien te beoordelen. Dit protocol geeft een duidelijke leidraad genetisch coderen Uaas in neuronen en in vivo, en optisch reguleren neuronale eiwitfunctie via een op licht aansprekend UAA. We verwachten dat dit protocol bij de vaststelling van de in vivo OCG-technologie voor neurowetenschappen en optogenetic biologische studies vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures in de huidige studie werd uitgevoerd met behulp van Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurde protocollen voor de behandeling van dieren bij het Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA.
1. UAA Integratie in kir2.1 en expressie van de resulterende Pirk in het primaire neuronale Cultuur
- DNA Construction
- Selecteer een target site van kir2.1 voor UAA oprichting. Exploiteren voorkennis en gegevens over de structuur en functie van kir2.1, zodat de gekozen locatie met licht aansprekend UAA maakt Incorporated optische modulatie van kir2.1 functie 21.
- Construeren van een recombinant DNA dat codeert kir2.1 gen de gekozen locatie gemuteerd TAG amber stopcodon. Gebruik het standaard kloneringstechnieken 25 de kir2.1 TAG-DNA te kloneren in een zoogdierlijk expressieplasmide.
- Clone tRNA / synthetase genen die specifiek zijn voor de UAA zijn en nemen de UAA in reactie ophet TAG stopcodon in andere zoogdierlijke expressieplasmide 21.
Opmerking: Voor een optimale UAA opname kunnen verschillende promoters en combinaties van gen cassettes (voor tRNA synthetase, en kir2.1) worden getest in verschillende plasmiden. - Het verkrijgen van hoge kwaliteit plasmide DNA's met behulp van miniprep of Maxiprep commerciële kits volgens het protocol van de fabrikant. Ongeveer 1,9 van de 260/280-verhouding optimaal is voor het gezuiverde DNA. Indien nodig, voer een agarosegelelektroforese zuiverheid van het geprepareerde DNA 25 controleren. Gedraaide dubbele helix plasmide DNA's met een hoge zuiverheid zijn het beste voor neuronale transfectie.
- Cultuur Rat hippocampus primaire neuronen
- Plaats dekglaasjes (cirkels, 12 mm in diameter) in 24-well platen, een dekglaasje aan elk putje en smeer elk putje met 250 pl 0,5 mg / ml poly-D-lysine (in 100 mM boraat buffer: 1,24 g boorzuur zuur en 1,90 g natriumtetraboraat in 400 ml gedeïoniseerd gedestilleerd H 2 O of DDH 2
- Op de dag van dissectie, het verzamelen van neonatale hersenen van postnatale ratten (1-4 postnatale dag) na hen verlamming met isofluraan, en onthoofden. Verdoven de pups in een verdoving kamer met isofluraan (2-4%). Wachten tot ze het bewustzijn verliezen en niet reageren op tactiele stimuli en knijpen van de poten.
- Met de standaardtechniek 26, ontleden hippocampus van de hersenen in warm (~ 37 ° C) zoutoplossing (10 mM HEPES en 20 mM D-glucose toegevoegd in gebalanceerde zoutoplossing Hank's), en verzamel hippocampus in een conische buis met 4,5 ml warme zoutoplossing .
- Voeg 500 ul van 2,5% trypsine aan de hippocampus (0,25% trypsine uiteindelijke concentratie) en incubeer gedurende 10 min in een waterbad bij 37 ° C.
- Reinig het weefsel met een zoutoplossing (3 x 10 ml) en vermaal spoel.
- Recover de los neuronen in 1 ml warm groeimedia bevattende Minimum Essential Medium (MEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 21,2 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 2% B-27, en 0,1% serum extender.
Opmerking: Voeg L-glutamine en B-27 op de dag van dissectie verse groeimedia bereiden. - Tel de neuronen met een hemocytometer en plaat ze op dekglaasjes in platen met 24 putjes bij 1,0-1,5 x 10 5 cellen / putje dichtheid met 500 ul groeimedium na gefiltreerd door een 40 pm nylon mesh.
- Incubeer de neuronale kweek bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 2-3 weken. Voor het beste resultaat, vermijd de cultuur zoveel mogelijk storen tijdens incubatie.
- Calciumfosfaat (Ca-P) Transfectie van primaire neuronale Cultuur
- Maak voorraadoplossingen en bewaar bij 4 ° C: 0,5 M BES (N, N-bis [2-hydroxyethyl] -2-aminoethaansulfonzuur) -buffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); steriele DDH 2 O; steriel 1 N NaOH.
- Op de dag van transfectie maken verse 2,5 M CaCl 2-oplossing in DDH 2 O en steriel filter met 0,22 urn filter. Maak verse 2x BES-gebufferde zoutoplossing (BBS) buffer die 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, en 280 mM NaCl bij pH 7,00 (aan te passen pH met NaOH) en steriel filter met 0,22 pm filter.
Opmerking: Bereken de hoeveelheid CaCl 2-oplossing en BBS buffer afhankelijk van het aantal dekglaasjes te transfecteren. Kijk ook op 1.3.4. - Vervang de cultuur groei media met 500 ul vers voorverwarmde transfectie groeimedia. (Transfectie media kunnen worden gemaakt met MEM plus 21,2 mM D-glucose).
Opmerking: de oude media niet weg. - Bereken de hoeveelheid DDH 2 O en bereid voegen teneinde de transfectie-oplossing (33 gl per elk dekglaasje) met 1,65 gl CaCl2, 0,7 ug DNA en 16,5 & maak# 181; l 2x BBS.
- Bereid de transfectie oplossing onmiddellijk alvorens het aan de kweek. Ter voorbereiding, voor het eerst te combineren CaCl2 en DDH 2 O, terwijl langzaam schudden van de buis. Verder roeren en voeg langzaam DNA in de oplossing. Ten slotte, voeg 2x BBS buffer druppelsgewijs onder roeren.
- Voeg onmiddellijk 30 ul van de transfectie oplossing in elk dekglaasje van neuronale kweek.
- Schommel de kweekschaal een paar keer om de oplossing te mengen en incuberen bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 45 minuten 1 uur. Na neuronen geïncubeerd met de transfectieoplossing, zou zeer fijne precipitaten Ca-P een laag te vormen die neuronen.
- Vervang de transfectie media met 500 ul voorverwarmde wasbuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM glucose bij pH 7,3, steriel gefiltreerd met 0,22 urn filter) en incubeer bij 356, C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 15-20 min. Ca-P neerslagen zou verdwijnen na het wassen stap.
- Vervang de wasbuffer met 500 ul vers groeimedium. Nogmaals, vervang dan de groei van media met de opgeslagen originele media.
- Voeg de UAA Cmn (vooraf gemengd in 50 ul warm groei media) om de cultuur tot 1 mM uiteindelijke concentratie te bereiken.
- Incubeer de getransfecteerde kweek bij 35 ° C in een 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator gedurende 12-48 uur voor assays.
- Hele Cell Opnemen met Light Activation
- Bereid extra / intracellulaire oplossingen. De intracellulaire oplossing bevat 135 mM kaliumgluconaat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP en 0,3 mM GTP Li 2 bij pH 7,4. De extracellulaire oplossing bevat 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2, 5 mM glucose en 10 mM HEPES bij pH 7,4.
- Installeer een light-emitting diode (LED) met een emissie van 385 nm door de microscoop op het tuig aan het licht te leveren aan het brandpunt van 1 cm afstand in een hoek van 45 °. Controleer de kracht van de LED met een lichte power meter.
- Trek patch pipetten van glas elektrodes met behulp van een commercieel micropipet puller tot 3-6 MQ pipet weerstand. Volg de instructies van de fabrikant voor het opzetten van de micropipet trekker.
- Om pipet weerstand te testen, eerst de pipet met de intracellulaire oplossing vullen en plaats het op de elektrode houder. Dompel de pipet in een 35 mm kweekschaal gevuld met de extracellulaire oplossing, die op de microscoop platform. Dompel een aardelektrode in de schaal om een circuit te sluiten.
- Zet de versterker / digitizer en start een data-acquisitie software. Monitor pipet weerstand met een membraan testprotocol.
- Neem een dekglaasje van het neuron cultuur uit de incubator en een keer spoelen in de extracellulaire oplossing. Met behulp van vacuüm vet, houdt u de dekglaasje in het midden van een 35 mm cultuur schotel gevuld met de verse extracellulaire oplossing.
- Plaats het dekglaasje / schotel op de elektrofysiologie microscoop platform.
- Met behulp van de standaard patch klemmen technieken, patch een neuron met mCitrine fluorescentie 27. Record neuronale activiteit met stroomtang (I-clamp) methode. Ten eerste, pas dan de rustpotentiaal tot ongeveer -72 mV door het injecteren van een kleine stroom. Dan injecteren een stap stroom (10-200 Pa) om continu branden (15/05 Hz) van actiepotentialen te induceren.
- Handmatig of met behulp van de data-acquisitie software, knipperen een puls (a single puls van 100 msec -1 sec duur) van de LED-licht om de neuron tijdens de opname, en kijk of actiepotentialen worden beïnvloed.
- Voeg 0,5 mM BaCl2 aan het bad en controleer of actiepotentialen worden teruggewonnen.
2. UAA Opneming in kir2.1 en expressie van de resulterende Pirk in de muis embryonale Brain In Vivo
- DNA Construction
- Ontwerp het plasmide-DNA eveneens als in stap 1,1. Voor in vivo expressie, gebruik een sterke promotor zoals CAG (kippen beta-actine promoter van CMV enhancer).
- Zuiver DNA met een endotoxine-vrij maxiprep commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. Uitvoeren fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie 25 extreem hoge kwaliteit DNA (gecondenseerd tot 2,5 ug / ul) verwerven.
- In Utero Elektroporatie van de muis embryonale Neocortex
Opmerking: De basis Technique in utero elektroporatie is eerder 28 beschreven.- Verdoven een getimede zwangere muis op embryonale dag 14,5 (E14.5) met natrium pentobarbital (intraperitoneale injectie, 50 ug per gram lichaamsgewicht) of isofluraan (inhalatie, 2-4%). Monitor verdoving diepte door het controleren van het verlies van bewustzijn en geen reactie op tactiele stimuli en knijpen van de poten.
- Maak een kleine snede in de buik middellijn. Voorzichtig bloot de baarmoeder hoorns met een tang en vingertoppen.
- Injecteer ongeveer 1 ui DNA-oplossing (2,5 ug / ul van elk plasmide, afhankelijk van het construct) in de laterale ventrikel van elk hetzelfde nest met een glazen pipet ingebracht door de baarmoederwand. In de meeste gevallen, ongeveer 60-80% van embryo's geïnjecteerd.
- Electroporate de embryo's met een electroporator (33-35 V, 50 msec, 950 msec interval 4-8 pulsen).
- Zet de baarmoeder hoorns naar de buikholte zachtjes vooreekhoorntjesbrood en vingertoppen. Hecht de spierwand en de huid met chirurgische hechtdraad om het embryo te blijven ontwikkelen.
- UAA Micro-injectie
- Maak een kleine snede in de buik middellijn opnieuw bij E16.5, en voorzichtig bloot de baarmoeder hoorns met een tang en vingertoppen.
- Injecteer ongeveer 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) aan de geëlektroporeerde zijde of beide zijden van het laterale ventrikel met een glazen pipet ingebracht door de baarmoederwand. CMN biologische beschikbaarheid te verhogen, gebruik maken van de dipeptide Cmn-Ala (CMN-alanine) CMN te leveren in vivo 21.
- Nogmaals, de terugkeer van de baarmoeder hoorns naar de buikholte voorzichtig met een pincet en vingertoppen. Hecht de spierwand en de huid met chirurgische hechtdraad om het embryo te blijven ontwikkelen.
- Verkrijgen Acute Brain Slices
- Voeg 1 L kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bevattende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCh
- Neem 200 ml ACSF en snel invriezen bij -80 ° C gedurende 20-30 min. Bel de rest van ACSF met 5% CO2: 95% O2 gas bij kamertemperatuur.
- Bereid en steriliseer de operatie-instrumenten om de hersenen van de embryo's te oogsten. Ook bereiden een emmer ijs.
- Voeg ~ 100 ml 4% laag smeltpunt agarose oplossing in een kolf door verwarmen in een magnetron. Afkoelen oplossing gedurende 5 minuten voordat het begint te stollen.
- Euthanaseren de muis 12-24 uur na Cmn-Ala injectie van CO 2 overdosis. Maak grote incisies in de buikstreek en ontleden de geëlektroporeerde / micro-injectie embryo's uit de baarmoeder met een fijne schaar en pincet.
- Harvest hersenen van de embryo's met een fijne schaar en pincet.
- Plaats elke hersenen op een 10 cm cultuur schotel geplaatst op het ijs emmer. Verdeel twee hersenhelften met een scherp mes, en leg elkehemisfeer op de schaal met het sagittale vlak raakt de bodem van de schaal. Snel giet de agarose oplossing over hersenen (ongeveer 500 pl per halfrond).
- Met behulp van een scherp mes, vierkant snijd de agarose rond een brein naar een brain ingebed agarose blok te maken.
- Met behulp van weefsel lijm, lijm langs de sagittale vlak oppervlak van de agar blok op een mount voor vibratome. Vul het vibratome kamer met pre-gekoelde ACSF en snijd 200 pm sagittale hersenen plakjes.
- Incubeer acute segmenten in ACSF aangevuld met 3 mM myo-inositol, 0,4 mM ascorbinezuur en 2 mM natriumpyruvaat bij 33 ° C gedurende 42 minuten onder doorborrelen met 5% CO2: 95% O2 gas.
- Na 42 min, zet de verwarming en blijven de schijfjes bij kamertemperatuur incuberen met borrelen. Start whole-cell patch opname minstens 15 minuten na het uitschakelen van de kachel.
- Voeg 1 L kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bevattende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,3 mM MgCl2, 2,5 mM CaCh
- Hele Cell Opnemen met Light Activation
- Bereid de Intracellular oplossing die 130 mM kaliumgluconaat, 4 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na2 ATP, 10 mM natrium- creatinefosfaat en 0,1 mM Na 3 GTP bij pH 7,3 ingesteld met KOH.
- Trek patch pipetten van glas elektrodes met behulp van een commercieel micropipet puller tot 3-6 MQ pipet weerstand.
- Stel de slice elektrofysiologie rig voor whole-cell patch klem- en superfuse de opname kamer met ACSF bij 2 ml / min rate met een perfusie pomp. Stel de kamertemperatuur tot ongeveer 33 ° C.
Opmerking: De plak elektrofysiologie rig is voorzien van een perfusie kamer, een water immersie objectief en een temperatuurregelaar. Ook GFP filter (excitatie: 480/30 nm, emissie: 535/40 nm) en mCherry filter (excitatie: 580/20 nm emissie: 675/130 nm) zijn verplicht.- Installeer een LED met emissie van 385 nm door de microscoop op het tuig aan het licht te leveren aan het brandpunt van 1 cm afstand op een 45 °hoek. Controleer de kracht van de LED met een lichte power meter.
- pick-up zorgvuldig hersenen slice met een glazen pipet en plaats in de perfusie kamer. Houd het schijfje met een harp.
- Patch een neuron met mCherry / GFP fluorescentie van de neocortical regio 27. Record Pirk activiteit met voltage clamp (V-klem) methode. Ten eerste, houd de membraanpotentiaal bij -60 mV. Vervolgens opnemen stromen op vaste negatieve membraan potentials (-100 mV) of spanning opritten (-100 mV tot 40 mV). In het bijzonder, te monitoren kir2.1 specifiek naar binnen stromen bij -100 mV.
- Handmatig of met behulp van de data-acquisitie software, knipperen een puls (een enkele puls van 100 msec -1 sec duur) van LED-licht om de neuron tijdens de opname, en kijk of Pirk eiwitten worden geactiveerd. Zodra Pirk geactiveerd, zou binnenwaartse stromingen -100 mV aanzienlijk toenemen.
- Voeg 0,5 mM BaCl2 aan het bad en controleer of Pirk weer wordt geïnactiveerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een UAA genetisch te nemen in een eiwit in neuronen, de eerste belangrijke stap is om het ontwerpen van de juiste gen constructen te leveren en efficiënt genen tot expressie in neuronen. Er zijn drie genetische componenten UAA inschrijving: (1) het doelgen de TAG amber stopcodon geïntroduceerd op de gekozen locatie voor UAA opname (2) een orthogonaal tRNA om de gemuteerde TAG stopcodon herkent en (3) een orthogonale aminoacyl -tRNA synthetase de UAA rekenen op de orthogonale tRNA. Elk stuk moet worden aangedreven door de geschikte promotor. Deze drie gencassettes kunnen in een plasmide of gescheiden in verschillende plasmiden. Om Pirk in neuronen uit te drukken, wordt de foto-reactieve UAA Cmn opgenomen in kir2.1 met behulp van de orthogonale tRNA Leu CUA / CmnRS (CMN-tRNA synthetase) paar geëvolueerd specifiek te zijn voor Cmn 21,29. Residu Cys169 van kir2.1 gen gemuteerd is naar de TAG amber stopcodon (Kir2.1-TAG), en het fluorescerende eiwit mCitrine is gefuseerd aan de C-terminus van kir2.1 Pirk tot expressie in neuronale kweek zichtbaar (figuur 1).
Het verkrijgen van goede kwaliteit neuronale cultuur is een voorwaarde voor een succesvolle Pirk experimenten. Postnatale dag 1-4 Sprague Dawley ratten worden over het algemeen gebruikt voor de neuronale cultuur voorbereiding, maar toch rat embryo's worden ook vaak gebruikt. Wanneer uitgeplaat op dekglaasjes in platen met 24 putjes bij 1,0-1,5 x 10 5 cellen / putje dichtheid moet men goed gescheiden gezonde neuronen met niet teveel microglia of ander vuil (figuur 2A) zien. Gezonde neuronen hebben uitgebreide processen en cellichamen (soma) zijn mollige (Figuur 2B). Onmiskenbaar zichtbaar suborganelle structuur is meestal een teken van ongezonde cultuur. Neuronale kweek kan worden gehandhaafd gedurende 2-3 weken bij 35 ° C in 5% CO2: 95% lucht bevochtigde incubator.
Calcium fosfaat (Ca-P) transfectie is een zeer zachte transfectie methode geschikt voor de gevoelige neuronale cultuur. Echter, het vereist uiterste precisie en voorzichtigheid te hoge transfectie-efficiëntie te bereiken in neuronen. De oplossingen worden bewaard bij 4 ° C, en gemengd tot 2 x BBS buffer verdienen op de dag van transfectie. Precieze aanpassing van de pH is de sleutel tot reproduceerbaar krijgen succesvolle resultaten. De 2,5 M CaCl2 oplossing moet ook vers op de dag van de transfectie worden. Alle buffers moeten worden gefilterd. Bovendien verse DNA plasmiden met hoge zuiverheid en kwaliteit van de resultaten te verbeteren. Voor het beste resultaat kan men verkrijgen verse DNA mini-prepped van niet overwoekerd Escherichia coli cultuur (~ 12 uur bij 37 ° C in het schudden incubator). Nadat alle buffers klaar zijn, brengen de oplossingen in de weefselkweek kap en voor te bereiden voor transfectie. Met behulp van een vortex met een lage snelheid, schud de transfectie oplossing onder mengen. voeg de gemengde oplossing onmiddellijk naar de neuronale culture, en breng de cultuur schotel naar de incubator. Stop de transfectie na 45 min-1 uur, en voeg de originele groeimedia terug naar de cultuur voor continue incubatie. De getransfecteerde neuronen kan worden gevisualiseerd door 6 uur na transfectie wordt beëindigd (figuur 3). In aanwezigheid van Cmn in de kweekmedia wordt Pirk expressie en Pirk expressie neuronen groen-fluorescerend vanwege de mCitrine eiwit gefuseerd aan de C-terminus van Pirk (Figuur 3D). -Pirk expressie neuronen normale basale fysiologie en ze kunnen vuren actiepotentialen in antwoord op de geïnjecteerde stromen (figuur 4). Maar deze reeks actiepotentialen onmiddellijk onderdrukt met een korte lichtpuls scheen de cellen (Figuur 4A). Bij 0,5 mM BaCl2, een kir2.1 specifieke remmer wordt toegevoegd aan het bad, wordt neuronale hervat, wat aangeeft dat de vorige onderdrukking veroorzaakt door de activatie van kir2.1 de lechts (Figuur 4B). Ongetransfecteerde control neuronen reageren niet op licht of Ba2 + (Figuur 4C, D).
Om Pirk in vivo uit te drukken, moeten zeer zuiver en geconcentreerd DNA plasmiden (2-5 ug / ul) worden voorbereid. Specifieke plasmiden die in deze experimenten worden getoond in figuur 5A. Naast het orthogonale tRNA Leu CUA / CmnRS paar en het doel kir2.1 TAG-gen, een gen dat codeert voor groen fluorescent eiwit met een TAG mutatie (GFP-TAG) is co-elektroporatie als fluorescerende reporter. Detectie van GFP fluorescentie zou de succesvolle oplevering van alle drie de plasmiden te geven, aangezien TAG onderdrukking in GFP beide zou vereisen het tRNA Leu CUA en de CmnRS; CMN incorporatie in GFP-TAG zou suggereren CMN incorporatie in kir2.1-Tagas goed, omdat beide genen die aanwezig zijn in dezelfde cel zijn. De drie genconstructen zijn allemaal Injected in de laterale ventrikel van muizenembryo's op E14.5 (Figuur 5B, linkerpaneel). Na elektroporatie terug het embryo naar de buikholte om de embryo's te blijven ontwikkelen. Twee dagen later, injecteren ongeveer 2-5 ul Cmn-Ala (500 mM) aan de geëlektroporeerde zijde of beide zijden van de laterale ventrikel, op soortgelijke wijze als DNA injectie (Figuur 5B, middelste paneel). Nogmaals, de terugkeer van de embryo's naar de buikholte voor de continue ontwikkeling. De embryo's kunnen worden geoogst op E17.5 voor imaging of elektrofysiologische assays. Zoals verwacht, alleen Cmn Ala-injectie, groen fluorescerende cellen worden waargenomen in de muis neocortex. Cellen met zowel rode en groene fluorescentie moeten Cmn opgenomen in kir2.1-TAG naar Pirk kanalen (figuur 6A) te maken. Whole-cell opname van de embryonale neocortical slice wordt uitgevoerd op soortgelijke wijze als het wordt gedaan op de neuronale cultuur. De groene en rode fluorescerende neuronen hebben geen innerlijke stroom bij negatieve met potentieel, maar een korte lichtpuls snel de innerlijke stroom (figuur 6B) activeert. De stroom wordt volledig geblokkeerd door toevoegen Ba2 +, bevestigt dat wordt gegenereerd door Pirk.
Figuur 1: Pirk expressieplasmide set voor neuron cultuur Scheme toont voorbeeldige plasmide ontwerp voor Pirk expressie in neuronale cultuur.. Top plasmide codeert kir2.1 gen (grijs) met een enkele aminozuur mutatie in C169 site onder cytomegalovirus (CMV) promoter. C169 is gemuteerd naar de TAG amber stopcodon, waar de UAA Cmn zou worden opgenomen. Kir2.1 gen volgt mCitrine gen (groen). mCitrine is gefuseerd aan het C-uiteinde van het gen kir2.1 Pirk expressie brengende cellen zichtbaar. Bottom plasmide codeert CmnRS (roze), de Cmn specifieke synthetase, gedreven door de muis fosfoglyceraatkinase-1 (mPGK) promotor. tRNA
Figuur 2: Rat hippocampus primaire neuronale cultuur Voorbeeldige foto's laten zien gezonde rat hippocampus neuronale culturen.. (A) Een DIC beeld van neuronale kweek op 10 dagen in vitro (DIV). Neuronen vervallen als ze vertakken dendrieten en axonen. Microglia cellen (klein en rond cellen zonder processen) naast elkaar bestaan, maar niet de cultuur niet overweldigen. (B) Een vergrote DIC beeld van gezonde gekweekte neuronen. Een gezonde neuron vertoont mollige cellichaam (soma) en uitgesproken dendrieten / axonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Pirk expressie in gekweekte primaire neuronen DIC en fluorescentiebeelden van rat hippocampale neuronen in vitro gekweekt en getransfecteerd met genconstructen weergegeven in figuur 1 voor Pirk expressie. Wanneer Cmn niet in de kweek wordt toegevoegd na transfectie (A en B), is geen groene fluorescentie gedetecteerd van de neuronen. In de aanwezigheid van Cmn (1 mM) in de groei media, getransfecteerde neuronen in staat zijn volledige lengte tot expressie Pirk-mCitrine eiwitten, daarmee aangevend groene fluorescentie (C en D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
.jpg "/>
Figuur 4:. Licht activering van Pirk onderdrukt het afvuren van de rat hippocampale neuronen (A) Een enkele lichtpuls onderdrukt activiteit van de hippocampus neuron uiten van Pirk. Representatieve voltage sporen worden continu geregistreerd in de huidige-klem. Actiepotentiaal afvuren wordt opgeroepen door 20 pA stroom injectie (I-stap). Blootstelling aan licht (385 nm, 40 mW / cm 2, 1 sec, aangegeven met pijl) snel en volledig onderdrukt neuronale afvuren. Firing is gerestaureerd met extracellulaire 500 mM BaCl2, die selectief remt kir2.1 kanalen. (B) Ultraviolet (UV) belichting (385 nm, 40 mW / cm 2, 6 seconden, aangeduid met gele box) neemt niet weg prikkelbaarheid van controle getransfecteerde neuronen. Actiepotentiaal afvuren wordt opgeroepen door 50 pA stroom injectie (I-stap). (C en D) Geen UV belichting of BaCl2 (500 mM) beïnvloedt prikkelbaarheid van neuronen controle. actie potential wordt opgeroepen door 50 pA stroom injectie (I-stap).
Figuur 5: Procedure voor Pirk expressie bij muizen in vivo neocortex. (A) Pirk expressieplasmide stellen. Top plasmide: het plasmide voor CmnRS gedreven door de CAG promotor en mCherry via interne ribosoom ingang website (IRES). mCherry fluorescentie zou succesvol uitdrukking van CmnRS controleren. Midden-plasmide: het plasmide voor kir2.1 gen in combinatie met drie exemplaren van tRNA Leu CUA, de orthogonale tRNA voor Cmn incorporatie 21. Bottom plasmide: het plasmide voor GFP_Y182 TAG. Het gen voor GFP is ontworpen met een amber stopcodon op de tolerante Tyr182 website (GFP_Y182 TAG) voor een succesvolle integratie van Cmn visualiseren naar sites 21 tag. (B) sho Cartoonvleugel een experimentele procedure voor Pirk expressie in vivo. Genconstructen voor Pirk expressie worden geïnjecteerd in de muis neocortex (E14.5) en geëlektroporeerd in utero (linker paneel). Twee dagen later, Cmn-Ala geïnjecteerd naar het ventrikel van de geëlektroporeerde of beide zijden van cerebrale hemisferen (middelste paneel). Slice beeldvorming en elektrofysiologische test kan worden uitgevoerd op E17.5-E18.5 (rechter paneel).
Figuur 6: Pirk uitdrukking in de muis neocortex en lichte activering. (A) Fluorescentie afbeeldingen muis embryonale corticale neuronen die de opname van Cmn in GFP en kir2.1 eiwitten in vivo. De drie genconstructen in figuur 5A worden geëlektroporeerd in utero. mCherry fluorescentie toont succesvolle expressie van het Cmn specifieke synthetase gen, CmnRS. GFP-fluorescentie wordt gedetecteerd alleen Cmn-Ala injectie (onder), wat aangeeft Cmn oprichting in GFP TAG en waarschijnlijk Cmn inbouw in kir2.1 TAG. Aldus groene en rode fluorescentie geeft een succesvolle expressie van de drie plasmiden en Cmn opname. (B) IV plot van de stromen opgenomen van muizen neocortical neuronen waaruit licht-afhankelijke activering van Pirk. Twee dagen na genconstructen in figuur 5A werden geëlektroporeerd werd Cmn-Ala geïnjecteerd in utero; 12-48 uur na Cmn Ala-injectie werden neocortical acute plakjes bereid uit het embryo. Pirk-expressie neuronen in de plakjes gedetecteerd door zowel rode als groene fluorescentie wordt gemeten vóór (zwart) en na (blauw) blootstelling aan licht (385 nm, 8 mW / cm2, 10 seconden voor verzadigd blootstelling). BaCl2 (500 mM) toegevoegd aan Pirk specifieke stromen verifiëren na fotoactivatie (oranje).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om effectief foto-modulatie te bereiken, de belangrijke eerste stap is om te beslissen waar het licht aansprekend UAA te nemen in het doelwit eiwit. Structurele en functionele informatie van het doeleiwit is zeer nuttig om de selectie van kandidaatsites leiden. Tegelijkertijd zou het doel van lichtregeling bepalen welke site het meest geschikt. Na het kiezen van de kandidaat-sites, raden wij aan om de sites in zoogdiercellijnen zoals de humane embryonale nier (HEK) cellen voor gemakkelijker cultuur en manipulatie, te testen alvorens over te gaan tot de primaire neuronen en in vivo. Om een site voor kir2.1 fotoactivatie identificeren meerdere plaatsen langs de porie van kir2.1 zijn eerst getest in HEK cellen. C169 van kir2.1 werd optimaal gevonden, omdat de kir2.1 poriegrootte waarbij C169 woont is groot genoeg om Cmn zijketens tegemoet maar klein genoeg voor Cmn zijketens ionische doorgang te blokkeren. Wanneer Cmn bij C169 werd opgericht in kir2.1 uitgedrukt in HEK cellen, tde daaruit voortkomende mutant kir2.1 inactief was maar werd geactiveerd bij een korte Pule van licht bevestigt succesvolle Pirk ontwikkeling 21.
Efficiënte expressie van het orthogonale tRNA synthetase en is kritisch voor hoge UAA opnamedoelmatigheid verkrijgen in cellen en in vivo. De orthogonale synthetase gen efficiënt uitgedrukt in polymerase II promoter en poly-A signalen vaak gebruikt in zoogdiercellen en neuronen. Voor expressie van het orthogonale tRNA, een speciaal type 3-polymerase-III-promotor, zoals de promotor H1 hier gebruikt, tezamen met een 3'-flankerende sequentie nodig zijn zoals eerder beschreven 18,20. Voor in vivo studies, vonden we dat drie exemplaren van het tRNA expressiecassette verhoogd Cmn incorporatie efficiëntie in vergelijking met één exemplaar (figuur 5A). In een ander onderzoek bij zoogdiercellen, waardoor het aantal tRNA expressiecassette toegenomen UAA opnamedoelmatigheid 30. Therefore, raden we het optimaliseren van het aantal tRNA expressiecassettes voor verschillende Uaas, cellen en doeleiwitten bij OCG incorporatie efficiëntie moet worden verbeterd. Biobeschikbaarheid van Uaas in cellen en in vivo is een andere cruciale factor voor UAA oprichting. Eerdere studies hebben aangetoond dat verestering van Uaas verhoogt hun opname in zoogdiercellen 31, en dat preparaat van Uaas in het dipeptide vorm verhoogt UAA opname in cellen in Caenorhabditis elegans 32. We vonden dat direct voeden CMN neuronale cultuur media is voldoende voor Cmn bijmenging in kir2.1 uitgedrukt in gekweekte primaire neuronen, maar onvoldoende voor verwerking in de hersenen van muizen in vivo 21. Daarom is de dipeptide Cmn-Ala werd bereid en geïnjecteerd in de hersenen van muizen. Oligopeptide transporter PEPT2 wordt sterk tot expressie in hersenen van knaagdieren 33, waarbij het transport van het dipeptide tot neuronen kan vergemakkelijken. De geïnternaliseerde dipeptide zou worden gehydrolyseerd door cellulaire peptidasen aan de UAA Cmn leveren voor opname. Inderdaad, met deze optimalisatie we bereikt efficiënt Cmn incorporatie in neuronale eiwitten op verschillende gebieden van de embryonale muizenhersenen, waaronder neocortex, thalamus en hypothalamus 21.
Succesvolle Pirk expressie in neuronen hangt sterk af van de voorbereiding van een gezonde neuronale cultuur. Elke stap in het protocol moet worden uitgevoerd op een nauwkeurige en zorgvuldige manier. Na cultuur voorbereiding, is het het beste om de cultuur in de couveuse te handhaven zonder verstoring. Het openen en sluiten van de deur incubator, en bewegen van de kweekschaal in en uit de incubator, kan oplopen tot ondermijning van de kwaliteit van de cultuur. Lagere temperatuur incubator (35 ° C in plaats van 37 ° C) vermindert excitotoxiciteit. Op een soortgelijke opmerking, moet Ca-P transfectie gedaan worden met extra voorzichtigheid. Bereiding van 2 x BBS buffer is een kritische stap. Het is een goed idee naar CaliBrate de optimale pH voor 2x BBS buffer tussen pH 6,90-7,15, omdat nieuwe DNA-constructen of preps transfectie omstandigheden kunnen veranderen. De pH kan worden ingesteld met precisie de 0,01 cijfers als het helpt om consistente resultaten. Voor transfectie, wordt de groeimedia van neuronale kweek vervangen door nieuwe. Het is cruciaal om de oorspronkelijke groeimedia slaan en weer toevoegen aan de kweek na transfectie de oorspronkelijke toestand te herstellen. Handhaven neuron cultuur in vers medium na transfectie zouden verstoren neuronen navordert, aangezien het niet sleutelfactoren voor celproliferatie zoals groeifactoren vrijgegeven van neuronen.
Voor lichte activering van Pirk in gekweekte cellen en weefsels plakjes, een goede lichtbron en levering methode moeten worden bepaald. CMN absorbeert lange en middengolf UV-lampen (280-400 nm). Echter, langdurige blootstelling aan UV-licht, vooral kortere golflengte UV licht zou schadelijk cellen. Aan het same tijd, ver-rood licht kon opwarmen het monster verstoren de cellen. Daarom is een LED met een golflengte emissie beste voor Pirk activering. Voor Cmn fotolyse, een LED met een emissie van 385 nm (~ 40 mW; Prizmatix) werd geselecteerd. De LED wordt extern geplaatst in de buurt van de microscoop en een optische vezel wordt gebruikt om het licht precies te leveren aan de neuron in focus. Voor reproduceerbare data-acquisitie, is de optische vezel opgezet 1 cm afstand in een hoek van 45 ° van het neuron in focus. Lichte spanning op het monster werd gemeten 40 mW / cm 2. Het is ook aan te raden om regelmatig te controleren of de LED-prestaties met een optisch vermogen meter.
We laten zien dat in utero elektroporatie is een effectieve techniek om genetisch Uaas nemen in vivo. In utero elektroporatie plasmide DNA in de muis embryonale neocortex wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven 34 met kleine modificaties. Om Pirk eiwitten in neonata uitdrukkenl muizenhersenen zijn twee chirurgische procedures vereist (Figuur 5B). De eerste stap is genconstructen injecteren Pirk expressie gevolgd door elektroporatie. Twee dagen later, wordt de tweede hersenen injectie uitgevoerd om Cmn-Ala te leveren. Het zou de praktijk nodig hebben om bekwaam operaties uit te voeren zonder dat de nadruk van de dieren te veel. Na elke operatie, moeten de dieren worden verzorgd en gecontroleerd op een regelmatige basis in de gehele herstel. Tijdig voldoende beschikbaarheid van Cmn in de hersenen is essentieel voor een goede Pirk expressie. 2-5 pl Cmn-Ala (500 mM) wordt typisch geïnjecteerd om een embryonale hersenen. Soms helpt Cmn-Ala injecteren in het ventrikel zowel de geëlektroporeerd en de tegenoverliggende hersenhelft, aangezien Cmn-Ala vanaf de andere kant zou diffunderen naar de geëlektroporeerde kant voor langere Cmn leveren. Gezien algemene bruikbaarheid van in utero elektroporatie, kan deze techniek worden toegepast niet alleen op neocortical neuronen maar ook neuronenin andere gebieden van de hersenen, zoals striatum, diencephalon en cerebellum, wanneer elektroporatie / injectieplaats wordt aangepast voor elke regio. Embryonale / neonatale hersenen zijn veel zachter dan volwassen hersenen, dus het zou moeilijk zijn om acute plakjes te krijgen voor elektrofysiologie experimenten. Agarose inbedding helpt bij het stabiliseren van de embryonale hersenstructuur voor vibratome snijden. Hoewel laag smeltpunt agarose minimaliseert temperatuur schok voor hersenweefsel, is voorzichtigheid geboden bij het gieten agarose smolt dan koud hersenen. Het effect van temperatuurschok het weefsel van agarose inbedding was niet merkbaar gedurende de gehele cel opname.
Genetisch coderend licht aansprekend Uaas in gekweekte neuronen en in vivo, geïllustreerd door Pirk hier, zal zich veroorloven een optogenetic techniek om verschillende neuronale eiwit activiteiten te controleren met licht in hun eigen omgeving. Het huidige protocol bevat een stap-voor-stap procedure Pirk expressie en activeringsexperimenten i voerenn neuronale cultuur in vitro en in knaagdieren hersenen in vivo, die de eerste succesvolle ontwikkeling van de UAA voor gebruik in zoogdierlijke hersenen. Het heeft potentieel aan voordeelonderzoek van vele natuurlijke proteïnen, en hun betrokkenheid bij ziekten. Bijvoorbeeld α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptoren en N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptoren hebben dezelfde transmembraan structuren kir2.1 kanalen. Het zou daarom mogelijk zijn om Pirk methodologie van toepassing op deze ligand-gated ionkanalen. Bovendien kan Pirk techniek ook worden gebruikt om de pathofysiologie van kir2.1 gerelateerde genetische ziekten, zoals het syndroom van Andersen en cardiale korte QT syndroom 35,36 pakken. Naast "block-and-release" Cys via Cmn, verschillende aminozuren zoals tyrosine, serine, lysine, glutamaat, aspartaat en glycine werden gehuisvest met verschillende groepen photoreleasable 37. Aldus kunnen vergelijkbare strategieën gebruikd afbeelding reguleren deze aminozuren in neuronen in vitro en in vivo. Bovendien kunnen omkeerbare optische controle worden bereikt met azobenzeen-bevattende Uaas en dergelijke Uaas zijn nu genetisch gecodeerd in E. coli en zoogdiercellen 38,39.
Kortom, dit protocol geeft een algemene werkwijze om de activiteit van neuronale eiwitten regelen in hun eigen instellingen met licht. In vergelijking met andere werkwijzen die optogenetic opsin familie en andere lichtgevoelige eiwitten of domeinen, gebruikt deze methode genetisch gecodeerde lichtgevoelige Uaas en verandert slechts één residu. Daarom moet het minimale interferentie met de functie, de handel en de lokalisatie van het doelwit eiwit onder studie hebben. Hoge plaatsspecifieke selectiviteit kan worden bereikt met deze genetisch gecodeerde licht reagerende Uaas meer flexibiliteit en specificiteit voor gedetailleerde moleculaire onderzoek verricht. Dit protocol voorziet ook in de eerste comprehensive, makkelijk te volgen procedure hoe succesvol integreren Uaas in eiwitten in neuronen in vitro en in vivo. Optische controle van de algemene eiwitten via genetisch gecodeerde Uaas in neuronen in vitro en in vivo heeft een groot potentieel om te profiteren van zowel fundamenteel en translationeel wetenschap, en dit protocol zou helpen de toepassing ervan te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm | Carolina Biologicals | 633029 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine | Corning Discovery Labware | 354210 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Iris Spatula-curved | Fine Science Tool | 10092-12 | |
| Dissecting Knife - Fine Angled Tip | Fine Science Tool | 10056-12 | |
| GlutaMAX-I Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
| MITO+ Serum Extender | BD Biosciences | 355006 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning Life Sciences | 352340 | |
| BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine) | Sigma-Aldrich | B6420 | |
| LED LIGHT SOURCE – Black LED 385 | Prizmatix Ltd. | ||
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega | V2111 |
References
- Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
- Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).
- Cambridge, S. B., et al. Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems. Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Volgraf, M., et al. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).
- Szobota, S., Isacoff, E. Y.
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis. Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).
- Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).
- Tong, Y., et al. Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel. J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).
- Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G.
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Wang, W., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).
- Kang, J. Y., et al. In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids. Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).
- Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).
- Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons. Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).
- Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. Inducible genetic suppression of neuronal excitability. J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Beaudoin, G. M. III, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
- Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
- Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells. Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).
- Parrish, A. R., et al. Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs. ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).
- Lu, H., Klaassen, C. Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents. Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Plaster, N. M., et al. Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome. Cell. 105 (4), 511-519 (2001).
- Priori, S. G., et al. A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene. Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).
- Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function. Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).
- Hoppmann, C., et al. Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
- Hoppmann, C., et al. In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light. J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).
